三疣梭子蟹HMGR基因的克隆及其在蛻皮中的表達(dá)分析*

邱錫爾 朱冬發(fā) 崔曉雨 湯 潔 謝 熙

(寧波大學(xué)海洋學(xué)院 寧波 315211)

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus), 隸屬于甲殼綱(Crustacea)、十足目(Decapoda)、梭子蟹科(Portunidae)、梭子蟹屬(Portunus)。近年來(lái)三疣梭子蟹在人工養(yǎng)殖過(guò)程中存在性早熟和蛻皮未遂等問(wèn)題,嚴(yán)重影響蟹的正常生長(zhǎng), 導(dǎo)致養(yǎng)殖效益下降(劉昌杰等, 1999)。早期幼蟹發(fā)育過(guò)快、蛻皮次數(shù)過(guò)頻是導(dǎo)致養(yǎng)殖蟹類性早熟的重要原因之一(邱高峰等, 2003)。

催化乙酰輔酶A生成甲羥戊酸是3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase, HMGR)的主要功能。因甲羥戊酸的生成不可逆, HMGR被認(rèn)為是甲羥戊酸途徑中的第一個(gè)限速酶, 是細(xì)胞質(zhì)萜類化合物合成的重要調(diào)控點(diǎn)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中, 甲羥戊酸途徑產(chǎn)生的重要產(chǎn)物是膽固醇, 調(diào)控HMGR活性可以有效控制類固醇含量 (Chenet al, 2012); 在植物細(xì)胞質(zhì)中, HMGR通過(guò)次生代謝合成的許多倍半萜和三萜類化合物具有藥理活性。昆蟲通過(guò)甲羥戊酸途徑合成保幼激素JH、聚集素和警戒素等萜類物質(zhì)。由于HMGR在甲羥戊酸途徑中的重要功能, 昆蟲、植物、哺乳動(dòng)物等許多物種的HMGR基因已見(jiàn)報(bào)道, 例如細(xì)紋豆蕪菁(Epicauta mannerheim)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)、家蠶(Bombyx mori)、高山象白蟻(Nasutitermes takasagoensis)、小家鼠(Mus musculus)、橡膠草(Taraxacum kok-saghyz)等(Getleret al, 1988; Sundaresanet al, 1989; Kinjohet al, 2007; Hojoet al, 2012;王啟超等, 2012; 姜鳴等, 2012)。但在甲殼動(dòng)物上僅見(jiàn)于美洲海鰲蝦(Homarus americanus) (Liet al, 2003;Liet al, 2004)和凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)(NCBI登錄號(hào): GU969105.1, 僅為部分序列)。

甲殼動(dòng)物通過(guò)甲羥戊酸途徑合成甲基法尼酯(Methyl farnesoate, MF)。MF是一種倍半萜類激素,在昆蟲體內(nèi)經(jīng)環(huán)氧化可生成保幼激素JHⅢ(Juvenile hormone Ⅲ, JHⅢ), HMGR是MF合成路徑初始步驟的關(guān)鍵限速酶(Katherineet al, 2011)。MF首先發(fā)現(xiàn)于蜘蛛蟹(Libinia emarginata)的血淋巴(Lauferet al,1987); 隨后的研究顯示大顎器(mandibular organ, MO)是合成和分泌甲基法尼酯的唯一器官(李勝等, 2000)。MF與甲殼動(dòng)物的生殖繁育、蛻皮、形態(tài)建成、滲透壓調(diào)節(jié)、習(xí)性和多數(shù)蛋白質(zhì)合成等生理活動(dòng)的調(diào)控有關(guān)(Sorokaet al, 2000; Lovettet al, 2001; Lauferet al,2002, 2005;), 受眼柄中多肽類激素大顎器抑制激素(Mandibular organ inhibiting stimulating hormone,MOIH)的負(fù)調(diào)控(Wainwrightet al, 1996)。

蛻皮是甲殼動(dòng)物蛻去舊的外骨骼, 個(gè)體增大后新甲殼迅速硬化為外骨骼的過(guò)程。多數(shù)研究結(jié)果表明MF能夠促進(jìn)蛻皮發(fā)生, 羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)蛻皮周期中血淋巴MF濃度和蛻皮激素濃度一樣呈周期性變化, 且早一步達(dá)到最高峰值, 說(shuō)明MF可能通過(guò)促進(jìn)蛻皮激素的合成來(lái)調(diào)控蛻皮發(fā)生(Wilderet al, 1995); 外源MF能夠促進(jìn)紅螯螯蝦(Cherax quadricarinatus)蛻皮(Abduaet al, 2001), 蛻皮前期色拉淡水蟹(Oziotelphusa senex senex)的離體大顎器較其他各期能分泌更多的MF(Nagarajuet al,2006)。

