流式細胞儀分析癌細胞對肥大細胞募集的影響＊

林玨龍，劉 柳，沈志忠，陳春桂，金玲爽，吳淑獻，樸仲賢，方澤曼

(汕頭大學醫(yī)學院 a．中心實驗室;b．第一附屬醫(yī)院，廣東 汕頭515041)

食管鱗狀細胞癌是一種最常見的且預后不良的消化道惡性腫瘤。研究顯示多數(shù)人類腫瘤中，腫瘤的預后與肥大細胞的密度相關，并大量的研究已在探討這個問題。在脊椎動物免疫細胞演變過程中，肥大細胞(mast cell，MC)是初期的免疫細胞并能演變成多功能細胞［1］。MC是IgE依賴過敏疾病的引發(fā)者，在先天和適應性免疫反應、感染及炎癥性自身免疫性疾病中發(fā)揮著重要的作用［2-4］。MC不僅在過敏反應和自身免疫中被廣泛地研究，且越來越被認為是人類惡性腫瘤中腫瘤基質微環(huán)境的關鍵組件［5-8］。研究表明:MC參與初期的腫瘤的炎癥反應，促進或延緩腫瘤生長取決于癌癥的類型［9-11］。MC在組織定位、應答與其分化成不同的表型一樣，通常取決于最終到達組織所在地的化學環(huán)境［12，13］。MC表型的“異質性”或“可塑性”由其受體和顆粒成分的差異表達體現(xiàn)出來。在嚙齒動物，大致分為連接組織類型(也稱漿膜)和粘膜類型MC，其特異的組織化學染色差異主要表現(xiàn)為MC顆粒中蛋白聚糖核心的粘多糖成分［14］。人類MC是根據(jù)其特征酶:類胰蛋白酶和類糜蛋白酶顆粒的表達差異分型。一種類型為MCT型，只包含類胰蛋白酶，是呼吸道和腸道粘膜的主要亞型。MCTC型同時包含類胰蛋白酶和類糜蛋白酶，主要在皮膚、滑膜、結膜、淋巴結、心肌以及胃和小腸黏膜下層分布。第三個類型是表達類糜蛋白酶的MCC型，在胃粘膜組織，小腸和結腸發(fā)現(xiàn)［15，16］?；贛C的特征酶在進化中的保守特性，哺乳動物中MC的類胰蛋白酶和類糜蛋白酶具有一定的同源性［17，18］。小鼠的MC蛋白酶(mouse mast cell protease，mMCP)分為:肥大細胞類胰蛋白酶(mMCP-6)和類糜蛋白酶(mMCP-4)［19］。此外，因生物體內MC的遷移或分布于不同的組織的過程十分復雜，腫瘤細胞在培養(yǎng)液環(huán)境或免疫缺陷的動物體內的實驗不能完全復制生物體內環(huán)境，因此，我們利用食管癌細胞株EC109植入小鼠腹腔后，用鼠抗人類胰蛋白酶和類糜蛋白酶抗體(因MC特征酶的同源性)，檢測鼠肥大細胞在腹腔募集及其形成的腫瘤細胞周邊的微環(huán)境，了解不同MC亞型的變化對食管癌細胞周邊的微環(huán)境的影響。

1 材料

1．1 實驗動物

SPF級昆明(KM)小鼠，雌雄不限，體重18～22 g，來源于汕頭大學醫(yī)學院實驗動物中心［SCXK(粵)2007-0017］，實驗在實驗動物中心屏障動物實驗設施內進行［SYXK(粵)2007-0097］，動物飼養(yǎng)管理嚴格按照中華人民共和國科技部實驗動物管理規(guī)范。

1．2 主要試劑

小鼠抗人肥大細胞的類胰蛋白酶的單克隆抗體(IgG1)和類糜蛋白酶的單克隆抗體(IgM)由原汕頭大學醫(yī)學院變態(tài)反應學和炎癥學研究所提供?？笽gM抗體-PE標記［大鼠抗小鼠IgG1-PE(藻紅素，phycoerythrin，PE，美國SBA公司)］，類胰蛋白酶抗體直接熒光PE Cy5標記(由晶美公司技術部標記)。同型對照:小鼠IgG1同型物PE Cy5(晶美公司)，大鼠IgG1同型物PE(美國SBA公司)。磷酸緩沖液(phosphate buffer salt，PBS，0．1 mol/mL，pH 7．2～7．4，美國Invitrogen公司)，0．2%Triton X-100，胰酶(trypsin，華美公司)。人食管癌EC109細胞株(由汕頭大學醫(yī)學院生物化學研究室惠贈)。

