兩種新復(fù)合型CYP21A2突變致單純男性化型21羥化酶缺陷癥

王曉黎，張楠，趙玉巖，史曉光，單忠艷

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)1.附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，內(nèi)分泌研究所，遼寧省內(nèi)分泌疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，沈陽110001）

兩種新復(fù)合型CYP21A2突變致單純男性化型21羥化酶缺陷癥

王曉黎1，張楠2，趙玉巖1，史曉光1，單忠艷1

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)1.附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，內(nèi)分泌研究所，遼寧省內(nèi)分泌疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，沈陽110001）

目的分析2例單純男性化型21羥化酶缺陷癥（21-OHD）患者的臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查和遺傳學(xué)資料。方法通過患者臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查及影像學(xué)資料確診，對(duì)CYP21A2基因直接測(cè)序的方法尋找致病突變位點(diǎn)。應(yīng)用在線蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)新突變的功能。結(jié)果2例患者均為單純男性化型21OHD，激素測(cè)定提示ACTH、醛固酮、睪酮、雄烯二酮等明顯高于正常水平；雙側(cè)腎上腺增生?；驕y(cè)序發(fā)現(xiàn)，CYP21A2基因在一例為復(fù)合型純和突變（H62L和V69L），另1例為復(fù)合型雜合突變（I2g和10InsL）。在國(guó)內(nèi)該兩種復(fù)合型突變尚未見報(bào)道。V69L為中國(guó)人中特有的突變，在線蛋白質(zhì)功能預(yù)測(cè)軟件提示其極有可能損害蛋白質(zhì)功能。結(jié)論在CYP21A2基因上發(fā)現(xiàn)的兩種復(fù)合型雜合性突變可能與單純男性化型21OHD的發(fā)生有關(guān)。

21-羥化酶缺陷癥；CYP21A2基因；基因突變

先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥（congenital adrenal hyperplasia，CAH）最為常見的原因是21-羥化酶缺陷癥（21-hydroxylase deficiency，21-OHD）［1］。21-OHD分為經(jīng)典型和非經(jīng)典型（noclassical，NC），經(jīng)典型又包括失鹽型（salt-wasting，SW）和單純男性化型（simple-virilizing，SV）［1］。CYP21A2基因突變可導(dǎo)致不同程度的21-羥化酶的失活，從而使臨床表現(xiàn)各異，通常21-羥化酶完全失活會(huì)導(dǎo)致SW型，殘存不到2%的酶活性會(huì)導(dǎo)致SV型，殘存10%～75%的酶活性則表現(xiàn)為臨床表現(xiàn)輕微的NC型［1］。本文介紹2例表現(xiàn)為嚴(yán)重SV型的女患及其攜帶的CYP21A2基因突變，其中1例為復(fù)合型純和突變（H62L和V69L），另1例為復(fù)合型雜合突變（I2g和10InsL）。兩種復(fù)合型突變類型在國(guó)內(nèi)均未見報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 病史摘要

病例1：女，15歲，以“出生時(shí)發(fā)現(xiàn)外生殖器發(fā)育異常，毛發(fā)增多、痤瘡8年余”為主訴入院。患者于8年前無明顯誘因出現(xiàn)毛發(fā)增多，表現(xiàn)為唇周少許胡須生長(zhǎng)，陰毛生長(zhǎng)，四肢及后背部汗毛加重，面部、四肢及軀干部痤瘡生長(zhǎng)，陰蒂輕微肥厚，肌肉發(fā)達(dá)，體力佳，智力與周圍同齡兒無差異，身高增長(zhǎng)快速，高于其他同齡兒，未在意，未系統(tǒng)診治。3年前無明顯誘因出現(xiàn)生長(zhǎng)停止，自覺痤瘡加重，毛發(fā)生長(zhǎng)濃密，表現(xiàn)為唇周及下頜部胡須生長(zhǎng)濃密，腋毛及陰毛生長(zhǎng)濃密，陰毛呈菱形分布，陰蒂生長(zhǎng)，變肥大。2年前月經(jīng)初潮，行經(jīng)2 d，經(jīng)血量少，經(jīng)血顏色正常，此后再無月經(jīng)來潮，乳房無明顯發(fā)育，多毛及痤瘡逐漸加重。為明確診治而入院，病來無發(fā)熱，無頭痛、頭暈，有怕熱、多汗，易煩躁，無惡心、嘔吐，無腹痛、腹瀉，精神狀態(tài)良好，飲食及睡眠可，二便正常。既往史：否認(rèn)高血壓、糖尿病、冠心病病史。