HMGR是MF合成途徑第一步中的限速酶, 對(duì)于闡明MF的作用機(jī)制來(lái)說(shuō)極具研究?jī)r(jià)值。本文研究以三疣梭子蟹(P. trituberculatus)為材料, 進(jìn)行HMGR基因全長(zhǎng)cDNA克隆、組織差異性表達(dá)以及在蛻皮周期中表達(dá)水平的變化分析。研究結(jié)果將有助于闡明甲殼動(dòng)物蛻皮的調(diào)控機(jī)制和解決養(yǎng)殖過(guò)程中遇到的蛻皮過(guò)頻和蛻皮未遂等問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 材料

取頭胸甲寬(CW)為8—12cm、體重(BW)為45—80g的野生三疣梭子蟹, 雌雄各半, 在寧波市寧海得水育苗場(chǎng)進(jìn)行暫養(yǎng)及采樣。利用形態(tài)觀察法將三疣梭子蟹蛻皮周期分為蛻皮后期(A、B期)、蛻皮間期(C期)、蛻皮前期(D0、D1、D2、D3和D4亞期)和蛻皮期(E)共四個(gè)階段(沈潔等, 2011)。解剖取C期三疣梭子蟹眼柄、心臟、肌肉、胸神經(jīng)節(jié)、精巢、卵巢、肝胰腺、鰓、MO和Y器(Y-organ, YO)用于組織表達(dá)差異分析; 采集各期(E期除外)三疣梭子蟹MO組織進(jìn)行蛻皮周期中HMGR基因表達(dá)水平變化的分析。蛻皮周期各期選取3只蟹做平行實(shí)驗(yàn), 解剖獲得的組織轉(zhuǎn)移至RNA保護(hù)液(生工生物工程(上海)有限公司)–20°C保存, 用于提取總RNA。

1.2 總RNA提取

將上述存于RNA保護(hù)液中的樣品轉(zhuǎn)移至Trizol(生工生物工程(上海)有限公司)溶液中, 按說(shuō)明書所述步驟提取各個(gè)樣品中的總RNA, 經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。提取Total RNA后, 再使用DNaseⅠ消除基因組DNA的干擾, 最后進(jìn)行苯酚/氯仿抽提、乙醇沉淀等進(jìn)行純化。

1.3 三疣梭子蟹HMGR基因的全長(zhǎng)克隆及序列分析

1.3.1 cDNA的合成 取新鮮解剖獲得的MO總RNA, 用PrimeScript RT reagent Kit (Perfect Real Time, Takara)試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到第一鏈cDNA; 用于3′-RACE擴(kuò)增的3′-RACE-cDNA以AP(表1)為接頭引物, 用與上述相同的方法反轉(zhuǎn)錄獲得; 用于5′-RACE擴(kuò)增的5′-RACE-cDNA按照SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit試劑盒說(shuō)明書合成。所有cDNA均置于–20°C下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 RT-PCR 根據(jù)已公布的甲殼動(dòng)物和昆蟲的HMGR氨基酸序列高保守區(qū)域, 利用Block Maker軟件設(shè)計(jì)兼并引物HMGR-F和HMGR-R(表1)。以第一鏈cDNA為模板, HMGR-F和HMGR-R為上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 總體系為25μL。擴(kuò)增條件: 94°C 預(yù)變性5 min; 94°C 30s, 52°C 30s, 72°C 30s, 34個(gè)循環(huán);72°C 充分延伸10min, 反應(yīng)結(jié)束。

1.3.3 三疣梭子蟹HMGR基因的3′-RACE和5′-RACE擴(kuò)增 根據(jù)首輪RT-PCR的測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)特異性上游引物GSP3-1和GSP3-2(表1)。以3′-RACE-cDNA為模板, GSP3-1及outer primer-3′(表1)為上下游引物進(jìn)行第一輪3′-RACE擴(kuò)增, 總體系為25μL。擴(kuò)增條件: 94 °C 預(yù)變性4 min; 94°C 30s, 52°C 30s, 72°C 1min30s, 34個(gè)循環(huán); 72°C 延伸10 min。第二輪3′-RACE擴(kuò)增以第一輪產(chǎn)物為模板, GSP3-1和inner primer-3′為一對(duì)引物, 體系同上。擴(kuò)增條件:94°C 預(yù)變性4min; 94°C 30s, 57°C 30s, 72°C 1min30s,34個(gè)循環(huán); 72°C 延伸10min。

