吳茱萸對黃連中小檗堿組織分布及肝臟攝取的影響

梁瑞峰，張 峰，劉方洲，叢德剛，代 震

(1.河南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所，河南 鄭州450004;2.天津天士力制藥集團(tuán)股份有限公司，天津300410)

吳茱萸味辛、苦，性熱，有小毒，歸肝、脾、胃、腎經(jīng)，具有散寒止痛、降逆止嘔、助陽止瀉的功效。《本草求真》曰其專入肝，歷代醫(yī)家多有用其引藥入肝經(jīng)。朱丹溪言:“頭痛須用川芎，如不愈，各加引經(jīng)藥，太陽川芎，陽明白芷……厥陰吳茱萸?！薄侗静菝审堋芬嘌员酒贰柏赎庮^疼，引經(jīng)必用”。故大凡病在厥陰，多可用本品為引經(jīng)藥。出自《丹溪心法》的左金丸，由黃連、吳茱萸按6∶1 比例組成，此方雖用藥簡單，適應(yīng)范圍卻甚廣，不僅可以清肝膽之火，還能瀉胃腸之熱，有和胃降逆、制酸止嘔等功效，為辛開苦降的代表方劑。方中重用黃連作為君藥，清瀉肝火，黃連亦善清瀉胃熱，胃火降則其氣自和，一藥而兩清肝胃，標(biāo)本兼顧。佐以辛熱之吳茱萸，一者疏肝解郁，以使肝氣條達(dá)，郁結(jié)得開;反佐以制黃連之寒，使瀉火而無涼遏之弊;一者取其下氣之用，以和胃降逆;可引領(lǐng)黃連入肝經(jīng)，如此一味而功兼四用，以為佐使［1］。吳茱萸在左金丸中具有引經(jīng)作用，本實驗從大鼠體內(nèi)分布的角度嘗試探討黃連吳茱萸配伍對黃連主要成分小檗堿在大鼠體內(nèi)組織分布的影響。

1 材料與方法

1.1 動 物

健康SD 大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量200 ～220 g，由河南省實驗動物中心提供，許可證號:SCXK(豫)2010 -0002。

1.2 藥品、試劑與儀器

黃連、吳茱萸購于河南張仲景大藥房股份有限公司;鹽酸小檗堿對照品，由中國食品藥品檢定研究院提供，批號110713 - 200911;羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，批號F20100621;乙腈、甲醇均為色譜純，天津四友精細(xì)化學(xué)品有限公司產(chǎn)品;磷酸二氫鈉、乙酸乙酯，天津市化學(xué)試劑三廠產(chǎn)品。1100 型高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司產(chǎn)品;ODS C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm )，大連依利特科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;Biofuge Stratos 低溫高速離心機(jī)，德國heraeus 公司產(chǎn)品;XW-80A 型漩渦混合器，上海精科實業(yè)有限公司產(chǎn)品;BS223S 型電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品。

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 心、肝、肺、脾、腎組織中小檗堿的分布

分組與給藥:將36 只SD 大鼠隨機(jī)分為黃連組、黃連吳茱萸合用組兩組，每組18 只。分別灌胃給予黃連粉末(1.8 g 生藥/kg，粉末過100 目篩，用2 g/L 的CMC-Na 混懸)、黃連與吳茱萸混合粉末(2.1 g生藥/kg，黃連∶吳茱萸為6∶1，粉末過100 目篩，用2 g/L 的CMC-Na 混懸)，每組大鼠每天給藥1 次，連續(xù)給藥5 d。分別于末次給藥后1 h、2 h、4 h隨機(jī)取6 只大鼠，以水合氯醛麻醉后取組織。樣品處理與色譜條件:分別精密稱取各組織樣品0.5 g，加入甲醇與水混合液(1∶2)2 mL，制備組織勻漿。勻漿液以4 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心5 min，取上層液1.5 mL，加乙酸乙脂4 mL，渦旋3 min，以4 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，分離有機(jī)層，用低于45 ℃的N2吹干，用100 μL 流動相溶解殘留物，20 μL 進(jìn)樣。流動相為乙腈∶0.05 mol/L 磷酸二氫鈉(30∶70 比例)，體積流量1. 0 mL/min，檢測波長345 nm［2］，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量20 μL。

1.3.2 肝臟攝取率

將12 只大鼠隨機(jī)分為黃連組、黃連吳茱萸合用組兩組，每組6 只。用100 g/L 水合氯醛(3 μL/g)腹腔注射麻醉，腹部切口，結(jié)扎腹腔動脈與肝動脈，游離幽門靜脈，用0.5 mm 的塑料管插入幽門靜脈，尖端進(jìn)入門靜脈，用以靜脈取樣。游離上腸系膜動脈、右腎動脈和腹主動脈，在右腎動脈靠近右側(cè)腎門處結(jié)扎，然后用動脈夾夾住右腎動脈入腹主動脈處，在動脈夾和結(jié)扎點(diǎn)之間作一切口，用0.5 mm 的塑料管插入右腎動脈，穿過腹主動脈進(jìn)入上腸系膜動脈，插管固定后立即開通灌流，體積流量5 mL/min，同時通入氧氣(體積分?jǐn)?shù)95%的O2和體積分?jǐn)?shù)5%的CO2，氣體體積流量＜1 L/min)。快速打開胸腔，在右心房上做一切口，用1.5 mm 的塑料管插入切開的右心房，其尖端順下腔靜脈進(jìn)入肝靜脈，用作肝靜脈取樣。固定插管后將體積流量提高到7.5 mL/min。將上腸系膜動脈、右腎動脈和腹主動脈3 者分支處扎緊［3］。灌流液灌流平衡5 min 后，于十二指腸給藥，分別給予黃連粉末(1. 8 g 生藥/kg，粉末過100 目篩，用2 g/L 的CMC-Na 混懸)、黃連與吳茱萸混合粉末(2.1 g 生藥/kg，黃連︰吳茱萸為6∶1，粉末過100 目篩，用2 g/L 的CMC-Na 混懸)，灌流液體積為1 000 mL。于給藥后2，5，10，15，30，45，60，90，120 min分別從門靜脈、肝靜脈插管處取樣，HPLC 檢測，DAS 2.0 軟件計算藥-時曲線下面積(AUC)，計算肝臟攝取率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計分析軟件處理。計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)(x-)± 標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，組間比較采用t 檢驗。以P ＜0.05 為差別有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠不同時刻心、肝、脾、肺、腎中小檗堿含量對比

