太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)擔(dān)輪幼蟲的超低溫保存研究*

韓龍江 劉清華 紀(jì)利芹 溫海深① 黃 雯 張國范 李 軍①

(1. 中國科學(xué)院海洋研究所 青島 266071; 2. 中國海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 青島 266003; 3. 中國科學(xué)院大學(xué) 北京 100049)

自Ploges(1949)發(fā)現(xiàn)甘油在細(xì)胞低溫保存中有抗凍作用后, 生物細(xì)胞和組織的低溫冷凍保存研究迅速展開, 形成了一門新興學(xué)科—低溫生物學(xué)(cryobiology)。低溫生物學(xué)主要是研究在超低溫(-196°C)條件下生物的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化等生命現(xiàn)象的變化規(guī)律以及細(xì)胞、組織、器官乃至整個生物體活性保存的一門邊緣學(xué)科, 其在貝類配子和胚胎冷凍保存中應(yīng)用較為廣泛。有關(guān)海產(chǎn)貝類精子的低溫冷凍保存, 自20世紀(jì)70年代初就有報道, 目前在牡蠣、鮑魚等經(jīng)濟(jì)貝類上已有陸續(xù)開展, 其中在一些海產(chǎn)貝類的精子保存中取得了比較好的效果, 如Smith等(2001)研究了長牡蠣(Crassostrea gigas)的精子、卵和胚胎的低溫冷凍保存。Yang等(2012)在弗吉尼亞牡蠣(Crassostrea virginica)精子冷凍中發(fā)現(xiàn), 以無鈣Hank’s液作為稀釋液時, 10%的DMSO(二甲基亞砜)和PG(丙二醇)對精子冷凍保存效果最好。Adams等(2004)發(fā)現(xiàn)添加有0.45mol/L海藻糖的DMSO對太平洋牡蠣精液冷凍效果較好。從20世紀(jì)90年代開始,我國學(xué)者對重要海水養(yǎng)殖貝類, 如太平洋牡蠣(Crassostrea gigas) (李赟等, 2002)、香港牡蠣(Crassostreahongkongensis) (丁兆坤等, 2013)、櫛孔扇貝(Chlamys Farreri) (李純等, 2000)、九孔鮑(Haliotis diversicolor)(蔡明夷等, 2008)等進(jìn)行了精子超低溫保存研究, 先后建立了10多種海洋貝類的精子冷凍保存技術(shù), 將冷凍精子技術(shù)進(jìn)行了推廣和應(yīng)用, 對凍精生理活性、結(jié)構(gòu)及功能、遺傳穩(wěn)定性等方面進(jìn)行了初步探討(李赟等, 2002)。過去20多年貝類精子超低溫保存研究工作的積累, 為今后太平洋牡蠣胚胎冷凍保存技術(shù)的建立和應(yīng)用以及低溫?fù)p傷機(jī)理的系統(tǒng)研究奠定了良好的科研基礎(chǔ)(張巖等, 2004)。貝類胚胎的保存特別是對于牡蠣早期幼蟲的超低溫保存技術(shù)的研究已有二十多年的歷史, 如Renard(1991)、Chao等(1994,1997)率先開展了對牡蠣胚胎的冷凍保存研究。隨后Gwo(1995)、Smith等(2001)、Paniagua等(2001)、Choi等(2003)等陸續(xù)開展了超低溫保存牡蠣幼蟲的相關(guān)研究, 并取得了較好的效果。

