半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis Günther)生長(zhǎng)激素體外重組表達(dá)及活性分析*

柳學(xué)周 劉芝亮, 徐永江 王妍妍 李春廣

(1. 農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071; 2. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海 201306; 3. 紹興市鴻港農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司 紹興 312000)

生長(zhǎng)激素(growth hormone, GH)是一種具有廣泛生理功能的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素, 分子量為21—22 kDa, 對(duì)魚(yú)類的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要調(diào)控作用(Chenet al, 1994;Yoweet al, 1995; Benedetet al, 2005)。魚(yú)類GH作為新陳代謝的調(diào)控子元件, 能夠有效地促進(jìn)脂肪更多分解為能源, 使吸收的氨基酸更多用于生長(zhǎng)(Yoweet al, 1995), 同時(shí)可提高魚(yú)類的食欲和餌料中蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化效率(Silversteinet al, 2000), 促進(jìn)肝糖原的消耗(Leunget al, 1991)和蛋白質(zhì)的合成(Markertet al,1977; Johnssonet al, 1994)。GH在魚(yú)體內(nèi)多通路多層次上的綜合調(diào)節(jié), 有效地促進(jìn)了魚(yú)體的生長(zhǎng)發(fā)育(Bjornsson, 1997)。研究表明, 體外重組GH與魚(yú)體內(nèi)天然GH具有相同的生物活性, 給魚(yú)類注射或投喂天然或重組GH可使受體魚(yú)食欲增強(qiáng), 餌料的轉(zhuǎn)化效率提高, 魚(yú)體生長(zhǎng)加快, 養(yǎng)殖周期縮短, 實(shí)現(xiàn)商品魚(yú)盡快上市, 從而大大提高養(yǎng)殖效益(Mcleanet al, 1990;簡(jiǎn)清等, 1999; 馬進(jìn)等, 2001; 李晶等, 2004; 孫穎等,2006)。外源GH的生長(zhǎng)促進(jìn)作用可能通過(guò)魚(yú)類后腸上皮細(xì)胞的泡飲作用吸收完整的外源GH蛋白, 從而使得具有免疫學(xué)活性和生物學(xué)活性的生長(zhǎng)激素可以進(jìn)入魚(yú)類血液中, 從而促進(jìn)魚(yú)體生長(zhǎng)(簡(jiǎn)清等, 1999;孫穎等, 2006)。

半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevisGünther), 屬鰈形目(Pleuronectiformes)、舌鰨科(Cynoglossidae)、舌鰨屬(Cynoglossus), 為東北亞特有的名貴冷溫性底棲大型鰈形目魚(yú)類, 是一種理想的近海增養(yǎng)殖對(duì)象(鄧景耀等, 1988), 目前已成為我國(guó)三大鲆鰈類主導(dǎo)養(yǎng)殖品種之一。半滑舌鰨具有生長(zhǎng)的性別二態(tài)性, 即雌性的生長(zhǎng)速度遠(yuǎn)大于雄性, 因而養(yǎng)殖雌性苗種更具有經(jīng)濟(jì)性。但目前對(duì)半滑舌鰨生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)不足,不利于建立其養(yǎng)殖生長(zhǎng)調(diào)控技術(shù)。鑒于GH在魚(yú)類生長(zhǎng)調(diào)控中的重要作用及其在雌雄個(gè)體生長(zhǎng)過(guò)程中的差異表達(dá)特性(Maet al, 2011), 本研究構(gòu)建了半滑舌鰨GH原核表達(dá)載體系統(tǒng), 獲得了具有免疫和生物活性的重組半滑舌鰨GH蛋白, 為從蛋白水平深入認(rèn)識(shí)半滑舌鰨生長(zhǎng)調(diào)控機(jī)制以及開(kāi)發(fā)實(shí)用的半滑舌鰨生長(zhǎng)調(diào)控技術(shù)提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用魚(yú)

