納米粒子應(yīng)用于微生物檢測(cè)的研究進(jìn)展

陶珊珊, 李云霞, 趙 琨, 陳雯雯, 趙 渝

(1.上海師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 上海 200234; 2.上海師范大學(xué) 植物種質(zhì)資源開發(fā)中心,上海 200234)

近幾年來,世界范圍內(nèi)的食品安全惡性事故頻繁爆發(fā)[1],食源性疾病的爆發(fā)率大幅上升已引起了世界各地政府的關(guān)注,更給世界人民帶來了巨大的痛苦和損失.因而,如何快速、靈敏地檢測(cè)出食源性致病菌的存在已成為控制食品安全問題的關(guān)鍵.傳統(tǒng)的食源性疾病的檢測(cè)方法都要經(jīng)過分離培養(yǎng)、生化鑒定等步驟,存在操作耗時(shí)繁瑣、檢測(cè)靈敏度低和容易出現(xiàn)假陰性等缺點(diǎn)[2],在應(yīng)對(duì)突發(fā)性食品安全公共事件上,不能滿足快速、準(zhǔn)確、靈敏和特異性高等要求.近幾十年來,納米粒子技術(shù)在食源性致病菌的檢測(cè)領(lǐng)域不斷發(fā)展[3-4].本文作者主要從熒光納米粒子、磁性納米粒子等方面介紹了納米粒子在微生物致病菌快速檢測(cè)中的應(yīng)用.

1 光學(xué)納米粒子快速檢測(cè)技術(shù)

熒光納米粒子由于其具有的化學(xué)及光學(xué)特性,能產(chǎn)生較高的靈敏度,已經(jīng)被許多課題研究小組用于微生物菌劑的檢測(cè)[5-6].

1.1 金納米粒子

金納米粒子是較受歡迎的納米材料.依賴其獨(dú)特光學(xué)特性,以及在生物液體里的惰性和穩(wěn)定性使它成為納米粒子材料診斷中最常用的材料之一.金納米粒子(AuNPs)廣泛被應(yīng)用于微生物分析、檢測(cè)和識(shí)別領(lǐng)域.通過選擇合適的合成方法,可以很容易地形成不同大小和形狀的金納米粒子.AuNPs很容易被硫醇化的DNA探針和蛋白質(zhì)分子修飾[1](圖1),這一特點(diǎn)使它優(yōu)于其他類型的納米粒子.金納米粒子的另一獨(dú)特特性是呈現(xiàn)出明顯的紅色,這使診斷測(cè)驗(yàn)的敏感性增強(qiáng),可視性高.此外,金納米粒子常用于免疫層析試紙條(ICS)生物傳感器[7](圖2).

ICS已經(jīng)實(shí)現(xiàn)對(duì)傳染性病原體及毒素的快速、靈敏檢測(cè).目標(biāo)菌和金納米粒子聚合成紅色沉淀,診斷測(cè)試中,不需要任何儀器的協(xié)助,仍可很容易地看清目標(biāo)反應(yīng),在測(cè)試區(qū),檢測(cè)線為紅線,可視化很高[8].同時(shí),金納米粒子具有較高的消光系數(shù),以及在可見光中具有較寬的吸收光譜,可以克服許多傳統(tǒng)熒光素的局限性[9].Zhu研究小組開發(fā)了一個(gè)混合了金、銀2種納米粒子的局部表面等離子體共振生物傳感器,用于金黃色葡萄球菌腸毒素B檢測(cè).這種傳感器可直接檢測(cè)腸毒素B至ng/mL級(jí)別,而用于檢測(cè)腸毒素B的其他表面等離子體共振生物傳感器則需要采取擴(kuò)增的步驟來實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)靈敏度[11].

圖1 金納米粒子與硫醇化DNA分子結(jié)合原理圖[1]

圖2 免疫層析試紙條用于微生物檢測(cè)原理[10]

1.2 熒光硅納米顆粒

熒光檢測(cè)試驗(yàn)對(duì)于微生物學(xué)家并不新鮮,因?yàn)闊晒怙@微鏡和分光熒光計(jì)廣泛應(yīng)用于診斷和實(shí)驗(yàn)室研究.熒光硅納米顆粒容易被生物修飾并可通過熒光顯微鏡或分光熒光計(jì)來檢測(cè)微生物[12].摻雜二氧化硅納米粒子的染料可以用來探測(cè)生物分子,比其他熒光納米顆粒具有更高的靈敏度[13].

