抗菌多肽的研究進(jìn)展

閆 娟, 江鑾鑾， 袁素素， 葉秀娟,2*, 吳子斌, 吳祖建(.福建農(nóng)林大學(xué) 福建省植物病毒學(xué)重點(diǎn)研究室， 福建 福州 50002；2.福建農(nóng)林大學(xué) 生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 福建 福州 50002；.香港中文大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)學(xué)院, 香港 新界沙田 999077)

抗菌多肽是存在于生物體中具有抗菌活性的肽類物質(zhì)的總稱，是宿主產(chǎn)生的一類能夠抵抗外界病原體感染的小分子蛋白，是生物體先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，對(duì)真菌、細(xì)菌、病毒、線蟲(chóng)等具有廣泛的殺傷活性(王賢達(dá)等，2014；Wuetal.，2003；Boulangeretal.，2001；馬珦玻等，2009)。由于抗菌肽與傳統(tǒng)抗生素、化學(xué)藥物的作用機(jī)制具有明顯的差異，具有抗菌譜廣、作用強(qiáng)且迅速、不易產(chǎn)生耐藥等優(yōu)點(diǎn)，使多肽類藥物的研發(fā)越來(lái)越受到重視。本文從抗菌多肽的分類、作用和作用機(jī)理幾個(gè)方面進(jìn)行綜述，并對(duì)抗菌多肽的應(yīng)用前景及其存在的問(wèn)題進(jìn)行分析。

1 抗菌多肽的分類

1972年，瑞典科學(xué)家Boman等從惜古比天蠶 (Hyatophoracecropia) 蛹中首次分離得到抗菌肽物質(zhì)cecropin，此肽通過(guò)向惜古比天蠶蛹的腎臟中注射蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)誘導(dǎo)獲得(Boman and Steiner，1981)，此后人們相繼從多種生物體中分離到 1000多種抗菌肽，其分布極其廣泛，從昆蟲(chóng)、哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)類、兩棲動(dòng)物、魚類到植物(Lametal.，2000)、真菌(Wangetal.，2004a；Wangetal.，2004b)、細(xì)菌(Yadavetal.，2007)和病毒等均有發(fā)現(xiàn)(祝驥等，2008)。

1.1 根據(jù)抗菌肽的來(lái)源分類

1.1.1 動(dòng)物源抗菌肽 目前已從各種動(dòng)物中獲得超過(guò)1500個(gè)抗菌肽的序列信息(丁云超和張士璀，2013)，其來(lái)源包括昆蟲(chóng)、哺乳動(dòng)物、鳥(niǎo)類、兩棲動(dòng)物、魚類等。其中昆蟲(chóng)類包括鱗翅目(Lepidoptera)(陸瑩瑾和王禾，1998)、雙翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、膜翅目(Hymenoptera)、半翅目(Hemiptera)、等翅目(Isoptera)、同翅目(Homoptera)、蜻蜓目(Odonata)等；哺乳動(dòng)物類包括豬、牛、馬、兔、獼猴和人等；鳥(niǎo)類包括雞、火雞、鴕鳥(niǎo)等；兩棲動(dòng)物包括樹(shù)蛙、蛇等在內(nèi)的600多種(劉誠(chéng)等，2011)；一些魚、貝類及原索類動(dòng)物海鞘等體內(nèi)也存在著多種抗菌肽(曾名勇和陳勝軍，2009)。

1.1.2 植物源抗菌肽 植物源抗菌肽是植物自身合成的、能夠防御微生物侵害的一類小分子多肽。自然界中植物源抗菌肽種類繁多，大多為抗真菌肽，不同的植物可以產(chǎn)生不同的抗菌肽。至今人們已經(jīng)從多種植物中分離純化到多種抗菌肽，包括開(kāi)花植物(Fujimuraetal.，2003；Wang and Ng，2000)、雙子葉植物(Wang and Ng，2002；Wang and Ng，2003)、單子葉植物(Chilosietal.，2000)、裸子植物(Huangetal.，2000；Wangetal.，2000)等；從植物的各種組織中也分離到抗菌蛋白或多肽，包括根(Lam and Ng，2001；Lametal.，2000)、莖(Lametal.，2000)、葉(Goziaetal.，1993；Chilosietal.，2000)、果實(shí)(Fujimuraetal.，2003；Wangetal.，2000；Wangetal.，2002；Wangetal.，2003；)、鱗莖(Goziaetal.，1995)、種子(Chilosietal.，2000)等。