貝類配子、胚胎是海水養(yǎng)殖生產(chǎn)、優(yōu)良品種培育、及海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要物質(zhì)基礎(chǔ), 隨著海水養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展, 貝類種質(zhì)保護(hù)嚴(yán)重滯后的負(fù)面效應(yīng)越來越嚴(yán)重。忽視貝類種質(zhì)保護(hù)及品種選育工作會造成貝類種質(zhì)退化、生長速度減緩、對病害和環(huán)境脅迫的防御能力降低, 從而導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失, 因此優(yōu)良貝類種質(zhì)保存已成為我國海水養(yǎng)殖業(yè)中亟待攻克的重要問題。開展貝類種質(zhì)的超低溫冷凍保存技術(shù)的研究、建立健全我國貝類種質(zhì)庫對于維持我國貝類種質(zhì)資源的穩(wěn)定、保護(hù)貝類遺傳多樣性、開展貝類遺傳改良和生物技術(shù)育種都具有重要的意義(孫振興等, 2005; 于海濤, 2004)。本實(shí)驗(yàn)測定了不同濃度抗凍保護(hù)劑對太平洋牡蠣擔(dān)輪幼蟲的毒性作用及其冷凍保存的影響, 采用程序降溫儀來嚴(yán)格控制降溫速率;借助計(jì)算機(jī)輔助分析系統(tǒng)采集圖像視頻, 測定了不同抗凍保護(hù)劑在三種濃度下對太平洋牡蠣擔(dān)輪幼蟲的毒性并篩選出了一種太平洋牡蠣擔(dān)輪幼蟲的冷凍保存方法, 結(jié)果可靠穩(wěn)定, 對貝類種質(zhì)保存具有重要的借鑒作用。

1 材料與方法

1.1 太平洋牡蠣擔(dān)輪幼蟲的采集

實(shí)驗(yàn)所用的太平洋牡蠣于性成熟季節(jié)(2013年7月)購自青島嶗東海珍品良種培育有限公司, 殼高9.0—11.2cm, 殼寬5.5—6.0cm, 數(shù)量120只。暫養(yǎng)于中國科學(xué)院海洋研究所海洋貝類增養(yǎng)殖與生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室100L水族箱內(nèi), 暫養(yǎng)期間水溫16—18°C, 每天換水一次。實(shí)驗(yàn)時選擇性腺飽滿的牡蠣, 解剖后取精液與卵子, 按精卵比80∶1混合于20°C過濾海水(混合前卵子在過濾海水中活化30min, 精液在過濾海水中活化5min), 2h后取受精卵(100個以上)統(tǒng)計(jì)受精率, 然后轉(zhuǎn)移進(jìn)50L塑料桶繼續(xù)培養(yǎng), 混合14h后統(tǒng)計(jì)孵化率。顯微鏡觀察大約14h后太平洋牡蠣胚胎進(jìn)入擔(dān)輪幼蟲期, 開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將發(fā)育到擔(dān)輪期的太平洋牡蠣幼蟲用200目的篩絹過濾濃縮, 裝入50mL的離心管中備用, 選取6種不同的抗凍保護(hù)劑PG(丙二醇)、DMSO(二甲基亞砜)、EG(乙二醇)、GLY(甘油)、MeOH(甲醇)、DMA(二甲基乙酰胺)與混有濃縮過太平洋牡蠣擔(dān)輪幼蟲的天然海水配成三個不同的濃度(5%、10%、15%), 置于4°C冰箱預(yù)冷20min后檢測太平洋牡蠣擔(dān)輪幼蟲活力作為抗凍保護(hù)劑毒性實(shí)驗(yàn)指標(biāo); 將不同濃度抗凍保護(hù)劑中的太平洋牡蠣擔(dān)輪幼蟲吸入0.25mL的麥管中(法國IMV卡蘇公司), 封口粉封口后置于4°C冰箱中平衡20min, 待抗凍保護(hù)劑充分滲入擔(dān)輪幼蟲體內(nèi)后立即放入程序降溫儀中(型號Kryo-360-1.7), 采用分步降溫程序降溫: -1°C/min的降溫速率從0°C降至-15°C, 平衡5min后再以-3°C/min的降溫速率降至-40°C, 平衡2min, 以-15°C/min降至-80°C后以-20°C/min降至-180°C后直接投入液氮中保存。每一實(shí)驗(yàn)組設(shè)三個平行, 實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.3 太平洋牡蠣擔(dān)輪幼蟲活力測定