單個(gè)熒光二氧化硅納米粒子可保留數(shù)千染料分子,而在免疫熒光測(cè)定抗體的直接熒光標(biāo)記中只有極少數(shù)染料分子.因此,利用二氧化硅納米粒子可以提高檢測(cè)靈敏度達(dá)幾百倍.此外,相比于其他熒光納米粒子,染料中摻雜的二氧化硅納米顆粒具有光穩(wěn)定性和增強(qiáng)發(fā)光的優(yōu)點(diǎn).它們已被廣泛地用于生物分子的檢測(cè),例如asDNA、抗體、細(xì)胞等[14].

二氧化硅納米粒子可保留有機(jī)或者金屬染料,該染料可以附著在納米顆粒的表面或包含在納米粒子內(nèi)部.用于成像的納米顆粒嵌入染料分子后,可免受光的照射,表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐光性[15].納米顆?？梢院苋菀妆豢贵w或者核酸分子化學(xué)功能化和生物修飾化,經(jīng)化學(xué)修飾后的納米顆粒表面生成的氨基或羧基基團(tuán)能夠使熒光納米粒子共價(jià)連接抗體[16].包被的染料熒光納米顆粒與抗體結(jié)合后,增強(qiáng)了測(cè)定的靈敏度,使檢出限降低到單個(gè)細(xì)胞水平[17].這種檢測(cè)方法對(duì)一些苛刻性細(xì)菌或者生長比較緩慢的細(xì)菌檢測(cè)非常有利.例如結(jié)核桿菌,該菌需要很長的培育時(shí)間和特殊的培養(yǎng)條件.Qin研究組曾使用熒光二氧化硅納米顆粒靈敏地從細(xì)菌混合物及標(biāo)準(zhǔn)唾液樣品中檢測(cè)出結(jié)核分枝桿菌,結(jié)核分枝桿菌結(jié)合到A蛋白上,A蛋白被摻雜有二氧化硅納米粒子的聯(lián)吡啶釕(RuBpy)修飾[14].另外,在佛羅里達(dá)大學(xué)的Tan課題研究小組使用熒光二氧化硅納米顆粒檢測(cè)單一樣品中的多種細(xì)菌.該納米粒子包含不同濃度的染料分子,被同一波長激發(fā)后會(huì)產(chǎn)生不同的顏色.通過綴合不同細(xì)菌對(duì)應(yīng)的抗體的納米粒子能夠檢測(cè)樣品中的3種細(xì)菌,每種細(xì)菌對(duì)應(yīng)一種顏色[12].

1.3 量子點(diǎn)

在過去的20年里,半導(dǎo)體納米顆粒及量子點(diǎn)的光電子特性以及在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用備受研究者的關(guān)注,主要應(yīng)用于生物檢測(cè)[18].量子點(diǎn)是納米級(jí)的半導(dǎo)體晶體,具有獨(dú)特的光學(xué)特性,作為熒光標(biāo)記物可用于免疫分析、DNA雜交試驗(yàn)及微生物檢測(cè)[19].

大部分用于檢測(cè)細(xì)菌的光學(xué)生物傳感器是基于對(duì)有機(jī)染料或者蛋白質(zhì)熒光團(tuán)熒光排放量的測(cè)量.然而,常見的熒光團(tuán)具有較多的缺點(diǎn)[20](如微弱的耐光性和低強(qiáng)度),且不適用于多種細(xì)菌的檢測(cè).量子點(diǎn)可以克服這些限制,它們具有光穩(wěn)定性,且表現(xiàn)出高量子產(chǎn)率[21].通過改變量子點(diǎn)的尺寸和它的化學(xué)組成可以使其發(fā)射光譜覆蓋整個(gè)可見光區(qū),故可使用量子點(diǎn)同時(shí)檢測(cè)多個(gè)細(xì)菌[22].Zhao等使用連接上抗體的量子點(diǎn)與MNPS能夠同時(shí)檢測(cè)出鼠傷寒沙門氏菌、志賀氏桿菌、大腸桿菌O157:H7[23].相比傳統(tǒng)有機(jī)染料(如異硫氰酸熒光素),量子點(diǎn)可有效提高測(cè)定的靈敏度,這一優(yōu)勢(shì)通過簡(jiǎn)單的熒光測(cè)定大腸桿菌O157:H7血清型即可表現(xiàn)出才來.Liu研究小組發(fā)現(xiàn)了基于流動(dòng)室微孔免疫濾鏡的生物傳感器的發(fā)展系統(tǒng),這種傳感器以量子點(diǎn)樹枝石納米晶體作為熒光標(biāo)記[24],可用來捕捉大腸桿菌O157:H7,使用這種生物傳感器系統(tǒng),檢測(cè)限可低至2.3 CFU/mL.Abdelhamid等使用殼多糖修飾的CdS量子點(diǎn)標(biāo)記細(xì)菌進(jìn)一步用于生物成像[7].Xu等構(gòu)建了連接有量子點(diǎn)的免疫層析試紙條,用于快速檢測(cè)空腸彎曲桿菌,檢測(cè)限達(dá)到104cfu/mL,是金試紙條檢測(cè)靈敏度的10倍[25].