根據(jù)首輪RT-PCR的測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)特異性下游引物GSP5-1和GSP5-2(表1)用于5′-RACE擴(kuò)增。按5′-Full RACE kit試劑盒說(shuō)明書操作進(jìn)行巢氏PCR:第一輪PCR以5′-RACE-cDNA為模板, outer primer-5′和GSP5-1為上下游引物進(jìn)行擴(kuò)增, 擴(kuò)增體系:94°C 預(yù)變性3min; 94°C 30s, 51°C 30s, 72°C 1min,34個(gè)循環(huán); 72°C延伸10min。第二輪PCR以第一輪PCR產(chǎn)物為模板, inner primer-5′和GSP5-2為上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 擴(kuò)增體系: 94°C 預(yù)變性3min; 94°C 30s, 57°C 30s, 72°C 1min, 34個(gè)循環(huán);72°C延伸10min。

表1 PCR引物序列Tab.1 Nucleotide sequences of primers used for PCR

1.3.4 PCR產(chǎn)物的克隆與測(cè)序 PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳后, 進(jìn)行回收和連接, 轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng), 選取陽(yáng)性克隆菌菌液送至生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3.5 序列分析 利用Vector NTI 10.0對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行初步的分析和拼接, 獲得三疣梭子蟹HMGR基因的全長(zhǎng)cDNA序列。在NCBI上利用在線ORF Finder確定其開(kāi)放閱讀框(ORF)序列, 并翻譯成氨基酸序列, 利用ExPASy Proteomics Server (http: //ca.expasy.org/)所提供的多種蛋白質(zhì)在線軟件對(duì)氨基酸序列進(jìn)行蛋白預(yù)測(cè)分析; 用Signal 3.0 Server (http: //www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP)預(yù)測(cè)氨基酸序列信號(hào)肽; 利用在線TMHMM工具(http: //www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM/)預(yù)測(cè)氨基酸跨膜區(qū)域;利用ClustalX軟件將該氨基酸序列與已公布的HMGR氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析, 并用MEGA 4.0軟件的鄰位法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

將取好的樣品按照1.2的方法進(jìn)行抽取總RNA,取1.0μg的總RNA用PrimeScript RT reagent Kit試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄; 然后運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量的方法對(duì)HMGR基因在三疣梭子蟹不同組織及蛻皮周期各期的表達(dá)水平差異進(jìn)行分析。根據(jù)該基因的cDNA序列設(shè)計(jì)熒光定量引物YG-F和YG-R(表1), 以β-actin作為內(nèi)參。PCR反應(yīng)條件: 95°C 2min; 95°C 5s、57.3°C 20s、68°C 30s, 共40個(gè)循環(huán); 95°C 15s、55°C 15s、95°C 15s。SPSS17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果

2.1 三疣梭子蟹HMGR基因cDNA全長(zhǎng)與序列分析

圖1 三疣梭子蟹HMGR基因全長(zhǎng)cDNA核苷酸序列和編碼區(qū)氨基酸序列Fig.1 The cDNA and amino acid sequences of gene encoding HMGR from P. trituberculatus