試驗(yàn)用半滑舌鰨5尾(全長(zhǎng)39—48cm, 體重750—1120g)取自青島忠海水產(chǎn)有限公司(青島), 實(shí)驗(yàn)魚(yú)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后, 以MS222 (280mg/L)麻醉處死, 迅速取其垂體和肝臟組織保存于液氮中(–196°C)用于總RNA提取。

1.2 GH成熟肽的克隆

利用RNAiso plus (TaKaRa)從垂體組織中提取總RNA, 檢驗(yàn)濃度和純度, 在M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa)的作用下合成第一鏈cDNA, 保存于–20°C備用。根據(jù)已知半滑舌鰨GH全長(zhǎng)序列(GenBank Accession No.: FJ608663)設(shè)計(jì)特異性引物, 引物序列見(jiàn)表1。

表1 半滑舌鰨GH成熟肽擴(kuò)增用特異性引物Tab.1 Primers for matured peptide of GH gene from C.semilaevis

在引物P1和P2的5’端分別加入了HindIII和XhoI酶切位點(diǎn)(方框標(biāo)注), 同時(shí)將下游引物P2終止密碼子TAG更換為強(qiáng)終止密碼子TTA(陰影部分)。為保證重組蛋白翻譯的氨基酸序列的正確性, 在上游引物P1中還額外添加了兩個(gè)堿基(下劃線標(biāo)注)。利用引物P1和P2, 以垂體cDNA為模板PCR擴(kuò)增得到GH成熟肽, PCR條件: 94°C 5min變性, 然后(94°C 30s, 61°C 30s, 72°C 50s) 34個(gè)循環(huán), 最后72°C延伸10min, 將成熟肽片段連接到pEASY-T1載體上, 挑選陽(yáng)性克隆送往北京華大基因測(cè)序驗(yàn)證。

1.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

選擇測(cè)序正確的菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增, PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后將所得條帶進(jìn)行切膠回收純化,分別對(duì)回收產(chǎn)物和pET-28a質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切, 得到具有相同黏性末端的GH和pET-28a基因片段。

將雙酶切后的GH連接到線性化的pET-28a上,得到重組質(zhì)粒GH/pET28a, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(Invitrogen), 菌液PCR驗(yàn)證并測(cè)序。提取測(cè)序正確的重組質(zhì)粒, 并制備含GH/pET28a質(zhì)粒的表達(dá)菌株BL21(DE3)。

1.4 重組GH/pET28a質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

將含GH/pET28a質(zhì)粒的表達(dá)菌株BL21(DE3), 在含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中37°C震蕩培養(yǎng)至OD600為0.6—0.7, 加入IPTG至終濃度為1 mmol/L, 繼續(xù)培養(yǎng)4 h, 誘導(dǎo)結(jié)束后, 8000 r/min離心10 min收集菌體, PBS洗滌并重懸菌體, 取20μL重懸后菌體加5μL 5×SDS-PAGE上樣Buffer, 沸水浴5 min, 離心去雜質(zhì),SDS-PAGE電泳檢測(cè)是否有GH融合蛋白表達(dá)。

將重懸后菌體在37°C擴(kuò)大培養(yǎng), 至OD600為0.6—0.7時(shí), 加入IPTG至終濃度為1 mmol/L, 相同條件下繼續(xù)培養(yǎng), 分別在誘導(dǎo)0h、1h、2h、3h、4h、6h后各取2mL菌液, SDS-PAGE電泳檢測(cè), SigmaScan pro 5軟件分析不同誘導(dǎo)時(shí)間下融合蛋白表達(dá)率。另取部分重組菌分別在18°C、28°C和37°C條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h, 分析溫度對(duì)融合蛋白表達(dá)的影響。