查體：體溫：36.5動(dòng)℃，脈搏：80次/min，呼吸：18次/min，血壓120/80 mmHg，身高145 cm，體質(zhì)量50 kg，體重指數(shù)23.8 kg/m2，腰圍77 cm，臀圍87 cm，WHR 0.89。指間距147 cm，上部量69 cm，下部量76 cm。毛發(fā)增多，發(fā)髻線低，無滿月臉及多血質(zhì)面容，可見喉結(jié)，顏面、四肢及軀干部可見皮膚痤瘡，毛囊角化，唇周及下頜部胡須生長(zhǎng)濃密及腋毛生長(zhǎng)濃密，無頸蹼、肘外翻，雙乳腺無明顯發(fā)育。雙肺呼吸音清，未聞及啰音，心率80次/min、律齊，未聞及病理性雜音。左側(cè)上臂內(nèi)側(cè)及雙腿內(nèi)側(cè)可見紫紋，腹軟，無壓痛，肝脾肋下未觸及，雙下肢無浮腫，陰毛濃密、呈男性分布，可見陰蒂肥大呈陰莖狀，尿道口與陰道口重疊。

病例2：女，26歲，以“閉經(jīng)多毛約10年，血壓升高3年?！敝髟V入院?；颊呒s10年前青春期開始發(fā)育時(shí)出現(xiàn)體毛增多，以下頜部、下腹部為主，乳房略發(fā)育，未來月經(jīng)至今。當(dāng)時(shí)身高150 cm，體質(zhì)量70 kg，約7～8年前身高停止生長(zhǎng)，體質(zhì)量逐漸增加，智力發(fā)育正常。曾就診其他醫(yī)院，口服達(dá)英35人工月經(jīng)治療4周期，未來月經(jīng)，未見乳房發(fā)育、毛發(fā)脫落、分泌物增多等癥狀。后自行停藥，曾于當(dāng)?shù)蒯t(yī)院口服雌激素及中藥治療，效果不明顯。3年前體檢時(shí)發(fā)現(xiàn)血壓升高，最高160/100 mmHg，未服藥控制血壓。今為查明原發(fā)性閉經(jīng)及高血壓原因就診于我院?；颊卟頍o明顯誘因偶有心悸癥狀，可自行緩解，無周期性乏力、軟癱，無面部潮紅大汗，無頭暈頭痛?；颊甙l(fā)病來飲食睡眠可，精神狀態(tài)可，二便正常，體質(zhì)量無明顯改變。既往史：既往體健。否認(rèn)冠心病、糖尿病等慢性病史，否認(rèn)乙肝、結(jié)核等傳染性疾病史，否認(rèn)藥物過敏史。

查體：體溫：37.3℃，脈搏：84次/min，呼吸：15次/min，血壓：140/90 mmHg。身高1.5 m，體質(zhì)量80 kg，體重批量數(shù)35.56 kg/m2，腰圍101 cm，臀圍108 cm，WHR 0.94。上部量81 cm、下部量70 cm、指間寬149 cm。面色紅潤(rùn)，無痤瘡，上額發(fā)跡退后不明顯呈男性化表現(xiàn)，眼瞼無浮腫，唇上及下頜部有胡須分布。頸部及腋下黒棘皮表現(xiàn)，四肢體毛濃密，皮膚有角化毛囊，無通貫掌，無手趾腳趾缺如，無鏡像運(yùn)動(dòng)，掌指短小。前胸后背可見少量體毛，乳暈周圍有體毛分布，腋窩部可見腋毛正常分布，下腹部可見大量粗硬毳毛，無紫紋及瘀斑，腹軟，無壓痛、反跳痛及肌緊張，肝脾肋下未觸及，肝腎區(qū)無叩痛，雙下肢無水腫。陰毛濃密呈菱形分布。外生殖器發(fā)育正常，陰蒂不大。