用兼并引物HMGR-F和HMGR-R進(jìn)行PT-PCR得到的產(chǎn)物, 經(jīng)測(cè)序及分析后獲得951bp的核心片段。用引物GSP3-1和outer primer-3′, GSP3-2和inner primer-3′進(jìn)行3′RACE, 測(cè)序及分析后獲得1163bp的3′端片段。用引物GSP5-1和outer primer-5′, GSP5-2和inner primer-5′進(jìn)行5′RACE, 測(cè)序及分析后獲得461bp的5′端片段。對(duì)以上片段進(jìn)行拼接后獲得總長(zhǎng)為2575bp的HMGR基因cDNA全長(zhǎng)(圖1), GenBank登錄號(hào): KF280756。5′端非編碼區(qū)為53bp, 3′端非編碼區(qū)為686bp, 開(kāi)放閱讀框(ORF)長(zhǎng)度為1836bp, 編碼611個(gè)氨基酸。利用ExPASy網(wǎng)站在線ProtParam tool預(yù)測(cè)其分子式為C2821H4584N794O882S37, 分子量大小約為64.9kD, 預(yù)測(cè)等電點(diǎn)為6.52, 富含Val(10%)、Ser(9.5%)、Ala(9.3%)、Leu(8.5%)、Gly(7.7%)和Pro(7.0%)等, 預(yù)測(cè)蛋白含負(fù)電荷氨基酸殘基60個(gè)(Asp+Glu), 正電荷氨基酸殘基57個(gè)(Arg+Lys)。不穩(wěn)定系數(shù)為54.03, 說(shuō)明三疣梭子蟹HMGR蛋白并不穩(wěn)定。該氨基酸親水性總和GRAVY (Grand average of hydropathicity)為-0.106, 屬于親水性蛋白。

利用在線Signal軟件(http: // www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)對(duì)其編碼區(qū)氨基酸序列進(jìn)行分析,未發(fā)現(xiàn)有信號(hào)肽, 說(shuō)明三疣梭子蟹HMGR不屬于分泌蛋白。在線TMHMM工具分析發(fā)現(xiàn)該氨基酸序列沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)。NCBI在線Conserved Domain Search工具對(duì)氨基酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析, 發(fā)現(xiàn)在氨基酸80—484區(qū)域?yàn)棰裥虷MGR保守催化區(qū)。經(jīng)ExPASy網(wǎng)站在線Motif Scan工具對(duì)三疣梭子蟹HMGR氨基酸進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)域分析, 發(fā)現(xiàn)該蛋白可能存在6個(gè)蛋白酶C磷酸化位點(diǎn), 8個(gè)N-豆蔻酰化位點(diǎn), 8個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ(CKⅡ)位點(diǎn), 2個(gè)?；稽c(diǎn)和3個(gè)N-端糖基化位點(diǎn)。經(jīng)比對(duì)發(fā)現(xiàn)三疣梭子蟹HMGR氨基酸序列中, 有兩個(gè)HMG-CoA 結(jié)合基序和兩個(gè)NADP(H)結(jié)合基序, 是Ⅰ型HMGR的典型區(qū)域。

在NCBI上將該序列編碼區(qū)氨基酸序列進(jìn)行BLAST搜索比對(duì), 發(fā)現(xiàn)與已公布的其它物種HMGR氨基酸序列相比: 與美洲海鰲蝦(H.americanus)HMGR的氨基酸序列一致性最高, 與其兩種亞型的一致性均為65%。由于對(duì)甲殼動(dòng)物中HMGR基因的研究較少, 與部分昆蟲和脊椎動(dòng)物的HMGR氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn): 與高山象白蟻(N. takasagoensis)和褐飛虱(Nilaparvata lugens)的一致性分別為62%、61%, 與小家鼠(M. musculus)、原雞(Gallus gallus)、智人(Homo sapiens)、非洲爪蟾(Xenopus laevis)的一致性分別為63%、63%、62%、59%。

用ClustalX軟件將美洲海鰲蝦的兩條HMGR亞型氨基酸序列(HaHMGR1和HaHMGR2)與本研究獲得的三疣梭子蟹HMGR氨基酸序列(PtHMGR)進(jìn)行比對(duì)(圖2)。結(jié)果表明在重要結(jié)構(gòu)域方面, 它們均有兩個(gè)HMG-CoA 結(jié)合基序: EN(V/I)VGYMP(V/I)P和TTEGCLVA; 兩個(gè)NADP(H) 結(jié)合基序: DAMGMNM和GTVGGGT。

從NCBI蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)中選取具有代表性的各類物種(甲殼動(dòng)物、昆蟲、脊椎動(dòng)物、植物)HMGR氨基酸序列, 以細(xì)菌為外群用MEGA 4.0軟件的鄰位法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù), 設(shè)置重復(fù)次數(shù)(Replications)為1000(圖3)。從進(jìn)化樹(shù)結(jié)果來(lái)看,HMGR氨基酸序列根據(jù)種屬被劃分為動(dòng)物和植物兩大類, 三疣梭子蟹與美洲海鰲蝦同屬甲殼類, 聚為一支, 親緣關(guān)系最近; 甲殼動(dòng)物、昆蟲與脊椎動(dòng)物聚為一大分枝, 但是甲殼動(dòng)物的HMGR與脊椎動(dòng)物親緣關(guān)系甚于昆蟲。