1.5 GH融合蛋白Western-blotting驗(yàn)證

收集誘導(dǎo)4 h的菌體沉淀和對(duì)照菌沉淀, 經(jīng)SDSPAGE電泳后, 利用半干電轉(zhuǎn)印法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上, 用5% BSA封閉, 室溫下一抗和二抗分別撫育2 h, 所用一抗和二抗分別為6×His Monoclonal Antibody(Clontech)和HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG, HRP-DAB顯色(Tiangen Biotech Co., Ltd), 數(shù)碼相機(jī)拍照。

1.6 GH融合蛋白純化和復(fù)性

將37°C條件下IPTG (1 mmol/L)誘導(dǎo)表達(dá)4 h的重組菌, 8000 r/min 4°C離心10 min, PBS洗滌沉淀,超聲波破碎液(50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0, 0.5 mol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA)重懸菌體, 重懸后的菌液于冰浴中進(jìn)行超聲破碎, SDS-PAGE檢測(cè)沉淀和上清。破碎后的沉淀用包涵體洗滌液(50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0, 0.5 mol/L NaCl, 2 mol/L Urea, 1% Triton X-100)洗滌2—3次, 洗滌后的包涵體溶于包涵體裂解液(6 mol/L guanidine HCl pH 6.5, 0.4 mol/L NaH2PO4, 0.4 mol/L Na2HPO4, 0.5 mol/L NaCl) 4°C過(guò)夜變性, 變性后的包涵體12000 r/min離心10 min, 棄沉淀, 上清先后用0.8μm和0.45μm微孔濾膜過(guò)濾, 然后Ni2+-NTA親和層析柱(TaKaRa)分離純化融合蛋白。

分離后的融合蛋白SDS-PAGE電泳檢測(cè)后裝入到透析袋中, 分別用8 mol/L→6 mol/L→4 mol/L→2 mol/L尿素梯度復(fù)性液和PBS充分透析復(fù)性, 用10 kDa超濾管(Millipore)進(jìn)行超濾濃縮, SDS-PAGE電泳檢測(cè), –80°C超低溫冰箱保存。

1.7 GH融合蛋白的免疫活性測(cè)定

將純化并復(fù)性后的GH融合蛋白復(fù)溶, Pierce BCA蛋白定量分析試劑盒(Thermo Scientific Co., Ltd)測(cè)定重組蛋白濃度。根據(jù)BCA蛋白定量分析試劑盒的測(cè)定結(jié)果將GH融合蛋白用ddH2O稀釋106倍, 使稀釋后的估測(cè)濃度在Fish GH ELISA Kit (CUSABIO公司, 上海)檢測(cè)范圍之內(nèi), 采用競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法檢測(cè)GH含量, 按照Fish GH ELISA Kit說(shuō)明書(shū)測(cè)定GH融合蛋白濃度。

1.8 GH融合蛋白的生物活性檢測(cè)

采用MTT法檢測(cè)重組GH蛋白在細(xì)胞水平的生物活性。將純化復(fù)性的重組蛋白過(guò)濾除菌待用。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的人乳腺癌細(xì)胞MDA231以1×105/mL密度接種于96孔板(每孔200μL), 培養(yǎng)24 h后, 棄去培養(yǎng)基加入含不同濃度重組蛋白(0.49, 2, 4.9和49μg/mL)的新鮮培養(yǎng)基, 并設(shè)空白對(duì)照組, 每組設(shè)4個(gè)平行,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后, 棄上清, 每孔加入90μL新鮮培養(yǎng)液, 再加入10μL MTT (Sigma)溶液, 繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄上清, 每孔加入100μL二甲基亞砜(DMSO)搖床低速震蕩10 min, 使晶體物充分溶解, 酶標(biāo)檢測(cè)儀570 nm波長(zhǎng)處讀取各樣品的光密度值。細(xì)胞增殖率(GSR)計(jì)算方法為: GSR (%control) = Asample / Acontrol×100, Asample為加入重組蛋白組, Acontrol為未加重組蛋白組。