給黃連后，小檗堿在大鼠體內(nèi)的各臟器中，以肝臟中分布最高，其次為心臟、腎臟。黃連配伍吳茱萸后，小檗堿在肝臟中的分布依然最高，且比配伍前明顯增加，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)，說明兩者配伍后吳茱萸使小檗堿的分布趨向于肝臟。見表1。

表1 各組大鼠不同時刻心、肝、脾、肺、腎中小檗堿含量對比 n=6，μg·g -1±s

表1 各組大鼠不同時刻心、肝、脾、肺、腎中小檗堿含量對比 n=6，μg·g -1±s

注:與黃連組對比，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

組別心1 h 2 h 4 h肝1 h 2 h 4 h脾1 h 2 h 4 h黃連組 0.371±0.530 0.655±0.064 0.110±0.029 0.382±0.057 1.194±0.162 0.595±0.087 0.194±0.044 0.298±0.042 0.107±0.017黃連吳茱萸合用組 0.330±0.051 0.541±0.085 0.091±0.015 0.471±0.070* 1.843±0.218＊＊0.726±0.098 0.188±0.042 0.306±0.048 0.118±0.029組別肺1 h 2 h 4 h腎1 h 2 h 4 h黃連組 0.113±0.030 0.243±0.040 0.090±0.021 0.271±0.055 0.420±0.071 0.231±0.048黃連吳茱萸合用組 0.124±0.039 0.230±0.043 0.087±0.023 0.297±0.068 0.527±0.096 0.208±0.037

2.2 各組大鼠小檗堿肝臟攝取對比

大鼠肝臟灌流模型中，黃連組與黃連吳茱萸合用組門靜脈處的AUC、肝靜脈的AUC 對比，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)，但兩組小檗堿的肝臟攝取率對比，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜ 0. 05)。結(jié)果表明:吳茱萸促進(jìn)了黃連中小檗堿的肝臟攝取。見表2。

表2 各組大鼠小檗堿肝臟攝取對比 n=6±s

表2 各組大鼠小檗堿肝臟攝取對比 n=6±s

注:與黃連組對比，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

組 別 AUC門靜脈/(μg·h -1·L -1) AUC肝靜脈/(μg·h -1·L -1) 肝臟攝取率/%黃連組 102 538.80±13 463.85 63 529.33±11 623.48 38.2 0±6.39黃連吳茱萸合用組 101 525.70±14 322.40 53 336.83±9 809.51 47.60±5.02*

3 討 論

吳茱萸主入肝經(jīng)，既溫肝降逆，又引藥入肝，使肝之陰寒去，逆氣平，而諸癥除。左金丸中吳茱萸一味而功兼四用，以為佐使。

本實驗結(jié)果顯示:吳茱萸對黃連中的主要成分小檗堿在大鼠主要臟器的分布產(chǎn)生了明顯的影響，明顯提高了給藥1 h、2 h 后小檗堿在大鼠肝臟的分布，促進(jìn)了黃連中小檗堿的肝臟攝取，支持了吳茱萸“引藥入肝”的作用。

藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄過程通常需要由轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)完成。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是位于細(xì)胞膜上的功能性膜蛋白，在肝臟有著廣泛表達(dá)，其生理功能是將大多數(shù)內(nèi)、外源性物質(zhì)或藥物等攝取進(jìn)入肝臟，在肝臟經(jīng)過一定的代謝轉(zhuǎn)化，最終將其經(jīng)膽汁排至肝外［4］。肝臟轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在藥物肝膽轉(zhuǎn)運(yùn)中起重要作用，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性與藥物在肝臟的攝取、分布、代謝及排泄等密切相關(guān)。中藥配伍引起的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性的改變可能是導(dǎo)致藥效物質(zhì)體內(nèi)過程變化的重要機(jī)制［5］。吳茱萸是否通過影響肝細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性進(jìn)而發(fā)揮引藥入肝的引經(jīng)作用，需要我們做進(jìn)一步的研究。從轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的角度尋找中藥配伍的普遍科學(xué)規(guī)律，除能驗證經(jīng)典方劑配伍的合理性外，更重要的是可利用這種規(guī)律指導(dǎo)中藥的臨床應(yīng)用。

［1］鄧中甲.方劑學(xué)［M］.第2 版.北京:中國中醫(yī)藥出版社，2010:108.

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［4］張愛杰，劉克辛.肝臟轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)藥物相互作用的研究進(jìn)展［J］.世界華人消化雜志，2012，20(28):2655-2660.

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