GC-MS結(jié)合嗅辨儀鑒定不同酒齡黃酒中的關(guān)鍵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)

王 旭, 馮 濤, 莊海寧

(1.上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院 香料香精技術(shù)與工程學(xué)院,上海 201418;2.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所,國家食用菌工程技術(shù)研究中心,上海 201403)

黃酒是我國的傳統(tǒng)釀造酒,至今已有四千多年的歷史[1].它是以大米為主要原料,利用酒藥、麥曲或米曲所含的多種微生物的共同作用,釀造而成的發(fā)酵原酒.黃酒釀造過程分為制曲、浸米、蒸飯、發(fā)酵、榨酒、勾兌、煎酒、貯存、過濾、灌瓶、滅菌等工序[2].一般情況下,黃酒在上市前密封存儲(chǔ)在瓦罐中陳化至少一年.在這期間,黃酒內(nèi)部發(fā)生多種物理化學(xué)變化,酒精、游離氨基氮含量下降,而酸類、酯類、總固形物等含量緩慢增加.正是在陳化期間的這些變化才使得黃酒具有柔和圓潤的口感[3].

目前,對于黃酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的研究,較常用的方法是頂空固相微萃取結(jié)合GC-MS分析.Luo[4]和Cao[5]都分別使用SPME-GC-MS分析了不同品牌黃酒的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),結(jié)果表明醇類和酯類在黃酒的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類和含量上占據(jù)大部分.Fan[1]利用GC-MS和GC-O得出2-甲基丁醇、3-甲基丁醇、丁酸、3-甲基丁酸、苯乙醇、γ-壬內(nèi)酯具有最強(qiáng)的風(fēng)味強(qiáng)度,而二甲基三硫醚、辛酸乙酯、丁酸乙酯、γ-壬內(nèi)酯有較高的香氣活力值(OAV).

嗅覺閾值是對揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行評(píng)估的一個(gè)重要參數(shù).一般嗅覺閾值分為兩類:察覺閾值(detection threshold,DT)、識(shí)別閾值(recognition threshold,RT)[6].察覺閾值是指能察覺或者辨別出存在嗅覺刺激時(shí)香氣物質(zhì)的最低濃度;識(shí)別閾值是指香氣物質(zhì)可以被識(shí)別香氣特征或可以與其他香氣物質(zhì)區(qū)別開時(shí)的最低濃度.近來,符合ASTM E679-04 標(biāo)準(zhǔn)的儀器——AC′Scent嗅辨儀被廣泛地應(yīng)用于風(fēng)味物質(zhì)閾值測定和感官評(píng)價(jià)員的培訓(xùn)方面.McGinley[7]和Johnston[8]都利用AC′Scent嗅辨儀對感官評(píng)價(jià)員進(jìn)行培訓(xùn)與篩選,而且Johnston還測定了多種揮發(fā)性物質(zhì)混合后形成的混合物閾值.這都表明AC′Scent嗅辨儀的實(shí)際應(yīng)用能力,為其在測定黃酒中揮發(fā)性物質(zhì)的閾值提供了有用的參考.

本研究主要內(nèi)容有:①利用固相微萃取結(jié)合GC-MS分析金色年華揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì);②利用AC′Scent嗅辨儀測定揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)閾值;③利用香氣活力值(OAV)判斷黃酒中主要呈香物質(zhì).

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試劑及酒樣

2-辛醇(色譜純)和正構(gòu)烷烴混標(biāo)(C7-C30)購自Sigma-Aldrich公司(上海).氯化鈉、異丁酸、異丁醇、苯甲醛、乙酸乙酯、己酸、丁醇、丁酸乙酯、乙酸、糠醛、己酸乙酯、苯乙醇、丙醇、己醇、正壬醇、異戊酸、辛酸、乙酸異戊酯、辛酸乙酯、苯甲酸乙酯、苯乙酸乙酯均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(上海),均為分析純.

黃酒樣品:金色年華3年陳(JN3)、5年陳(JN5)和8年陳(JN8).均從上海金楓酒業(yè)股份有限公司購買.