抗凍保護(hù)劑毒性實(shí)驗(yàn)中太平洋牡蠣擔(dān)輪幼蟲活力的測定: 用移液槍吸取100μL的海水于干凈載玻片上, 吸取5μL擔(dān)輪幼蟲加入其中, 混勻, 顯微鏡檢測活力, 采用計(jì)算機(jī)輔助精子分析(computer-assisted sperm analysis, CASA)系統(tǒng)隨機(jī)取三個視野采集太平洋牡蠣擔(dān)輪幼蟲運(yùn)動狀態(tài)的視頻文件, 統(tǒng)計(jì)運(yùn)動率。

超低溫保存實(shí)驗(yàn)中太平洋牡蠣擔(dān)輪幼蟲活力的測定: 太平洋牡蠣擔(dān)輪幼蟲在液氮中保存2周后取出,將存有太平洋牡蠣擔(dān)輪幼蟲的麥管直接放入28°C水浴中解凍5—10s, 觀察到麥管內(nèi)液體呈透明狀后立即取出, 用剪刀剪開兩端待里面的液體完全流到載玻片上, 置于顯微鏡下觀察, 采用CASA系統(tǒng)隨機(jī)取三個視野采集太平洋牡蠣擔(dān)輪幼蟲運(yùn)動狀態(tài)的視頻文件, 統(tǒng)計(jì)運(yùn)動率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計(jì)所得的數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)并采用Duncan氏進(jìn)行多重范圍比較分析,P<0.05表示顯著差異, 所有結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度及種類的抗凍保護(hù)劑對太平洋牡蠣擔(dān)輪幼蟲的毒性作用

不同濃度及種類的抗凍保護(hù)劑對太平洋牡蠣擔(dān)輪幼蟲毒性作用見圖1。當(dāng)抗凍保護(hù)劑濃度為5%(v/v)時, GLY、DMSO、PG和EG四組抗凍保護(hù)劑中擔(dān)輪幼蟲的運(yùn)動率均在93%以上(94.50%±1.32%、93.17%±0.76%、93.00%±1.00%), 且差異不顯著(P>0.05), 但均顯著高于DMA組89.50%±2.50%(P>0.05), 說明這四種抗凍保護(hù)劑對太平洋牡蠣擔(dān)輪幼蟲的毒性較小; MeOH組運(yùn)動率最低, 僅為83.50%±1.50%, 顯著低于其他抗凍保護(hù)劑種類(P<0.05), 毒性作用最強(qiáng)。當(dāng)抗凍保護(hù)劑濃度10%(v/v)時, GLY、DMSO、EG和MeOH運(yùn)動率分別達(dá)到89.67%±2.52%、80.33%±5.51%、86.5%±0.50%、80.00%±2.00%, 各組之間差異不顯著(P>0.05), 說明10%濃度下GLY、DMSO、EG和MeOH對太平洋牡蠣擔(dān)輪幼蟲的毒性較小; 其次為PG組, 運(yùn)動率達(dá)到68.33%±16.04%, 顯著高于DMA組33.17%±5.62%,(P<0.05), 但與DMSO、MeOH組差異不顯著。當(dāng)抗凍保護(hù)劑濃度15%(v/v)時, GLY對太平洋牡蠣擔(dān)輪幼蟲的毒性較小, 運(yùn)動率達(dá)到77.00%±2.00%, 與DMSO組73.67%±1.53%差異不顯著(P>0.05), EG組次之, 運(yùn)動率達(dá)到76.67%±3.51%, 與PG組32.13%±2.60%、MeOH組27.93%±2.32%差異不顯著(P>0.05),而DMA組在該濃度下, 沒有擔(dān)輪幼蟲存活。

圖1 抗凍保護(hù)劑濃度及種類對太平洋牡蠣擔(dān)輪幼蟲的毒性作用Fig.1 The effect of different antifreeze protectants and concentration on trochophore larvae of Crassostrea gigas