2 方法

2．1 動物模型

KM小鼠進入SPF環(huán)境飼養(yǎng)一周后，對小鼠進行注射誘導。將小鼠分成5組，每組3只小鼠，分別向其中4組小鼠腹腔注射:食管癌細胞(106/mL，0．4 mL);食 管 癌 細 胞(106/mL，0．4 mL)和 胰 酶(0．005 mg/只);食管癌細胞(106/mL，0．4 mL)和As2O3(0．00594 mg/只);食 管 癌 細 胞(106/mL，0．4 mL)、As2O3(0．00594 mg/只)和胰 酶(0．005 mg/只)。第5組不作處理，作為對照。

2．2 腹腔液的細胞提取

對小鼠進行注射誘導24 h后，提取小鼠的腹腔液。先將小鼠頸椎脫臼處死，向腹腔內注射1～2 mL的生理鹽水，打開腹腔，吸取腹腔液于離心管中，生理鹽水洗滌2次，細胞以70%的乙醇固定，制成細胞懸液。

2．3 腸組織切片的制備及染色

取小鼠腸組織，經(jīng)石蠟包埋、切片、脫蠟，用甲苯胺藍染色法對組織中的肥大細胞進行染色，95%乙醇鏡下分色，光鏡下觀察小鼠腸組織MC經(jīng)不同刺激物的作用后在腸壁移動的狀況。

2．4 細胞的熒光標記

MC特征性蛋白酶免疫熒光的標記:分別取已固定的細胞懸液(鼠腹腔液的細胞，106/mL)各0．2 mL，置于不同的離心管中，0．1 moL/L PBS洗滌1-2次，0．2%Triton X-100處理10 min，PBS洗滌1-2次。類糜蛋白酶抗體(IgM，0．2μg/μL，1∶100稀釋)標記，置于4℃冰箱中過夜。PBS洗滌1次，分別加入抗IgM抗體-PE及抗類胰蛋白酶抗體PE-Cy5(IgG，0．33μg/μL，1∶100稀釋)，室溫暗置2 h或4℃過夜，制成0．5 mL細胞懸液。流式測試的對照組:取細胞懸液0．2 mL，PBS洗滌1次。0．2%Triton X-100處理10 min，PBS洗滌1次。分別加入以上兩種抗體對應熒光的同型物。

2．5 流式細胞儀檢測

使用FACSCalibur流式細胞儀(BD．Co．USA)檢測鼠腹腔細胞的細胞懸液樣品。以亞離子激光488 nm激發(fā)，當懸浮細胞逐個地通過檢測區(qū)時光學系統(tǒng)檢測熒光信號，以MC抗體對應的同型物為對照組，根據(jù)MC特征性蛋白酶免疫熒光標記對細胞內類胰蛋白酶-PE Cy5及類糜蛋白酶-PE進行雙參數(shù)分析。每組樣品進行3次實驗，每次獲10 000個細胞的實驗數(shù)據(jù)。

2．6 統(tǒng)計分析

以SSPS 13．0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行T檢驗。

3 結果

3．1 組織化學觀察MC在腸壁中的遷移

以堿性染料甲苯胺藍染色，肥大細胞內的顆粒被染成紫紅色。光鏡下MC主要存在于小腸黏膜、黏膜下層、肌層和漿膜，在小腸絨毛上皮細胞間可見較多的MC存在［20］。本研究觀察各實驗組，①在未受到誘導時，MC主要分布于小腸絨毛上皮細胞間(圖1a，箭頭所示)，平滑肌層與粘膜下層較薄，MC分布較少。②食管癌EC109細胞株及其一系列誘導試劑植入小鼠腹腔后，通過腸組織切片觀察在小鼠腸壁面向腹腔的平滑肌層與粘膜下層有大量MC的分布(圖1b至e，箭頭所示)。從各圖比較可見:將胰酶和/或As2O3植入腹腔均能刺激鼠腸壁的平滑肌層與粘膜下層增厚，組織細胞間隙的增大可能有利于MC在此遷移及遷入腹腔。因此，食管癌EC109細胞株及其一系列誘導植入后，小鼠腹腔環(huán)境的改變影響到MC遷入腹腔。

圖1 a:無癌細胞或誘導劑處理;b:食管癌細胞;c:食管癌細胞和胰酶;d:食管癌細胞和As2O3;e:食管癌細胞、As2 O3和胰酶。肥大細胞如箭頭所示(TB X 400)Fig．1 a:No cancer cell or inducers inducing;b:Esophageal carcinoma cells;c:Esophageal carcinoma cells and Tyrisin;d:Esophageal carcinoma cells and As2 O3;e:Esophageal carcinoma cells，As2 O3 and Tyrisin．Arrow shows the mast cell(TB X 400)