1.9 數(shù)據(jù)處理

本研究所有數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Means±S.D.)表示, 以SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差(ANOVA)分析, 設(shè)置差異顯著性水平P=0.05, 當(dāng)P<0.05時(shí)視為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 半滑舌鰨GH成熟肽的克隆

RT-PCR擴(kuò)增腦垂體cDNA后, PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、測(cè)序, 得到與NCBI上相一致的長(zhǎng)552bp的半滑舌鰨GH成熟肽序列, 其編碼183個(gè)氨基酸, 含四個(gè)半胱氨酸(Cys), 可形成兩個(gè)二硫鍵, 且在成熟肽兩端酶切位點(diǎn)加入正確, 可用于重組載體構(gòu)建。

2.2 GH/PET28a重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將正確克隆的GH成熟肽序列插入到原核表達(dá)質(zhì)粒PET-28a上, 得到重組質(zhì)粒GH/PET28a (圖1),GH/PET28a重組質(zhì)粒編碼重組蛋白的序列(csGH)長(zhǎng)681bp, 在T7啟動(dòng)子的作用下, 由起始密碼子ATG開(kāi)始編碼重組蛋白, 到終止密碼子TAA停止, 所編碼的GH融合蛋白26 kDa, 等電點(diǎn)為7.77, 由227個(gè)氨基酸組成, 其中包括GH成熟肽和N端的6×His標(biāo)簽, 可進(jìn)行誘導(dǎo)和蛋白純化。

圖1 GH/pET28a質(zhì)粒的構(gòu)建Fig.1 Construction of the recombinant expression plasmid GH/pET28a

2.3 重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達(dá)

將重組質(zhì)粒GH/PET28a轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá), 以未加誘導(dǎo)劑的重組菌為陰性對(duì)照。SDS-PAGE電泳顯示, 在20.1 kDa和29 kDa之間出現(xiàn)特異性條帶, 分子大小為26 kDa, 與預(yù)期結(jié)果一致(圖2), 說(shuō)明GH融合蛋白成功表達(dá)。

圖2 半滑舌鰨重組GH/pET28a表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis on GH/PET28a fusion protein of C.semilaevis

不同溫度誘導(dǎo)條件下獲得的GH融合蛋白表達(dá)量不同。由圖3可知, 與18°C和28°C相比, 37°C溫度下蛋白表達(dá)量較高, 結(jié)果顯示誘導(dǎo)4 h時(shí)GH融合蛋白表達(dá)量達(dá)到最大(圖2和圖4), 占菌體總蛋白的41.5%, 此后蛋白表達(dá)量并不隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,可知GH重組菌在37°C條件下以IPTG (1 mmol/L)誘導(dǎo)4 h GH融合蛋白可達(dá)到最佳誘導(dǎo)效果。

2.4 IGF-Ⅱ融合蛋白的western-blotting驗(yàn)證

圖3 不同溫度下重組GH/pET28a表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis on GH/PET28a fusion protein at different temperatures

圖4 不同誘導(dǎo)時(shí)間下GH融合蛋白的表達(dá)量Fig.4 Expression percentage of GH fusion protein in different induction time

采用western-blotting免疫印跡方法對(duì)誘導(dǎo)4 h的重組菌進(jìn)行檢測(cè), DAB顯色后, PVDF膜上在標(biāo)記位置可見(jiàn)單一清晰印跡(圖5), 說(shuō)明重組菌表達(dá)了融合蛋白, 且能特異性的被6×His抗體識(shí)別, 驗(yàn)證了半滑舌鰨GH融合蛋白表達(dá)成功。

圖5 GH融合蛋白的western-blotting驗(yàn)證Fig.5 Western-blotting analysis on recombinant IGF-I protein