1.4 上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米粒子

上轉(zhuǎn)換熒光材料是在長波長的激發(fā)下,發(fā)出短波長光的一類熒光材料.它們大多屬于稀土摻雜的無機(jī)材料,如鐿、鉺共摻雜的氟化釔、氟化釔鈉、氟化鑭等.上轉(zhuǎn)換熒光納米材料在980 nm紅外光激發(fā)下,能發(fā)出不同顏色的可見光,與傳統(tǒng)的熒光物質(zhì)相比,上轉(zhuǎn)換納米熒光材料作為熒光材料探針,干擾小,具有較高的信噪比、良好的耐光以及檢測(cè)靈敏度高[26].上轉(zhuǎn)換熒光材料多用于生物熒光標(biāo)記和生物成像[27]等方面.Qu等構(gòu)建了一種上轉(zhuǎn)熒光材料免疫層析技術(shù),快速定量檢測(cè)出布魯氏菌[29].

2 磁性納米粒子用于細(xì)菌檢測(cè)

2.1 磁性分離

納米粒子由于具有較高的物理和化學(xué)穩(wěn)定性、生產(chǎn)成本低、易于生物修飾,并且使用磁鐵易于分離和濃縮細(xì)菌等優(yōu)點(diǎn)[30],故在納米醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,磁性納米顆粒的應(yīng)用已經(jīng)變得越來越廣泛.Joo小組通過連有單克隆抗體的超順磁性Fe3O4納米粒子從牛奶中分離出沙門氏菌[31].細(xì)菌復(fù)合物再連接到轉(zhuǎn)化酶,并分散在蔗糖溶劑中,通過蔗糖水解為葡萄糖與果糖,通過血糖儀來測(cè)量葡萄糖的濃度來間接測(cè)定沙門氏細(xì)菌的濃度,檢測(cè)限可達(dá)10 cfu/mL.檢測(cè)原理如圖3所示.

圖3 Fe3O4納米粒子分離沙門氏菌原理圖[31]

利用磁性納米粒子能夠從復(fù)雜的溶液體系中,捕獲和分離微生物細(xì)菌,分離出純培養(yǎng)物用于分析實(shí)驗(yàn).氨基功能化的納米磁珠(AF-MNPs)能夠有效的捕獲與分離細(xì)菌,這種AF-MNPs可以快速的從水溶液、食品以及尿液中分離出細(xì)菌[32].另外,氨基修飾的Fe2O3納米粒子與連有量子點(diǎn)的不同抗體結(jié)合后,形成了類似“三明治”的復(fù)合體結(jié)構(gòu),能夠有效的從食品樣品中分離出多種食源性致病菌細(xì)菌,檢測(cè)限可達(dá)10-3cfu/mL.

使用磁性納米粒子可以富集分離目標(biāo)菌.Chockalingam研究小組發(fā)現(xiàn)經(jīng)阿拉伯糖修飾的Fe3O4納米粒子可用于分離檢測(cè)S.aureus細(xì)菌[33],3 min內(nèi),檢測(cè)限可達(dá)8～10 cfu/mL.Jin研究小組使用連接氨基酸的Fe3O4@AA能夠有效的從水中分離出枯草芽孢桿菌、大腸桿菌15597,分離率很高[34].

2.2 基于核磁共振技術(shù)的細(xì)菌檢測(cè)

近幾年,一種以核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)為原理的生物大分子檢測(cè)方法受到了廣泛的關(guān)注.對(duì)于同一體積比的磁納米顆粒而言,水溶液中磁納米顆粒直徑由小變大,對(duì)水中質(zhì)子的T2弛豫時(shí)間的影響也由小變大.由于生物材料上具有的抗原決定簇,可以與免疫功能化磁珠的抗體特異性結(jié)合,進(jìn)一步會(huì)使免疫功能化磁珠富集在生物大分子上,引起實(shí)驗(yàn)體系中橫向弛豫時(shí)間(T2)的變化,NMR可以敏感的檢測(cè)到這一變化[35].目前,這一技術(shù)路線已經(jīng)在核酸、蛋白、藻類毒素等的檢測(cè)中得到了應(yīng)用,顯示了極高的靈敏度[36].