由圖1可以看出, 同一種抗凍保護(hù)劑隨著其濃度上升, 對太平洋牡蠣擔(dān)輪幼蟲的毒性逐漸增大。六種不同的抗凍保護(hù)劑在5%(v/v)濃度時, 對擔(dān)輪幼蟲的毒性作用最小, 與10%、15%(v/v)濃度差異顯著(P<0.05)。GLY、EG、DMA、MeOH在10%濃度下的擔(dān)輪幼蟲運(yùn)動率與其在15%濃度下差異顯著(P<0.05), 而DMSO、PG在這兩種濃度條件下差異不顯著(P>0.05)。

2.2 抗凍保護(hù)劑濃度及種類對太平洋牡蠣擔(dān)輪幼蟲超低溫保存的影響

不同的抗凍保護(hù)劑濃度及種類對太平洋牡蠣擔(dān)輪幼蟲超低溫保存的影響見圖2。當(dāng)抗凍保護(hù)劑濃度為5%時, GLY、DMSO、PG、EG、DMA、MeOH組解凍后擔(dān)輪幼蟲的運(yùn)動率分別達(dá)到59.67%±4.51%、32.33%±4.16%、13.33%±4.51%、24.33%±2.52%、3.67%±2.08%、0%, 且各組間差異顯著(P<0.05)。當(dāng)抗凍保護(hù)劑濃度為10%時, DMSO組擔(dān)輪幼蟲解凍后的運(yùn)動率達(dá)到最高值73.00%±2.00%, 顯著高于與其他抗凍保護(hù)劑中的擔(dān)輪幼蟲的運(yùn)動率(P<0.05); GLY組次之, 解凍后擔(dān)輪幼蟲運(yùn)動率達(dá)到56.00%±5.29%,顯著高于PG、EG組解凍后擔(dān)輪幼蟲運(yùn)動率(P<0.05);PG組解凍后擔(dān)輪幼蟲運(yùn)動率21.33%±4.51%與EG組解凍后擔(dān)輪幼蟲運(yùn)動率25.33%±3.51%差異不顯著(P>0.05)。當(dāng)抗凍保護(hù)劑濃度為15%時, GLY、DMSO、PG、EG組解凍后擔(dān)輪幼蟲的運(yùn)動率分別達(dá)到62.33%±2.52%、12.23%±1.17%、9.3%±1.67%、25.17%±1.76%, 且各組間差異顯著(P<0.05); DMA、MeOH組解凍后沒有擔(dān)輪幼蟲存活。

圖2 抗凍保護(hù)劑濃度及種類對太平洋牡蠣擔(dān)輪幼蟲冷凍保存的影響Fig.2 The effect of different antifreeze protectants and concentration on trochophore larvae cryopreservation of Crassostrea gigas

由圖2可以看出, 當(dāng)抗凍保護(hù)劑為GLY時, 5%、10%、15%濃度下?lián)営紫x解凍后運(yùn)動率較高, 分別為59.67%±4.51%、56.00%±5.29%、62.33%±2.52%, 各濃度間差異不顯著(P>0.05), 當(dāng)抗凍保護(hù)劑為DMSO、PG、EG時, 隨著抗凍保護(hù)劑濃度的上升, 對太平洋牡蠣擔(dān)輪幼蟲冷凍解凍后的運(yùn)動率呈現(xiàn)先上升后下降趨勢。其中DMSO組三種不同濃度條件下?lián)営紫x解凍后的運(yùn)動率差異顯著(P<0.05), 10%濃度下解凍后運(yùn)動率達(dá)到最大值73.00%±2.00%, 顯著高于其5%濃度下32.33%±4.16%、10%濃度下12.23%±1.17%的解凍后運(yùn)動率(P<0.05)。PG組在10%濃度下解凍后擔(dān)輪幼蟲運(yùn)動率達(dá)到最大值21.33%±4.51%, 顯著高于其5%濃度下和10%濃度下?lián)営紫x解凍后運(yùn)動率(P<0.05), 其5%濃度下運(yùn)動率32.33%±4.16%和15%濃度下運(yùn)動率12.23%±1.17%差異不顯著(P>0.05)。EG組在5%、10%、15%濃度下?lián)営紫x解凍后運(yùn)動率差異不顯著(P>0.05), 分別為24.33%±2.52%、25.33%±3.51%、25.17%±1.76%?？傊? 在不同抗凍保護(hù)劑及不同濃度下, 10%DMSO作為抗凍保護(hù)劑對太平洋牡蠣擔(dān)輪幼蟲的保護(hù)作用最好, GLY次之。