2.2 HMGR基因在三疣梭子蟹不同組織中的表達(dá)差異分析

對(duì)qRT-PCR的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析, 結(jié)果表明HMGR基因在三疣梭子蟹各組織中均有表達(dá)。在MO中表達(dá)量極高, 在其它組織中表達(dá)量極低, 差異極顯著(P<0.01), 且雌雄三疣梭子蟹的組織表達(dá)差異不明顯(圖4)。

2.3 大顎器HMGR基因在蛻皮周期的表達(dá)水平分析

組織表達(dá)結(jié)果顯示, HMGR基因在三疣梭子蟹MO中表達(dá)量最高, 所以選擇MO為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行HMGR基因在蛻皮周期中的表達(dá)水平變化分析。qRT-PCR的結(jié)果表明三疣梭子蟹MO中的HMGR基因在整個(gè)蛻皮周期中均有表達(dá), 從蛻皮A期至D0亞期逐漸上升至最高, 然后下降至D4亞期最低(圖5)。

3 討論

目前對(duì)于HMGR基因的研究多見(jiàn)于植物、哺乳動(dòng)物、昆蟲等, 在甲殼動(dòng)物方面報(bào)道僅見(jiàn)于美洲海鰲蝦。HMGR是甲羥戊酸合成途徑中的限速酶, HMGR的活性是控制異戊二烯生成的重要因子。就目前為止發(fā)現(xiàn)的HMGR可分為兩種類型: Ⅰ型主要存在于真核細(xì)胞; Ⅱ型主要存在于原核細(xì)胞, 二者的共同點(diǎn)是都在C-端具有催化功能的結(jié)構(gòu)域(Bocharet al,1999)。本研究通過(guò)分子克隆技術(shù)得到三疣梭子蟹HMGR基因全長(zhǎng)cDNA序列, 其開(kāi)放閱讀框所推導(dǎo)的氨基酸序列與已公布的美洲海螯蝦HMGR序列(Liet al, 2004)的一致性為65%。對(duì)其功能結(jié)構(gòu)位點(diǎn)進(jìn)行分析, 發(fā)現(xiàn)該蛋白具有典型的Ⅰ型HMGR保守結(jié)構(gòu)域, 含兩個(gè)HMG-CoA 結(jié)合基序: ENVVGYMPVP和TTEGCLVA, 分別位于143(E)—152(P)和172(T)—179(A); 存在兩個(gè)NADP(H)結(jié)合基序: DAMGMNM和GTVGGGT, 分別位于266(D)—272(M)和416(G)—422(T)。這兩種基序是HMGR基因家族的保守序列和重要功能域(李嶸等, 2006; 谷巍等, 2011; 姜鳴等,2012), 是其活性所必需的典型多肽位點(diǎn)。HMGR利用NADP(H)的還原性H將底物HMG-CoA還原為甲羥戊酸, 高濃度的NADPH會(huì)抑制HMGR酶活性(Liet al, 2003)。其中, 研究已證明HMG-CoA結(jié)合基序TTEGCLVA 中的谷氨酸(Glu)在HMGR 催化中起著重要作用(Rupasingheet al, 2001)。說(shuō)明本次克隆得到的序列屬于Ⅰ型HMGR基因家族。

圖2 三疣梭子蟹與美洲海鰲蝦HMGR氨基酸序列多重比對(duì)結(jié)果Fig.2 Multiple alignment of the HMGR amino acid sequence between P. trituberculatus and H. Americanus

圖3 三疣梭子蟹HMGR氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree analysis of HMGRs from P. trituberculatus and other species

據(jù)研究美洲海鰲蝦MO中存在兩種構(gòu)型的HMGR, 75%的HMGR屬于可溶型的活性蛋白, 大小為66kDa(HMGR1); 另一種屬于膜連結(jié)型, 大小為72kDa(HMGR2), 兩者差別在于HMGR2的N端存在一個(gè)跨膜區(qū)域(Liet al, 2004)。在本次研究中, 只在三疣梭子蟹的MO中得到了一條HMGR序列, 經(jīng)軟件分析并不存在跨膜區(qū)域, 很可能是可溶型HMGR, 即與美洲海鰲蝦HMGR1相似性更高。但是在其余物種(植物、昆蟲、脊椎動(dòng)物等)的HMGR基因克隆中, 絕大多數(shù)不存在亞型的情況, 而在甲殼動(dòng)物方面可供參考的研究資料很缺乏, 尚待進(jìn)一步研究。