Perez等以DNA-DNA、蛋白-蛋白、蛋白-小分子以及酶相互作用為模型,證實(shí)了磁性弛豫轉(zhuǎn)換(magnetic relaxation switches,MRS)能高靈敏度、高特異性的檢測(cè)分子間的相互關(guān)系,并且在混合體系中(如全細(xì)胞融胞產(chǎn)物),這一變化能被直接檢測(cè)[37].Colombo等研究表明,采用生物功能化的磁珠,結(jié)合橫向弛豫時(shí)間的變化(ΔT2),可以在飛摩爾水平特異性的檢測(cè)人血清白蛋白(anti-HSA).Kim等采用NMR方法開展的對(duì)人絨毛膜促性腺激素(hCG)的檢測(cè)研究表明[38],最低檢測(cè)限達(dá)到3.57 nmol/L.Wei ma等的研究表明,采用基于低場(chǎng)磁共振方法的免疫傳感器,可以在一個(gè)反應(yīng)中高靈敏度的檢測(cè)湖水中的環(huán)形七肽微囊藻毒素[39],檢測(cè)限達(dá)到0.6 ng/g,檢測(cè)范圍為1～18 ng/g.在對(duì)微生物樣本的檢測(cè)中,Koh等采用NMR免疫傳感器對(duì)流感病毒抗體的檢測(cè)表明,檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到1.4×10-7mol.Perez等采用NMR方法對(duì)單純性皰疹病毒(HSV)與腺病毒(ADV)檢測(cè)研究表明,最低可以在10μL體系中檢測(cè)到5個(gè)病毒粒子[37].Kaittanis等構(gòu)建了NMR免疫探針,對(duì)血液與牛奶中的鳥分枝桿結(jié)核菌(MAP)進(jìn)行檢測(cè)研究,最低檢測(cè)限達(dá)到15.5 cfu/mL.Kaittanis等采用葡聚糖包被的NMR探針,對(duì)血液中的金黃色葡萄球菌進(jìn)行藥敏評(píng)價(jià),研究了在復(fù)雜、不透明體系中NMR免疫探針檢測(cè)方法的可行性[40].Zhao等構(gòu)建了連接阪崎腸桿菌抗體的NMR傳感器,檢測(cè)中當(dāng)溶液中細(xì)菌數(shù)目增多,E.sakazakii 抗原會(huì)競(jìng)爭(zhēng)溶液中有限數(shù)目的納米磁珠,導(dǎo)致T2的改變.NMR免疫探針核磁共振檢測(cè)方法,不僅能在復(fù)雜體系中高靈敏度、特異性的檢測(cè)目標(biāo)生物分子,而且具有目標(biāo)濃度越低,ΔT2值越高的特點(diǎn)[41].

3 展 望

傳統(tǒng)的食源性細(xì)菌檢測(cè)耗費(fèi)時(shí)間較長,檢測(cè)靈敏度較低,而基于納米粒子的檢測(cè)技術(shù)為有效快速檢測(cè)致病菌提供了技術(shù)支持;生物傳感器逐漸成為成本合理的便攜式設(shè)備,具有高靈敏度、使用方便等優(yōu)點(diǎn),但挑戰(zhàn)依然存在,超靈敏度細(xì)菌檢測(cè)依然存在挑戰(zhàn);依據(jù)納米粒子的生物傳感器為同時(shí)檢測(cè)多種細(xì)菌提供了良好的依據(jù);納米粒子提供了信號(hào)放大的作用,同時(shí)具有光學(xué)及電學(xué)特性,使部分細(xì)菌的超靈敏度檢測(cè)成為可能,將納米粒子檢測(cè)應(yīng)用于更多微生物致病菌的研究需要研究者不斷地探索;使用不同尺寸的量子點(diǎn)可以同時(shí)檢測(cè)大腸桿菌和鼠傷寒桿菌.盡管量子點(diǎn)用于檢測(cè)食品、農(nóng)業(yè)、環(huán)境樣品中病原體可行性很高,但如何生產(chǎn)出大規(guī)模具有生物相容性并且薄的量子點(diǎn)仍然是一個(gè)挑戰(zhàn).

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