2.5 GH融合蛋白的ELISA測(cè)定

通過(guò)Pierce BCA蛋白定量分析試劑盒測(cè)得純化后的GH融合蛋白濃度為490μg/mL, 將融合蛋白稀釋106倍后, 采用競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測(cè)GH融合蛋白濃度, 結(jié)果顯示重組GH融合蛋白可與魚(yú)類生物素標(biāo)記GH發(fā)生抗體競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng), 測(cè)得稀釋后重組GH融合蛋白濃度為502 pg/mL, 與BCA蛋白定量分析試劑盒測(cè)定結(jié)果基本一致, 可推斷重組半滑舌鰨GH融合蛋白與其它魚(yú)類GH具有相似的免疫活性。

2.6 GH融合蛋白的生物活性檢測(cè)

以MTT法來(lái)檢測(cè)不同濃度的重組GH融合蛋白對(duì)MDA231乳腺癌細(xì)胞增殖的影響, 結(jié)果如圖6所示。各濃度組重組GH均未見(jiàn)明顯的細(xì)胞增殖效果,自2μg/mL開(kāi)始, 重組GH對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)具有一定的抑制作用, 而以49μg/mL濃度組最為明顯(P<0.01)。

圖6 重組GH融合蛋白生物活性分析Fig.6 Bioactivity of recombinant GH protein of C. semilaevis

3 討論

本研究選擇了大腸桿菌BL21(DE3)作為宿主菌,大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有遺傳背景清楚、工藝簡(jiǎn)單、產(chǎn)量高和生產(chǎn)成本低等特點(diǎn), 而且也是目前研究最成熟的表達(dá)體系, 大腸桿菌雖缺少蛋白翻譯后的修飾加工機(jī)制, 但魚(yú)類GH翻譯后無(wú)需糖基化修飾, 而且只含有兩個(gè)二硫鍵, 容易復(fù)性, 因此大腸桿菌是表達(dá)魚(yú)類GH的理想載體。研究選用pET-28a為表達(dá)載體,以T7 RNA聚合酶啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄, 能轉(zhuǎn)移識(shí)別T7強(qiáng)啟動(dòng)子, 具有比大腸桿菌RNA聚合酶高出數(shù)倍的轉(zhuǎn)錄效率。表達(dá)的蛋白為融合蛋白, N-末端含有His-Tag標(biāo)簽, 便于后期的分離純化。

本研究構(gòu)建的半滑舌鰨GH/pET28a重組質(zhì)粒在原核表達(dá)載體BL21(DE3)中成功表達(dá)出分子量約26kDa的GH融合蛋白, 融合蛋白表達(dá)量較高, 占細(xì)菌總蛋白的41.5%。馬騫等(2012)使用pET-32a載體成功表達(dá)出了GH融合蛋白, 其在表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建過(guò)程中未將GH基因信號(hào)肽部分切除, 所以表達(dá)的GH融合多肽含有半滑舌鰨GH基因的完整ORF序列, 融合蛋白分子量約40kDa, 表達(dá)量占細(xì)菌總蛋白的37.6%,但未開(kāi)展融合蛋白純化和活性檢測(cè)工作。信號(hào)肽的存在對(duì)基因的原核表達(dá)存在一定的影響(龔婷等, 2009),真核生物的信號(hào)肽在原核生物(如大腸桿菌)中表達(dá)時(shí)大部分不具有分泌功能, 而且始終與活性蛋白融合在一起, 影響活性蛋白的正確折疊與功能發(fā)揮, 因此本研究在構(gòu)建半滑舌鰨GH/pET28a重組質(zhì)粒時(shí), 將GH基因ORF中的信號(hào)肽部分切除, 提高了表達(dá)水平,將表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了純化和復(fù)性, 并對(duì)純化復(fù)性后的GH融合蛋白的活性進(jìn)行了初步研究, 為進(jìn)一步研究GH蛋白的作用和作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