2.3 太平洋牡蠣擔(dān)輪幼蟲超低溫保存方法的篩選

不同抗凍保護(hù)劑在其最優(yōu)濃度下對太平洋牡蠣擔(dān)輪幼蟲解凍后運(yùn)動率的影響見圖3。DMSO在10%濃度下解凍后擔(dān)輪幼蟲的運(yùn)動率達(dá)到最大值73.00%±2.00%, 顯著高于其他各抗凍保護(hù)劑最優(yōu)濃度下?lián)営紫x解凍后的運(yùn)動率(P<0.05); 15%GLY組次之, 解凍后運(yùn)動率達(dá)到62.33%±2.52%, 顯著高于10%PG、10%EG、5%DMA組解凍后擔(dān)輪幼蟲運(yùn)動率(P<0.05); 10%PG、10%EG組解凍后擔(dān)輪幼蟲運(yùn)動率分別達(dá)到21.33%±4.51%、25.33%±3.51%, 差異不顯著(P>0.05); 5%DMA組解凍后擔(dān)輪幼蟲運(yùn)動率為3.67%±2.08%, 顯著低于其他實(shí)驗(yàn)組(P<0.05)。

圖3 抗凍保護(hù)劑種類濃度對太平洋牡蠣精液保存效果的影響Fig.3 The effect of different antifreeze protectants and concentration on trochophore larvae cryopreservation of Crassostrea gigas