大多數(shù)植物源抗菌肽對(duì)植物病原具有良好的生物活性，部分植物源抗菌肽對(duì)部分真菌、細(xì)菌、病毒、線蟲(chóng)及癌細(xì)胞等具有較強(qiáng)的殺傷活性。Thionins是最早從植物中分離的抗菌肽(李秋劍，2006)。迄今已在植物中發(fā)現(xiàn)多種抗菌肽，如硫素(thionins)、植物防御素(plant defensins)、脂轉(zhuǎn)移蛋白(lipid transfer protein)、、IbAMP、knottin-like、molting hormone和MBP1(祝驥等，2008)等。與動(dòng)物源和微生物源抗菌肽相比較，植物源抗菌肽對(duì)于真菌具有很高的抑殺活性(劉誠(chéng)等，2011)。

1.1.3 微生物源抗菌肽 微生物源抗菌肽主要包括病毒源和細(xì)菌源，最早發(fā)現(xiàn)的病毒源抗菌多肽是人類免疫缺陷病毒1(HIV-1)包膜蛋白胞質(zhì)尾部，與其他慢性病毒的穿膜蛋白抗菌肽一樣，具備抗菌活性和細(xì)胞毒性。細(xì)菌抗菌肽又稱為細(xì)菌素，革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌都可以分泌。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌源抗菌肽有桿菌肽(Bacitracin)、短桿菌肽S(GramicidinS)、多勃菌素E(Polymyin E)和乳鏈菌肽(Nisin)4種類型(李秋劍，2006)。

1.2 依據(jù)氨基酸序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)的不同分類

α-螺旋型抗菌肽(amphipathic α-helical peptide)，β-折疊抗菌肽(β-sheet peptide stabilized)，具有環(huán)形結(jié)構(gòu)抗菌肽(peptide with loop structures)和伸展性螺旋結(jié)構(gòu)抗菌肽。

1.3 依據(jù)抗菌蛋白的作用機(jī)制分類

類親環(huán)素蛋白(cyclophilin-like proteins)、葡聚糖酶(glucanases)(Wongetal., 2010)、核糖體失活蛋白(ribosome inactivating proteins)、脂轉(zhuǎn)移蛋白(lipid transfer proteins)、蛋白酶抑制劑(protease Inhibitors)、2S清蛋白類(2S Albumin Proteins)(呂慧等，2012)，以及幾丁質(zhì)酶(chitinases)、類幾丁質(zhì)酶(chitinases-like proteins)(Vogelsang and Barz，2003)、防御素(defensins)和類防御素蛋白(defensins-like proteins)(Wongetal.，2003)等。

2 抗菌肽的抗菌作用

抗菌肽具有抑制細(xì)菌生長(zhǎng)和繁殖，或者殺死細(xì)菌的功能，還具有抗真菌、抗病毒、抑制或殺傷腫瘤細(xì)胞、殺滅寄生蟲(chóng)和原蟲(chóng)等廣譜的活性，并且在生物體的天然免疫系統(tǒng)中扮演著重要角色。

2.1 抗菌肽對(duì)細(xì)菌的殺傷作用

抗菌肽對(duì)細(xì)菌具有殺傷作用(Vizioli and Salzet，2002；Koczulla and Bals，2003)，其抗菌譜較廣，且殺菌速度比較快。例如，天蠶素和乳酸鏈球菌素具有抗銅綠假單胞菌的活性，如果能夠聯(lián)合應(yīng)用Ranalexin和BuforinⅠ，則對(duì)氨芐西林抗性的葡萄球菌有很好的殺傷作用。

2.2 抗菌肽對(duì)真菌的殺傷作用

抗菌肽具有抗真菌的作用(Iijimaetal.，1993)。例如，天蠶素對(duì)曲霉菌屬和鐮刀菌屬的病原菌具有較好的殺傷活性。又如，從人和靈長(zhǎng)類動(dòng)物唾液提取出的組蛋白也具有抗真菌的作用，其作用機(jī)制可能是通過(guò)誘導(dǎo)活化細(xì)胞中ATP的丟失，使細(xì)胞死亡，這種作用模式與吡咯類、多烯類藥物具有明顯的差異。