1.2 檢測(cè)方法

肝腎功能、血電解質(zhì)等以全自動(dòng)生化儀測(cè)定；并作口服葡萄糖耐量試驗(yàn)、胰島素釋放試驗(yàn)、2 mg地塞米松抑制試驗(yàn)。LH、FSH、催乳素、雌二醇、孕酮、睪酮、脫氫表雄酮及雄烯二酮采用化學(xué)發(fā)光法測(cè)定，ACTH采用免疫放射法測(cè)定。血腎素、血管緊張索、醛固酮（基礎(chǔ)和立位激發(fā)）、胰島素及皮質(zhì)醇等采用放射免疫法測(cè)定。

1.3 基因組DNA提取

使用血液基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技北京有限公司）提取基因組DNA，取血液樣品300 μL，在樣品中加入2.5倍體積的細(xì)胞裂解液，顛倒混勻，10 000 r/min離心1 min，棄上清；向沉淀中加入20 μL Proteinase K溶液，200 μL核酸提取液，充分顛倒混勻，56℃放置10 min；加200 μL無水乙醇，充分顛倒混勻并將其加入吸附柱中12 000 r/min離心30 s；向吸附柱中加入500 μL緩沖液12 000 r/min離心30 s，向吸附柱中加入600 μL漂洗液，12 000 r/min離心30 s，滴加40 μL雙蒸水溶解DNA。檢測(cè)基因缺失：所需引物CYP21A2-1/CYP21A2-2（表1），反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2.5 min，95℃變性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。用TaqⅠ限制性內(nèi)切酶（購(gòu)自寶生物工程大連有限公司）消化［2］，反應(yīng)體系及條件：TaqⅠ1 μL，10×TaqⅠBasal Buffer 2 μL，0.1%BSA 2 μL，PCR產(chǎn)物10 μL，加雙蒸水至20 μL。65℃水浴3 h。正常個(gè)體會(huì)發(fā)現(xiàn)210 bp和187 bp帶強(qiáng)度相等，如果缺失單條CYP21A2基因，210 bp較187 bp帶強(qiáng)度下降，如果兩條基因都缺失則只能檢測(cè)到187 bp條帶。PCR反應(yīng)體系及條件：引物根據(jù)GeneBankCYP21A2基因序列設(shè)計(jì)特異性引物分別為P1P2，P3P4（表1）擴(kuò)增兩個(gè)相互重疊的CYP21A2基因片段（引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成）。反應(yīng)液的構(gòu)成：dNTP 0.2mmol/L，10 x Buffer 2.5 μL，引物各40 pmol/L，8 UTaQ聚合酶（寶生物工程大連有限公司），模板200 ng，加雙蒸水至50 μL。以P1、P2為引物PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2.5 min，95℃變性1 min，65℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。以P3、P4為引物PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性2.5 min，95℃變性1 min，59℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。

1.4 測(cè)序

對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化（天根生化科技北京有限公司瓊脂糖凝膠回收試劑盒）再由北京六合華大基因科技股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序引物為PCR擴(kuò)增引物P1～P4以及測(cè)序引物P5、P6（表1）。

表1 PCR引物及其堿基序列Tab.1 Primer sequences used in PCR

1.5 在線軟件預(yù)測(cè)突變的功能

應(yīng)用了5個(gè)在線蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)軟件：PolyPhen，SIFT，Align-GVGD，SNAP和PMut（http：//www. gen2phen.org/wiki/protein-level-predictions-1-pathogenic-or-not-predictors#Programs）對(duì)突變位點(diǎn)進(jìn)行分析，各軟件具體功能及結(jié)果判斷方式請(qǐng)參見表3中網(wǎng)址內(nèi)容。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)室檢查