從進(jìn)化樹(shù)分析圖中發(fā)現(xiàn)甲殼動(dòng)物的HMGR聚為一支, 與昆蟲相比, 三疣梭子蟹HMGR與脊椎動(dòng)物親緣關(guān)系高一些。據(jù)研究美洲海鰲蝦兩條HMGR亞型(HMGR1和HMGR2)與哺乳動(dòng)物的HMGR氨基酸序列更為相似(Liet al, 2004), 其次相似的是昆蟲。與本次的進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果一致?？赡苁羌讱?dòng)物的HMGR基因在進(jìn)化上高于昆蟲, 逐漸趨近于脊椎動(dòng)物。

圖4 HMGR基因在不同組織的相對(duì)表達(dá)水平Fig.4 Relative expression of HMGR in various tissues in P.Trituberculatus

圖5 MO中HMGR基因在三疣梭子蟹蛻皮周期中的相對(duì)表達(dá)差異Fig.5 Relative expression of HMGR in MO during molting stages in P. Trituberculatus

甲基法尼酯MF因參與到多種生理生殖的調(diào)控中, 逐漸成為甲殼動(dòng)物的神經(jīng)內(nèi)分泌學(xué)的研究熱點(diǎn)。在合成MF的過(guò)程中, HMGR催化生成甲羥戊酸的反應(yīng)不可逆, 是催化MF合成初始步驟的關(guān)鍵限速酶,對(duì)甲殼動(dòng)物的許多生理過(guò)程具有重要調(diào)控作用。在本研究中, 發(fā)現(xiàn)HMGR基因在三疣梭子蟹MO中表達(dá)量極高, 在其它組織表達(dá)量水平極低, 說(shuō)明HMGR的主要生理功能就是在MO中催化甲羥戊酸途徑合成萜類物質(zhì)(包括MF)的生成, 再次證明MO是合成和分泌MF的唯一器官。在與甲殼動(dòng)物關(guān)系最近的昆蟲體內(nèi), HMGR基因在咽側(cè)體中表達(dá)量較高; Li等人檢測(cè)HMGR酶活性在美洲海鰲蝦MO中最高, 在其余組織酶活性極低(Liet al, 2003), 與本研究結(jié)果基本一致。在切除美洲海鰲蝦眼柄后, HMGR的活性上升, 血淋巴中MF的濃度與HMGR活性變化呈正相關(guān);但在注射MOIH后, HMGR酶活性并未受到顯著影響,說(shuō)明HMGR很有可能還受到甲殼動(dòng)物眼柄中其余途徑的調(diào)控(Liet al, 2010)。

甲殼動(dòng)物的蛻皮受神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)共同調(diào)控, 不僅有蛻皮酮和竇腺肽類激素的參與, MF也起到了重要作用(Wilderet al, 1995; Nagarajuet al,2006; 汪春建等, 2013;)。一般認(rèn)為MF的合成路徑分為兩個(gè)階段: 第一階段生成法尼焦磷酸(Farnesyl pyrophosphate, FPP); 第二階段合成MF。HMGR是FPP合成的重要調(diào)控因子, 作為MF合成初始步驟的關(guān)鍵酶; 而法尼酸甲基轉(zhuǎn)移酶(Farnesoic acid O-methyl transferase, FAMeT)是MF合成階段最后一步催化法尼酸(Farnesoic acid, FA)轉(zhuǎn)化為MF的重要限速酶, 被證明參與了三疣梭子蟹和擬穴青蟹等的蛻皮調(diào)控(謝熙等, 2013; Yanget al, 2012)。羅氏沼蝦(M. rosenbergii)和克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)蛻皮周期血淋巴中MF濃度的檢測(cè)結(jié)果顯示, 在蛻皮后期和間期, MF水平較低, 在蛻皮前期, MF水平逐漸上升, 在臨近蛻皮時(shí)下降(Wilderet al, 1995; Luferet al, 2005)。謝熙等的研究顯示FAMeT基因在三疣梭子蟹蛻皮各階段均有表達(dá), 在D1亞期有顯著性增加,隨后逐漸下降(謝熙等, 2013)。本次實(shí)驗(yàn)中, HMGR基因在三疣梭子蟹蛻皮過(guò)程中的A期至C期相對(duì)表達(dá)量逐漸上升, 在D0亞期達(dá)到最高, 隨后逐漸下降, 至D4亞期達(dá)到最低。該結(jié)果與三疣梭子蟹蛻皮周期中FAMeT基因的相對(duì)表達(dá)量和羅氏沼蝦等血淋巴中MF水平變化相似, 且HMGR基因相對(duì)表達(dá)量更早達(dá)到高峰, 這可能與HMGR是MF合成路線上的初始關(guān)鍵酶有關(guān)。由此推測(cè), 在三疣梭子蟹蛻皮后期至蛻皮前期初期, 其體內(nèi)HMGR基因表達(dá)量開(kāi)始逐漸升高并在蛻皮前期D0亞期高效表達(dá), 促進(jìn)FPP合成, 使蛻皮前期的血淋巴內(nèi)MF濃度上升從而促進(jìn)蛻皮的發(fā)生, 參與到蛻皮調(diào)控過(guò)程的發(fā)生。