2.3 抗菌肽對(duì)病毒和癌細(xì)胞的抑制和殺傷作用

抗菌肽還具有抗病毒、抑制或者殺傷腫瘤細(xì)胞(Winderetal.，1998)的作用?？咕哪軌蛱禺愋缘匾种颇承┠[瘤細(xì)胞，并且不會(huì)對(duì)人體正常細(xì)胞產(chǎn)生不良影響。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道，抗菌肽對(duì)宮頸癌細(xì)胞(Mineshibaetal.，2005)、膀胱癌細(xì)胞(Suttmannetal.，2008)、肝癌細(xì)胞(Lu and Chen，2010)具有殺傷作用及其劑量相關(guān)效應(yīng)。

2.4 抗菌肽對(duì)寄生蟲(chóng)和原蟲(chóng)等的殺傷作用

抗菌肽對(duì)寄生蟲(chóng)(Daganetal.，2002)、抗原蟲(chóng)(Bomanetal.，1989)等具有殺傷作用，可以有效地殺滅人類及動(dòng)物的一些寄生蟲(chóng)。例如，研究者合成了一種對(duì)利什曼原鞭毛蟲(chóng)有殺傷作用的天蠶素—蜂毒素雜合肽(Díaz-Achiricaetal.，1998)；Dermaseptin的一種衍生物能夠殺滅寄生于紅細(xì)胞內(nèi)的惡性瘧原蟲(chóng)；Dermaseptin家族中由29個(gè)氨基酸組成的肽段DS-01對(duì)枯氏錐蟲(chóng)具有抗性。

2.5 抗菌肽的其它作用

抗菌肽不僅能夠直接殺滅侵入生物體內(nèi)的病原微生物，還在天然免疫系統(tǒng)中扮演著更加重要的角色。有些抗菌肽具有調(diào)節(jié)免疫(Gutsmannetal.，2001)、促中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞的化學(xué)趨化、促進(jìn)傷口愈合、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(Chenetal.，2001)、抑制蛋白激酶C(Charpetal.，1988)、抑制促腎上腺皮質(zhì)激素(Zhuetal.，1988)等多方面的活性。

3 抗菌肽的抑菌機(jī)理

目前關(guān)于抗菌肽的作用機(jī)理還未能達(dá)成共識(shí)。有的認(rèn)為抗菌肽是通過(guò)與細(xì)胞膜作用，引起膜通透性改變導(dǎo)致病原菌死亡；有的認(rèn)為抗菌肽與胞膜上的特異性受體及其他因子協(xié)同作用使病原菌死亡；有的認(rèn)為抗菌肽作用于細(xì)胞壁、線粒體等抑制或殺死病原菌。但目前研究成果表明，多數(shù)抗菌肽主要是通過(guò)作用于細(xì)菌的細(xì)胞膜，破壞其完整性并產(chǎn)生穿孔現(xiàn)象，造成細(xì)胞內(nèi)容物溢出胞外而死亡。抗菌肽的作用機(jī)理有多種，對(duì)同一種病原菌不同的抗菌肽可能作用機(jī)制不同，同一種抗菌肽也可能具有不同的作用機(jī)制。闡明抗菌肽的作用機(jī)制有利于病害的防治和藥物的開(kāi)發(fā)利用。

3.1 抗菌肽可以通過(guò)改變細(xì)胞膜的通透性起殺菌或抑菌的作用

據(jù)現(xiàn)有的研究結(jié)果證明，幾乎所有的抗菌肽都是陽(yáng)離子型的，大多數(shù)具有兩親α-螺旋和/或兩親β-折迭結(jié)構(gòu)。Boman等(1993)發(fā)現(xiàn)豬cecropin P1能在大腸桿菌細(xì)胞膜上形成電勢(shì)依賴通道、改變其通透性，從而起殺菌作用，這與Christensen等人(1988)的報(bào)道一致，殺菌過(guò)程為：抗菌肽分子兩親α-螺旋上的正電荷與細(xì)菌質(zhì)膜磷脂分子上的負(fù)電荷通過(guò)靜電作用相互吸引而靠近；接著借助于分子中N端與C端間的連續(xù)結(jié)構(gòu)的柔性，抗菌肽分子中的疏水端插入質(zhì)膜中；然后兩親性α-螺旋也插入質(zhì)膜中，破壞脂質(zhì)雙分子層原有的有序結(jié)構(gòu)，α-螺旋的兩親性使抗菌肽分子通過(guò)膜內(nèi)分子間的位移而聚集在一起，在膜上形成離子通道，最終細(xì)菌因滲透壓改變而死亡。