病例1：輔助檢查見表2。雙側(cè)腎上腺CT：雙側(cè)腎上腺?gòu)浡栽龃?，考慮腎上腺增生（圖1A）。子宮附件彩超：子宮前傾位，宮體大小約3.4 cm×2.6 cm×1.9 cm，子宮發(fā)育略小。染色體核型分析：46，XX。

病例2：輔助檢查見表2。大小地塞米松試驗(yàn)示皮質(zhì)醇分泌明顯抑制，抑制率均大于50%。染色體核型分析：46，XX。腎上腺CT：雙側(cè)腎上腺?gòu)浡栽龃郑▓D1B）。垂體MRI未見異常。

圖1 病例腎上腺平掃CT和增強(qiáng)CTFig.1 Adrenal unenhanced and enhanced computed tomography

2.2CYP21A2基因分析及測(cè)序結(jié)果

通過應(yīng)用TaqⅠ限制性內(nèi)切酶消化基因片段，兩名患者均未發(fā)現(xiàn)CYP21A2基因缺失。CYP21A2基因在病例1為復(fù)合型純和突變（圖2，H62L和V69L），病例2為復(fù)合型雜合突變（圖3，I2g和10InsL）。在國(guó)內(nèi)該2種復(fù)合型突變尚未見報(bào)道。V69L突變?cè)趪?guó)外尚未見報(bào)道。

圖2 病例1的CYP21A2基因測(cè)序結(jié)果與正常人對(duì)比Fig.2 Direct sequencing result of CYP21A2of case 1

2.3 在線蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)軟件結(jié)果

應(yīng)用5個(gè)蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)軟件（PolyPhen，SIFT，Align-GVGD，SNAP和PMut）預(yù)測(cè)CYP21A2基因的新發(fā)突變V69L，其中2個(gè)軟件提示該突變很有可能影響到該基因編碼的蛋白質(zhì)的功能，另外3個(gè)則提示可能性較小。同時(shí)分析了已知致病突變H62L作為對(duì)照。結(jié)果見表3。

表2 2例患者的實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果Tab.2 Laboratory examination results of the two cases