本研究成功獲得三疣梭子蟹HMGR基因全長(zhǎng)cDNA序列, 通過(guò)分析HMGR基因在各組織的表達(dá)水平變化, 驗(yàn)證了MO是合成甲基法尼酯的唯一器官; 通過(guò)分析HMGR基因在蛻皮周期各期中的表達(dá)變化,可以認(rèn)為HMGR基因在蛻皮前期初期高效表達(dá)促進(jìn)蛻皮的發(fā)生。本文為進(jìn)一步闡明甲殼動(dòng)物蛻皮的調(diào)控機(jī)制和解決養(yǎng)殖過(guò)程中遇到的蛻皮過(guò)頻和蛻皮未遂等問(wèn)題奠定了一定基礎(chǔ)。

王啟超, 劉實(shí)忠, ?，F(xiàn)周, 2012. 橡膠草HMGR基因的克隆及表達(dá)分析. 植物研究, 32(1): 61—68

李 嶸, 王苗之, 2006. 植物萜類合成酶3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A-還原酶的生物信息學(xué)分析. 廣西植物: 26(5):464—473

李 勝, 趙維信, 2000. 甲殼動(dòng)物的大顎器和甲基法尼酯. 上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào), 9(3): 240—244

劉昌杰, 侯艷麗, 王 緯等, 1999. 蝦池養(yǎng)殖三疣梭子蟹當(dāng)年性早熟初報(bào). 齊魯漁業(yè), 16(6): 19—20

劉 艷, 勝振濤, 蔣容靜等, 2007. 保幼激素合成的研究進(jìn)展,昆蟲學(xué)報(bào), 50(12): 1285—1292

沈 潔, 朱冬發(fā), 胡則輝等, 2011. 三疣梭子蟹蛻皮周期的分期. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 35(10): 1481—1487

谷 巍, 席蓓莉, 吳啟南等, 2011. 建澤瀉HMGR基因保守區(qū)片段克隆與組織分布研究. 中藥材, 34(9): 1335—1339

邱高峰, 張愛(ài)萍, 樓允東, 2003. 鋸緣青蟹蛻皮抑制激素cDNA的分子克隆及其表達(dá)分析. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 27(3): 201—212

汪春建, 朱冬發(fā), 亓一舟等, 2013. 三疣梭子蟹蛻皮周期中MIH基因mRNA水平與蛻皮激素濃度變化. 水生生物學(xué)報(bào), 37(1): 22—28

姜 鳴, 霍 棠, 呂淑敏等, 2012. 細(xì)紋豆芫菁3-羥甲基戊二酰輔酶A-還原酶基因全長(zhǎng)cDNA克隆及生物信息學(xué)分析.昆蟲學(xué)報(bào), 55(7): 860—868

謝 熙, 朱冬發(fā), 崔曉雨等, 2013. 三疣梭子蟹FAMeT基因克隆及其在蛻皮周期中的表達(dá)水平. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 37(7):994—1001

Abdua U, Barkib A, Karplusb Iet al, 2001. Physiological effects of methyl farnesoate and pyriproxyfen on wintering female crayfishCherax quadricarinatus. Aquaculture, 22(1—2):163—175

Bochar D A, Stauffacher L V, Rodwel V Wet al, 1999. Sequence comparison reveal two classes of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase. Molecular Genetics and Metabolism,66: 122—127

Chen X, Wang X F, Li Z Jet al, 2012. Molecular cloning, tissue expression and protein structure prediction of the porcine 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase (HMGR)gene. Gene, 495: 170—177.