1.1.2 儀器設(shè)備

SPME進(jìn)樣手柄、85 μm PA萃取頭,美國Supelco公司;7890-5975C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀,裝配HP-INNOWAX (60 m×0.25 mm i.d.×0.25 μm)色譜柱,美國安捷倫公司;AC′Scent嗅辨儀,St.Croix sensory公司(美國);15 mL頂空瓶,上海安譜科學(xué)儀器有限公司.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酒樣預(yù)處理

將所有酒樣用蒸餾水稀釋至6%(v/v)的酒精濃度.然后取稀釋后的酒樣5 mL放入頂空瓶中,同時(shí)加入1.25 g氯化鈉和10 μL 2-辛醇(內(nèi)標(biāo)物,262 mg/L,溶于超純水).將頂空瓶放入45℃水浴鍋中保溫10 min.

1.2.2 SPME-GC-MS

頂空固相微萃取條件設(shè)定為45℃、40 min.氣相色譜條件:進(jìn)樣口溫度250℃,解析4 min,不分流進(jìn)樣,載氣氦氣(99.99%),流速2 mL/min.柱箱溫度35℃保持3 min,然后以2℃/min升至60℃,然后以3℃/min升至230℃,最后保持5 min.質(zhì)譜條件:電離方式EI,離子源溫度230℃,掃描范圍30～350 u.每個(gè)酒樣檢測3次.根據(jù)正構(gòu)烷烴計(jì)算出保留指數(shù)(RI),計(jì)算公式見文獻(xiàn)[9].

通過與NIST05a.L數(shù)據(jù)庫和保留指數(shù)對比對香氣物質(zhì)進(jìn)行定性鑒別.香氣物質(zhì)的定量見文獻(xiàn)[9].

1.2.3 嗅覺閾值的測定

測定閾值是根據(jù)美國材料試驗(yàn)學(xué)會(huì)(ASTM)制定的標(biāo)準(zhǔn)——ASTM E679-04.它包括一系列的三點(diǎn)強(qiáng)制選擇(3-AFC)測試.每次測試包括3個(gè)樣品:兩個(gè)空白樣品、一個(gè)測試樣品.具體操作過程如下.

① 準(zhǔn)備樣品袋

將待測物品與樣品袋依次編號(hào),在各樣品袋中通入AC′Scent 嗅辨儀中的氣流速度為19 L/min的零級(jí)空氣(經(jīng)活性碳和分子篩過濾后的空氣),通入時(shí)間各為30 s.取相應(yīng)編號(hào)的待測物品10 μL裝入樣品袋中,密封,放置4～5 h,使樣品袋中的樣品與空氣達(dá)到平衡狀態(tài).

② 嗅辨員的選擇

以正丁醇作為標(biāo)準(zhǔn)物,對嗅辨員進(jìn)行篩選.要求:經(jīng)20次測試,嗅辨員對正丁醇的識(shí)別閾值在2×10-8～8×10-8之間.最后確定一個(gè)70人左右的感官評(píng)定小組.

③ 測定閾值

利用AC′Scent嗅辨儀,采用ASTM E-679中的三點(diǎn)強(qiáng)制選擇法,讓篩選后的嗅辨員對黃酒中檢測到各種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)單體的嗅覺閾值進(jìn)行測定,該物質(zhì)是以零級(jí)空氣為媒介進(jìn)行稀釋的,需要記錄樣品被嗅聞到時(shí)的稀釋倍數(shù).并以此計(jì)算出各揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)單體的閾值,閾值的計(jì)算公式如下:

T—風(fēng)味物質(zhì)閾值,(mg/L);

C—風(fēng)味物質(zhì)濃度,(mg/L);

D—樣品稀釋倍數(shù).

1.2.4 香氣活力值的計(jì)算

香氣活力值(OAV)是香氣物質(zhì)的濃度與其嗅覺閾值的比值.根據(jù)下面公式計(jì)算香氣活力值:

OAV=F/T.

F—樣品中揮發(fā)性物質(zhì)濃度,(mg/L);

T—揮發(fā)性物質(zhì)閾值,(mg/L).

1.3 數(shù)據(jù)處理

單因素方差分析(ANOVA)使用SPSS11.5軟件進(jìn)行.

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酒齡黃酒中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)及含量

共檢測出41種物質(zhì),見表1.其中包括17種酯類、10種醇類、6種酸類、2種內(nèi)酯、酮類和酚類各1種.香氣物質(zhì)種類和已報(bào)道的相符合[2,10].這可以表明黃酒的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)在種類上基本是相同的,只是在含量上會(huì)因不同年份而產(chǎn)生差異.