3 討論

21-OHD的SW型因21-羥化酶活性完全缺乏，病情較重，多在幼年夭折，而SV型的21-羥化酶殘存部分活性，病情較輕，患者就診時(shí)間較晚，本文介紹的2例SV型21-OHD即為最近在我院內(nèi)分泌科就診的年輕女性，臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查支持該診斷，進(jìn)一步行基因?qū)W診斷明確了突變類型，2例均為復(fù)合型突變，復(fù)合突變的組合類型尚未見報(bào)道，其中H62L在國(guó)內(nèi)尚未見報(bào)道，V69L僅在中國(guó)人中曾見報(bào)道。外顯子1中H62殘基位于β-1平面區(qū)域，CYP21A2編碼蛋白的54-63號(hào)氨基酸構(gòu)成了一個(gè)重要的功能性疏水區(qū)域，可防止蛋白質(zhì)殘端通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)［3］，當(dāng)組氨酸被亮氨酸取代后，蛋白質(zhì)的透過度增加，從而會(huì)影響到酶的功能。H62L突變可以使21-羥化酶活性降低至21%～44%（分別用孕酮和17OHP為底物時(shí)）［4］，通常會(huì)導(dǎo)致NC型21-OHD，當(dāng)有其他突變合并存在時(shí)，會(huì)使21-羥化酶活性進(jìn)一步下降至2%～4%，導(dǎo)致SV型21-OHD［4］。國(guó)外曾報(bào)道H62L與多種突變復(fù)合存在時(shí)會(huì)導(dǎo)致SV型21-OHD［5］，國(guó)內(nèi)尚未見報(bào)道過在21-OHD患者中發(fā)現(xiàn)H62L突變，H62L與其它突變同時(shí)存在的情況也是首次發(fā)現(xiàn)。病例1的位于外顯子2的另一個(gè)突變V69L在國(guó)外尚未見報(bào)道，HGMD數(shù)據(jù)庫中尚無資料（www.hgmd. org），但在國(guó)內(nèi)協(xié)和醫(yī)院曾提及在NC型21-OHD患者中發(fā)現(xiàn)此突變（尚未正式發(fā)表，來源于2012年中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十一次全國(guó)內(nèi)分泌學(xué)術(shù)會(huì)議），可能是中國(guó)人特有的突變。通過在線預(yù)測(cè)軟件分析（in silicoanalysis），polyphen軟件預(yù)測(cè)得分是0.971，很可能會(huì)影響蛋白質(zhì)的功能，但SIFT軟件預(yù)測(cè)為可耐受，有研究表明此兩種預(yù)測(cè)軟件對(duì)于類固醇代謝相關(guān)基因中的突變功能預(yù)測(cè)比較一致，但polyphen更優(yōu)于SIFT［6］。此突變需要進(jìn)一步體外研究證實(shí)其功能。病例2中的I2g剪切性突變是最為常見的8個(gè)21-OHD致病突變之一（P30L，I2g，E3Δ 8bp，I172N，E6，V281L，Q318X，R356W）［1］，在各型21-OHD中都可存在，純合性突變與SW型相關(guān)，雜合性突變則與SV型和NC型相關(guān)。國(guó)內(nèi)幾個(gè)中心對(duì)21-OHD患者的基因?qū)W分析顯示I2g突變?cè)趪?guó)人中發(fā)生的幾率可排在第1～2位［7～9］。該患者同時(shí)存在的外顯子1的10InsL經(jīng)研究證實(shí)為多態(tài)性，對(duì)基因的功能影響較小［10］。本研究通過對(duì)兩名臨床診斷為SV

圖3 病例2的CYP21A2基因測(cè)序結(jié)果與正常人對(duì)比Fig.3 Direct sequencing result of CYP21A2of case 2

表3 在線蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)軟件結(jié)果Tab.3 Predictive results of online protein function analyze software

型21-OHD患者進(jìn)行CYP21A2基因測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了兩種新的復(fù)合型突變，對(duì)于漢族人21-OHD的基因?qū)W病因做出了補(bǔ)充。

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（編輯 裘孝琦）

Two NovelComplex Mutations of CYP21A2Gene Causing Simple Virilizing 21-hydroxylase Deficiency

WANGXiao-li1，ZHANGNan2，ZHAOYu-yan1，SHIXiao-guang1，SHANZhong-yan1
（1.Key Laboratory of Endocrine Diseases of Liaoning Province，Department of Endocrinology and Metabolism，Institute of Endocrinology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Department of Microbiology and Parasitology，College of Basic Medical Science，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo investigate the clinical manifestations，laboratory findings and genetic characteristics of two cases with simple virilizing（SV）21-hydroxylase（21OHD）.MethodsClinicalmanifestations and laboratory data were obtained.The promoterand coding areas ofCYP21A2gene were directly sequenced.In silico analysis were used to predict the function of mutations.ResultsTwo patients presented severe virilism.The laboratory examinations showed that plasma ACTH，aldosterone，androstendione and testosterone were significantly increased compared with normal individuals.VCT scan showed hyperplasia ofbilateraladrenal.Directsequencing ofCYP21A2gene showed two complex mutations-H62L/V69LandI2g/10InsL，which were not reported previously.In silico analysis（Polyphen）showed the novel mutationV69Lcould probably damage the function ofCYP21A2 protein.ConclusionThe combined mutations，H62L/V69LandI2g/10InsL，could be associated with SV type 21-OHDphenotype.

21-hydroxylase deficiency；CYP21A2gene；gene mutation

R322.5

A

0258-4646（2014）05-0396-06

國(guó)家自然科學(xué)基金（81370189）；國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金（81200653）

王曉黎（1980-），男，副教授，博士. E-mail：wlittlepear@163.com

2014-01-16

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