3.2 部分抗菌肽可通過(guò)對(duì)細(xì)菌胞內(nèi)酶結(jié)構(gòu)、功能及對(duì)細(xì)菌胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)影響發(fā)揮作用

以BuforinⅡ抗菌肽為例，抗菌肽可不通過(guò)細(xì)胞膜，直接作用于胞質(zhì)內(nèi)DNA，通過(guò)干擾細(xì)菌細(xì)胞外膜蛋白的轉(zhuǎn)錄，抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，從而達(dá)到抑菌作用(Parketal.，2000)。劉忠淵等(2008)發(fā)現(xiàn)新疆家蠶抗菌肽Cecropin-XJ與細(xì)菌DNA雙螺旋溝槽結(jié)合，從而干擾其復(fù)制轉(zhuǎn)錄過(guò)程。

3.3 抗菌肽可直接作用于細(xì)胞壁

Harder等(2001)發(fā)現(xiàn)人的抗菌肽β-defensin 3能夠阻止外膜蛋白質(zhì)的合成，從而抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的形成，使細(xì)菌不能維持正常的細(xì)胞形態(tài)，生長(zhǎng)受阻，并使細(xì)胞壁穿孔，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡。

3.4 抗菌肽可直接作用于線粒體

通過(guò)抑制細(xì)菌呼吸作用，從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡(劉淼和鄭風(fēng)勁，2012)。在超微結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)線粒體會(huì)出現(xiàn)腫脹、空泡化、嵴脫落和不規(guī)則排列，核膜界限不清，部分核破裂，有內(nèi)容物溢出等現(xiàn)象(楊星劍等，2005)。

4 抗菌肽的應(yīng)用前景及存在的問(wèn)題

微生物耐藥性或抗藥性增強(qiáng)等問(wèn)題日漸突出，尋找新的抗菌資源已成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。由于抗菌肽的特殊作用機(jī)制，一般能在接觸微生物2-3 min這樣極短的時(shí)間內(nèi)將其殺死，無(wú)論微生物是否處于生長(zhǎng)期，都能夠發(fā)揮快速殺菌的作用。抗菌肽還能直接殺滅多種微生物(甚至病毒、腫瘤和AIDS病毒)，并且不會(huì)給人體帶來(lái)副作用，是一類大有開(kāi)發(fā)前景的抗菌藥物?？咕膽?yīng)用最廣、最具開(kāi)發(fā)價(jià)值的就是其藥用價(jià)值，但要成為藥物還需解決一些問(wèn)題：(1)抗菌肽的提取純化技術(shù)，這直接決定了抗菌肽的生產(chǎn)成本及其市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。(2)構(gòu)建基因工程菌以提高表達(dá)量。(3)抗菌肽的穩(wěn)定性和免疫反應(yīng)問(wèn)題，即需要對(duì)抗菌肽進(jìn)行分子改造，使其既降低對(duì)蛋白酶的敏感性又降低機(jī)體的抗原性。(4)耐藥性問(wèn)題?？咕囊云洫?dú)特的作用機(jī)制，雖然很難產(chǎn)生耐藥性，但由于自然界中一些病原微生物具有天生的耐藥性，這就要求在使用抗菌肽時(shí)要及時(shí)發(fā)現(xiàn)耐藥性的病菌。因此，如何提高抗菌多肽的產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本等成為未來(lái)的研究方向。

總的來(lái)說(shuō)，抗菌肽的應(yīng)用具有極好的藥用前景，其將成為對(duì)付耐藥性微生物及其它相關(guān)病害的新型武器，開(kāi)辟蛋白類藥物發(fā)展的新天地。隨著基因工程技術(shù)和化學(xué)合成技術(shù)的不斷提高，多肽類抗菌劑極有可能成為一種高效低毒且無(wú)殘留的抗菌、抗病毒的新型藥。

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