Davies K A, Kou K G M, Wulff J E, 2011. Oxygen-containing analogues of juvenile hormone III. Tetrahedron Letters,52(18): 2302—2305

Gertler F B, Chiu C Y, Richter-Mann Letal, 1988. Developmental and metabolic regulation of the Drosophila melanogaster 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase. Molecular and cellular biology, 8(7): 2713—2721

Hojo M, Maekawa K, Saitoh Setal, 2012. Exploration and characterization of genes involved in the synthesis of diterpene defence secretion in nasute termite soldiers. Insect molecular biology, 21(6): 545—557

Kinjoh T, Kaneko Y, Itoyama Ketal, 2007. Control of juvenile hormone biosynthesis in Bombyx mori: Cloning of the enzymes in the mevalonate pathway and assessment of their developmental expression in the corpora allata. Insect biochemistry and molecular biology, 37(8): 808—818

Laufer H, Ahl J, Rotlant Get al, 2002. Evidence that ecdysteroids and methyl farnesoate control allometric growth and differentiation in a crustacean. Insect Biochemistry and Molecular Biology,32: 205—210

Laufer H, Borst D W, Baker F Cet al, 1987a. Identification of a juvenile hormone-like compound in a crustacean. Science,235: 202—205

Laufer H, Demir N, Pan Xet al, 2005. Methyl farnesoate controls adult male morphogenesis in the crayfish,Procambarus clarkii. Journal of Insect Physiology, 51: 379—384

Li S, Friesen J A, Fei Het al, 2004. The lobster mandibular organ produces soluble and membrane-bound forms of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase. Biochem Journal, 381:831—840

Li S, Friesen J A, Holford K Cet al, 2010. Methyl farnesoate synthesis in the lobster mandibular organ: The roles of HMG-CoA reductase and farnesoic acid O-methyltransferase.Comparative Biochemistry and Physiology, Part A, 155:49—55

Li S, Wagner C A, Friesen J Aet al, 2003. 3-Hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase in the lobster mandibular organ: regulation by the eyestalk. General and Comparative Endocrinology, 134: 147—155

Lovett D L, Tanne C A, Glomski Ket al, 2006. The effect of seawater composition and osmolality on hemolymph levels of methyl farnesoate in the green crabCarcinus maenas.Comparative Biochemistry and Physiology Part A, 143:67—77

Nagaraju G, Reddy P R, Reddy P Set al, 2006.In vitromethyl farnesoate secretion by mandibular organs isolated from different molt and reproductive stages of the crabOziotelphusa senex senex, Fisheries Science, 72: 410—414

Rupasinghe H, Almquist K C, Paliyath Get al, 2001. Cloning of hm g1 and hm g2 cDNAs encoding 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase and their expression and activity in relation to farnesene synthesis in apple. Plant Physiology and Biochemistry, 39: 933—947

Soroka Y, Sagi A, Khalaila Iet al,2000. Changes in protein kinase C during vitellogenesis in the crayfishCherax quadricarinatus—possible activation by methyl farnesoate.General and Comparative Endocrinology, 118: 200—208

Sundaresan S, Yang T L, Francke U, 1989. Genes for HMG-CoA Reductase and Serotonin 1a Receptor are on Mouse Chromosome 13. Somatic Cell and Molecular Genetics, 15:465—469

Wainwright G, Webster S G, Rees H H, 1996. Involvement of adenosine cyclic-3′, 5′-monophosphate in the signal transduction pathway of mandibular organ-inhibiting hormone of the edible crab,Cancer pagurus. Molecular and Cellular Endocrinology, 154: 55—62

Wilder M N, Okada S, Fusetani Netal, 1995. Hemolymph profiles of juvenoid substances in the giant freshwater prawn,Macrobrachium rosenbergii in relation to reproduction and molting. Fisheries Science, 61(1): 175—176

Yang Y, Ye H, Huang H Yet al, 2012. Cloning, expression and functional analysis of farnesoic acid O-methyltransferase(FAMeT) in the mud crab,Scylla paramamosain. Marine and Freshwater Behavior and Physiology, 45: 209—222