純化和復(fù)性后的半滑舌鰨GH融合蛋白的ELISA測(cè)定結(jié)果顯示其與魚(yú)類GH具有相同的抗原活性, 表明體外重組表達(dá)的半滑舌鰨GH融合蛋白具有免疫活性。利用細(xì)胞增殖試驗(yàn)驗(yàn)證其生物學(xué)活性時(shí), 發(fā)現(xiàn)重組半滑舌鰨GH蛋白對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MDA231無(wú)增殖效果, 而在高濃度才有顯著的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制效果,因此無(wú)法斷定其是否具有細(xì)胞水平的生物學(xué)活性,也同時(shí)說(shuō)明獲得的GH融合蛋白的生長(zhǎng)調(diào)控作用不是通過(guò)直接作用于細(xì)胞實(shí)現(xiàn), 可能是通過(guò)旁分泌的途徑進(jìn)行。養(yǎng)殖生產(chǎn)實(shí)踐中, 有關(guān)GH的促生長(zhǎng)作用,白俊杰等(1999)直接將基因重組的鯉魚(yú)GH 添加到飼料中投喂羅非魚(yú), 證實(shí)有明顯的促生長(zhǎng)作用, Jeh等(1998)將通過(guò)大腸桿菌重組表達(dá)的牙鲆GH蛋白作為飼料添加劑投喂牙鲆幼苗, 促生長(zhǎng)效果明顯。因此,今后本實(shí)驗(yàn)室將繼續(xù)開(kāi)展重組半滑舌鰨GH融合蛋白對(duì)半滑舌鰨幼魚(yú)生長(zhǎng)調(diào)控作用的相關(guān)實(shí)驗(yàn), 以驗(yàn)證體外重組GH融合蛋白對(duì)半滑舌鰨的促生長(zhǎng)效果。

原核表達(dá)系統(tǒng)中目的蛋白的表達(dá)量受多種因素影響, 如重組菌濃度、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)劑濃度等, 本研究中對(duì)對(duì)GH融合蛋白的最適誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行了探討, 結(jié)果顯示低溫時(shí)可產(chǎn)生少量可溶性蛋白, 但融合蛋白含量較低, 純化效果較差,37°C時(shí)蛋白表達(dá)量最大, 主要以包涵體形式存在, 雖然需要增加復(fù)性步驟, 但純化過(guò)程較容易, 得到的融合蛋白較多, 為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了條件。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加, 蛋白表達(dá)量逐漸增加, 到達(dá)4 h時(shí)達(dá)到最大,再增加誘導(dǎo)時(shí)間蛋白表達(dá)量并不隨之增加, 推測(cè)其原因可能有兩個(gè)方面: 一方面BL21(DE3)雖然為蛋白酶缺陷菌株, 誘導(dǎo)時(shí)間過(guò)長(zhǎng), 隨著細(xì)菌的代謝產(chǎn)物增加, 插入的外源蛋白仍不可避免會(huì)遭受宿主的降解, 從而不利于表達(dá)蛋白的收獲; 另一方面可能胞體內(nèi)不斷積累的外源蛋白包涵體對(duì)宿主菌產(chǎn)生毒素效應(yīng), 從而限制了蛋白的積累。

實(shí)驗(yàn)條件下原核表達(dá)系統(tǒng)有很多優(yōu)勢(shì), 如工藝簡(jiǎn)單、產(chǎn)量高、生產(chǎn)成本低等, 但將其應(yīng)用與生產(chǎn)實(shí)踐時(shí)就體現(xiàn)出很大的局限性, 如需進(jìn)行蛋白純化和生物活性恢復(fù), 后續(xù)工作比較繁瑣, 在大規(guī)模生產(chǎn)方面酵母表達(dá)系統(tǒng)更有優(yōu)勢(shì), 因此半滑舌鰨GH真核表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建將成為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的重點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為半滑舌鰨GH重組蛋白在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

馬 進(jìn), 白俊杰, 簡(jiǎn) 清等, 2001. 重組虹鱒生長(zhǎng)激素酵母對(duì)羅非魚(yú)的促生長(zhǎng)作用研究. 大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào), 16(3):219—222

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