表1 不同酒齡黃酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量

(續(xù))表1

??RIcal是根據(jù)正構(gòu)烷烴混標(biāo)(C7-C30)計(jì)算得出.

?來自http://www.flavornet.org/flavornet.html,及參考文獻(xiàn)[11],保留指數(shù)(RI)根據(jù)C20M柱查得.

*不同的小寫字母表示具有顯著性差異(p< 0.05).

§未檢測出.

3種酒齡黃酒共鑒定出17種酯類物質(zhì).酯類物質(zhì)一般都能提供花香和水果香韻.在所有酯類中甲酸異戊酯含量最高,各占據(jù)著對應(yīng)酒齡黃酒總酯類物質(zhì)含量的72.72%、69.02%和67.03%.JN3中其他含量較高的酯類有乙酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸異戊酯和丁二酸二乙酯.JN5中17種酯類都有檢測到,除甲酸異戊酯外,丁二酸二乙酯、乳酸乙酯和乙酸乙酯含量比較高.JN8中其他主要酯類有乳酸乙酯、丁二酸二乙酯和乙酸乙酯.有研究表明酯類物質(zhì)主要是由酒中的酸類物質(zhì)與醇發(fā)生酯化反應(yīng)生產(chǎn)的[12-13],這可能也是3種黃酒中乙酯類物質(zhì)種類眾多的原因.當(dāng)然酵母菌和其他微生物在發(fā)酵過程中也會(huì)產(chǎn)生酯類物質(zhì)[14].

醛類在低濃度時(shí)會(huì)有果香味,但是當(dāng)在高濃度時(shí)(>200 mg/L)[15]會(huì)使酒變的“平淡(flatness)”.3種酒齡黃酒中共檢測到4種醛類化合物:異戊醛、糠醛、苯甲醛和2-苯基巴豆醛.其中苯甲醛含量最高,分別占JN3、JN5、JN8中總?cè)╊惡康?1.95%、56.95%、50.78%.苯甲醛是一種具有令人愉悅的杏仁氣味的物質(zhì).目前認(rèn)為醛類一般來自釀酒微生物的代謝作用,前體物質(zhì)可能是不飽和脂肪酸和氨基酸[9,14].

JN3和JN8中都檢測出6種酸,JN5中檢測出5種酸.JN8的酸類物質(zhì)濃度最高,達(dá)到8.53×10-2mg/L,而在JN5中最低,為1.43×10-2mg/L.在JN3和JN8中乙酸的濃度相對較高,分別為1.52×10-2mg/L和4.10×10-2mg/L,與其他酸類具有顯著性差異(p< 0.05),而JN5中各種酸類的濃度沒有顯著性差異(p< 0.05).短鏈酸在適當(dāng)?shù)臐舛葧r(shí)可以為黃酒提供良好的氣味,但是濃度過高時(shí)則可能產(chǎn)生不良風(fēng)味,是黃酒出現(xiàn)類似酸敗的氣味,降低黃酒品質(zhì).

醇類物質(zhì)是黃酒中一類非常重要的揮發(fā)性成分,共有10種醇類被檢測到.醇類物質(zhì)中苯乙醇和異丁醇有很高的含量,這兩種物質(zhì)能為黃酒帶來花香和酒的特有香味.在JN5酒樣中沒有檢測到丁醇、2-壬醇和正壬醇,在JN8酒樣中沒有檢測到己醇、2-壬醇及正壬醇,而在JN3樣品中10種醇類均有檢測到,這可能是因?yàn)辄S酒的陳化過程中醇類物質(zhì)參與多種化學(xué)反應(yīng)使其種類及含量發(fā)生變化.醇類物質(zhì)主要來自釀酒過程中的酒精發(fā)酵[9].醇類物質(zhì)對黃酒的風(fēng)味的影響主要取決于其種類和含量.并且醇類的濃度低于300 mg/L時(shí)可以對酒體風(fēng)味產(chǎn)生較好的影響[16].

內(nèi)酯、酮類和酚類檢測到的物質(zhì)種類較少,各有2種、1種和1種,其相對含量也比較低.其中甲基壬基甲酮與酒的溫潤細(xì)膩感,特別是在香味持久感方面有重要作用[9].