3 討論

3.1 抗凍保護(hù)劑種類和濃度對太平洋牡蠣擔(dān)輪幼蟲的毒性作用

抗凍保護(hù)劑多為滲透性的小分子物質(zhì), 主要通過滲入細(xì)胞內(nèi)部, 發(fā)生水合作用, 使細(xì)胞內(nèi)溶液的黏性增加, 從而保護(hù)細(xì)胞不受冷凍損傷。不同的抗凍保護(hù)劑由于其種類、濃度、分子大小、滲透能力、水活性及胞內(nèi)作用機(jī)理等各不相同, 對細(xì)胞冷凍保存效果亦有差異。隨著抗凍液濃度的增加, 滲入細(xì)胞內(nèi)的抗凍保護(hù)劑隨之增多, 由于抗凍液本身具有毒性, 濃度太高會在降溫前殺死細(xì)胞, 而濃度過低又起不到對細(xì)胞的保護(hù)作用, 所以冷凍保護(hù)劑應(yīng)該選擇無毒性或者毒性低、易滲透進(jìn)細(xì)胞膜、并能很好地與細(xì)胞液或與水分子結(jié)合的物質(zhì)(Smithet al, 2001)。貝類配子和胚胎保存中常用的抗凍保護(hù)劑有GLY、DMSO、PG、EG、MeOH、MDA等, 雖然抗凍保護(hù)劑是牡蠣幼蟲冷凍過程中必不可少的, 但其毒性可能會導(dǎo)致幼蟲在預(yù)處理和解凍后死亡。例如, Chao等(1994)在驗(yàn)證DMSO、EG、PG對牡蠣胚胎的毒性時發(fā)現(xiàn), 早期胚胎更容易受高濃度(4—5mol/L)抗凍保護(hù)劑的影響, 添加海藻糖或葡萄糖能夠顯著降低抗凍保護(hù)劑對牡蠣幼蟲的毒性; Nascimento等(2005)發(fā)現(xiàn),DMSO、MeOH對牡蠣幼蟲在平衡10—30min時的毒性無顯著差異, 而PG對牡蠣幼蟲平衡時間越長, 毒性作用越大。本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度的不同抗凍保護(hù)劑,對太平洋牡蠣擔(dān)輪幼蟲進(jìn)行抗凍保護(hù)劑毒性實(shí)驗(yàn)證明, 不同抗凍保護(hù)劑對太平洋牡蠣擔(dān)輪幼蟲的毒性作用不同。在相同平衡時間(20min)條件下, 太平洋牡蠣擔(dān)輪幼蟲毒性實(shí)驗(yàn)說明: 隨著抗凍保護(hù)劑濃度的升高, 其對太平洋牡蠣擔(dān)輪幼蟲的毒性呈現(xiàn)逐漸增大趨勢; 在較低的5%濃度下, GLY、DMSO、PG、EG對太平洋牡蠣的毒性作用最小; 在10%濃度下,GLY、DMSO、EG、MeOH對太平洋牡蠣擔(dān)輪幼蟲的毒性作用較小; 而在15%較高濃度下, GLY、DMSO對太平洋牡蠣擔(dān)輪幼蟲的毒性作用最小。綜合分析可知, GLY、DMSO在太平洋牡蠣擔(dān)輪幼蟲冷凍保存中的效果最好, 這是由于GLY具有良好吸水性并能自由通過細(xì)胞膜, 有利于保持細(xì)胞水分、穩(wěn)定滲透壓,在海水中添加一定量的GLY會使海水的黏性增強(qiáng)、熱傳導(dǎo)加快、可調(diào)節(jié)細(xì)胞脫水并保護(hù)蛋白結(jié)構(gòu), 而且在高濃度下可以誘發(fā)膜融合。DMSO作為抗凍保護(hù)劑,具有滲透速度快、分布均勻、毒性低、且可以通過抑制過氧化氫酶的活性達(dá)到降低冷凍損傷的效果。而PG的抗凍保護(hù)作用是通過降低水相的極性從而改變細(xì)胞膜和水相之間的疏水性分子的分區(qū), 可能會導(dǎo)致脫磷脂雙分子層破壞從而降低抗凍效果。MeOH、DMA對細(xì)胞膜具有高度滲透性, 因此其毒性較大,高濃度下其冷凍效果較差。綜上所述, GLY、DMSO在不同濃度下的抗凍效果整體高于其他抗凍保護(hù)劑,但在較高濃度下使用時其對配子、細(xì)胞的毒性作用也可能會超過其抗凍保護(hù)作用。因此, 在慢速降溫冷凍保存太平洋牡蠣擔(dān)輪幼蟲時, 抗凍保護(hù)劑的濃度一般不應(yīng)大于15%。