2.2 嗅覺閾值及OAV值

閾值的測定是由經(jīng)過篩選的嗅辨員使用AC′Scent嗅辨儀測得,再根據(jù)黃酒中揮發(fā)性物質(zhì)含量即可得到它們的OAV值,結(jié)果見表2.

表2 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)嗅覺閾值和其香氣活力值

a.識(shí)別閾值(RT); b.見文獻(xiàn)[17]; c.未找到

表2中列出了文獻(xiàn)中報(bào)道的識(shí)別閾值.通過將本實(shí)驗(yàn)測得閾值與以前報(bào)道閾值對比可以發(fā)現(xiàn),有些物質(zhì)的測定識(shí)別閾值與文獻(xiàn)中比較一致,比如糠醛、異丁醇,它們測定的識(shí)別閾值分別為1.01 μg/L、0.60 μg/L,文獻(xiàn)中的閾值分別為0.98 μg/L和0.66 μg/L;但是大部分物質(zhì)的識(shí)別閾值與文獻(xiàn)報(bào)道值存在較大差別.這種差別可能是因?yàn)椴煌姆治龇椒▽?dǎo)致的.

從表2的結(jié)果可以看出,只有JN3、JN8中的丁醇和JN5中的己酸、丁酸乙酯、乙酸的OAV值小于1,其他揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)OAV值是大于1的,這表明它們可以被人們嗅聞到,而且OAV值越大,其對嗅覺產(chǎn)生的刺激越強(qiáng)烈.這也是金色年華能呈現(xiàn)強(qiáng)烈香韻的原因之一.在3種酒齡的金色年華中異丁醇都具有最高的OAV值,分別達(dá)到326.33、122.67和176.17,可以推斷異丁醇為金色年華基本香韻物質(zhì)之一.但是,并不是OAV值低于1的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)就對黃酒香韻完全沒有影響,它們也可以有一些比較弱的作用.總體來說,JN3中主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì):異丁醇(326.33)、異丁酸(124.00)、異戊酸(62.73)、乙酸異戊酯(62.07)、苯乙醇(60.39)、乙酸乙酯(32.22);JN5中主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì):異丁醇(122.67)、苯乙醇(38.89)、異丁酸(36.00)、乙酸乙酯(18.35)、苯甲醛(14.31)、苯甲酸乙酯(9.71);JN8中主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì):異丁醇(176.17)、異戊酸(128.18)、異丁酸(116.00)、苯乙醇(96.22)、苯甲醛(42.52)、乙酸乙酯(34.66).從表2中可以發(fā)現(xiàn)雖然3種酒齡黃酒的主要揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類上沒有太大區(qū)別,但是各種物質(zhì)的OAV值相差較大,通過這些物質(zhì)的相互作用,勢必會(huì)對不同酒齡黃酒的基本香味產(chǎn)生重要影響.

3 討 論

對酒類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的提取方法有很多種:同時(shí)蒸餾萃取、固相微萃取、溶劑萃取等,但頂空固相微萃取(HS-SPME)無疑是操作最簡單、樣品用量最少的一種.通過SPME-GC-MS分析檢測了3種酒齡的金色年華黃酒,共檢測出41種物質(zhì).從GC-MS的結(jié)果來看3種酒齡黃酒在揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的種類方面沒有太大區(qū)別,都是以酯類、醇類、酸類為主.

AC′Scent嗅辨儀在近些年來被用于測定揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的嗅覺閾值,在本研究中測定的閾值和文獻(xiàn)中有所差別的主要原因是使用了不同方法和設(shè)備.結(jié)合揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的濃度和閾值計(jì)算出每個(gè)香味物質(zhì)的香氣活力值,這樣就可以更加準(zhǔn)確地判斷出不同酒齡的金色年華中主要呈香物質(zhì),而且可以發(fā)現(xiàn)3種酒齡的金色年華在關(guān)鍵呈香物質(zhì)上有差別.但是,值得注意的是,目前測定香味物質(zhì)的嗅覺閾值都是在單一物質(zhì)存在的情況下進(jìn)行,而實(shí)際情況是每種樣品中都存在著數(shù)量眾多的香味物質(zhì),這些物質(zhì)會(huì)彼此影響,使得它們的閾值與單獨(dú)測定時(shí)可能不同.

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