3.2 太平洋牡蠣擔(dān)輪幼蟲的超低溫保存

滲透性抗凍保護(hù)劑通過滲透進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部, 增加細(xì)胞質(zhì)的粘滯度從而降低冰點(diǎn)達(dá)到對細(xì)胞的保護(hù)作用?？箖霰Ｗo(hù)劑由于其種類和濃度不同, 對細(xì)胞的保護(hù)亦有所差異: 例如Renard等(1991)發(fā)現(xiàn)無抗凍保護(hù)劑冷凍保存牡蠣胚胎, 冷凍保存效果差; 當(dāng)用0.5mol/L MeOH+0.5mol/L蔗糖作為抗凍保護(hù)劑, 有近一半的牡蠣胚胎存活。胚胎發(fā)育的不同時期, 對冷凍效果有顯著影響(王鵬飛等, 2008)。Gwo等(1995)發(fā)現(xiàn), 太平洋牡蠣擔(dān)輪幼蟲期較2-8細(xì)胞期及原腸胚期冷凍保存效果好, 當(dāng)抗凍保護(hù)劑為10%PG時, 太平洋牡蠣胚胎的冷凍保存效果最好。Chao等(1997)發(fā)現(xiàn), 采用慢速降溫法冷凍保存牡蠣、文蛤的胚胎和初孵幼蟲, 當(dāng)抗凍保護(hù)劑為2mol/L DMSO+0.06mol/L海藻糖時, 可以獲得較高的成活率。Paniagua等(2001)發(fā)現(xiàn), 在-2.5°C/min的慢速降溫速率下冷凍保存美國東部牡蠣(Crassostrea virginica)擔(dān)輪幼蟲, 10%、15%濃度的PG有較好的保存效果。Choi等(2003)發(fā)現(xiàn), 采用0.2mol/L的葡萄糖或蔗糖, 以-1°C/min的慢速降溫速率冷凍保存D形幼蟲, 保存效果最好。在了解凍存過程中細(xì)胞滲透壓的特性、細(xì)胞內(nèi)冰晶形成的特點(diǎn)、以及胚胎對抗凍保護(hù)劑毒性耐受等理論的基礎(chǔ)上,本研究設(shè)計(jì)了太平洋牡蠣擔(dān)輪幼蟲超低溫冷凍保存實(shí)驗(yàn)并在上述實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上優(yōu)化了傳統(tǒng)的牡蠣胚胎兩步冷凍保存冷凍方法。結(jié)果表明: 凍存的太平洋牡蠣擔(dān)輪幼蟲的運(yùn)動率隨著抗凍保護(hù)劑濃度的上升呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢, 低濃度的抗凍保護(hù)劑由于其滲透保護(hù)作用差, 解凍后擔(dān)輪幼蟲的運(yùn)動率低; 隨著抗凍保護(hù)劑濃度的升高, 擔(dān)輪幼蟲的運(yùn)動率有增大趨勢; 但在較高濃度下, 抗凍保護(hù)劑毒性隨之增大,擔(dān)輪幼蟲的運(yùn)動率降低。由于抗凍保護(hù)劑對太平洋牡蠣擔(dān)輪幼蟲冷凍保存的作用具有兩面性, 需要篩選出一個適宜濃度, 既能起到良好的抗凍保護(hù)作用, 又不會導(dǎo)致幼蟲細(xì)胞的損傷(Brocket al, 2001)。結(jié)果顯示, 濃度為10%的DMSO對太平洋牡蠣擔(dān)輪幼蟲的冷凍保護(hù)作用最好。太平洋牡蠣在胚胎后期擔(dān)輪幼蟲階段(18°C水溫條件下, 受精后12h)以10%(v/v)DMSO作為抗凍保護(hù)劑, 采用分步降溫程序降溫(-1°C/min的降溫速率從0°C降至-15°C, 平衡5min后再以-3°C/min的降溫速率降至-40°C, 平衡2min,以-15°C/min降至-80°C后以-20°C/min降至-180°C)后直接投入液氮中保存, 然后將胚胎置于28°C水浴解凍后放入海水中, 計(jì)算機(jī)精子輔助分析(CASA)測得平均運(yùn)動率達(dá)73.00%±2.00%, 運(yùn)動率較高, 證明10%DMSO作為冷凍保護(hù)劑其毒性低、易滲透進(jìn)細(xì)胞膜、并能很好地與細(xì)胞液結(jié)合保護(hù)胚胎不受損傷。改進(jìn)后的慢速分步降溫法, 既能使牡蠣幼蟲細(xì)胞較快地度過結(jié)晶危險區(qū)(0—-40°C), 又不會使幼蟲細(xì)胞造成較大損害。本實(shí)驗(yàn)中抗凍保護(hù)劑及慢速分步降溫方法的篩選, 為進(jìn)一步提高牡蠣胚胎凍存的質(zhì)量提供了理論依據(jù)。目前貝類精子冷凍保存技術(shù)研究開展的較多, 并達(dá)到了可應(yīng)用的效果, 但是有關(guān)貝類擔(dān)輪幼蟲的冷凍保存技術(shù)研究在國內(nèi)還較為少見。該研究在貝類遺傳育種和生物技術(shù)等方面有一定的應(yīng)用前景, 具有較高的參考價值。

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