3．2 流式細胞儀對小鼠腹腔液的MC亞型確定

以激光波長488 nm激發(fā)，對熒光標記的MC特征蛋白酶抗體的細胞樣品進行鑒定，經(jīng)類胰蛋白酶-PE Cy5及類糜蛋白酶-PE雙參數(shù)分析。在雙通道檢測點圖中，X軸顯示類糜蛋白酶PE-Cy5(發(fā)射熒光波長667 nm)陽性;Y軸標為類胰蛋白酶PE(發(fā)射波長578 nm)陽性。見圖2，R1區(qū)域的細胞群:為類胰蛋白酶陽性的MCT型肥大細胞群;R2區(qū)域的細胞群:是類胰蛋白酶和類糜蛋白酶陽性的MCTC型肥大細胞群;R3區(qū)域的細胞群:為類糜蛋白酶陽性的MCC型肥大細胞群。因此，可將小鼠腹腔液中MC分型確定為類似人類的T型，TC型及C型三個亞型。

圖2 R1區(qū)域:類胰蛋白酶陽性的MCT型;R2區(qū)域:類胰蛋白酶和類糜蛋白酶陽性的MCTC型;R3區(qū)域:類糜蛋白酶陽性的MCC型Fig．2 R1 region:MCT subtype of tryptase positive;R2 region:MCTC subtype of tryptase and chymase positive;R3 region:MCC subtype of chymase positive

圖3 * MCT型，組3與組2，4和5比較，#P＜0．05。* MCTC型，組3與組2，4比較，#P＜0．05。＊＊MCC型，組3或5與組2，4比較，#P＜0．01。＊＊總MC，組3與組2，4，5比較，#P＜0．01;*組5與組2，4，3比較，#P＜0．05Fig．3 * MCT subtype，Group 3 compared with group 2，4 and 5，#P＜0．05．* MCTC subtype，Group 3 compared with group 2 and 4，#P＜0．05．＊＊MCC subtype，Group 3 or 5 compared with group 2 and 4，#P＜0．01．＊＊Total MC，Group 3 compared with group 2，4 and 5，#P＜0．01，* Group 5 compared with group 2，4 and 3，#P＜0．05

3．3 不同的誘導對肥大細胞募集的影響

不同的誘導影響肥大細胞三種亞型在鼠腹腔細胞中的比率，見圖3。組1腹腔未植入癌細胞，腹腔液中為鼠的腹腔細胞;組2至5植入癌細胞和/或誘導試劑，腹腔液主要含有鼠腹腔細胞和癌細胞。組2至5的細胞成分較一致，可進行組間鼠腹腔微環(huán)境MC亞型變化的比較:①組3，胰酶可誘導MC在鼠腹腔細胞中的百分率增加;②組2與組4比較，As2O3無明顯誘導MC遷入腹腔;③組3與 組5，胰酶誘導MCC型遷入腹腔的百分率增加。不同的誘導促使鼠腹腔細胞中肥大細胞三種亞型占總MC的百分率變化，見圖4。①組1，在小鼠未受到誘導時，主要是MCT型遷入鼠腹腔;②組3和 組5，胰酶誘導MCC型遷入鼠腹腔比率增加，MCT型遷入比率減弱;③組2和 組4，植入EC109細胞后，MCT型遷入比率增加;④As2O3對各亞型的遷入影響不明顯。因此，小鼠腹腔植入癌細胞和/或誘導試劑處理后，鼠腹腔液的微環(huán)境發(fā)生變化。食管癌EC109細胞可誘導MCT型遷入鼠腹腔比率增加(圖4，組2和4);胰酶誘導腹腔中三種MC亞型遷入比率增加(圖3，組3)。

4 討論

肥大細胞在1878年由Ehrlich等第一次描述，像所有造血系細胞一樣來源于骨髓造血干細胞。其前體通過血循環(huán)到達目標組織而分化［21，22］，成熟的肥大細胞分布于多種組織，以皮膚，呼吸道和消化道較多［23］。過去的一個多世紀，對MC功能的研究不僅確定了其在過敏和炎癥反應中組織重塑、傷口愈合、關節(jié)炎、過敏和哮喘［24-26］方面的貢獻，而且證實它參與了腫瘤生長的進程。許多實體腫瘤的研究發(fā)現(xiàn):MC滲透到腫瘤和健康組織之間，在腫瘤的生長中，MC對血管生成、組織重構和免疫調制等起關鍵的角色。雖然MC和腫瘤進展之間的相互關系及作用機制尚不清楚，但對腫瘤相關MC的研究表明這些細胞參與腫瘤進展，通過中介產物促進局部的血管生成［27-29］。近年的研究表明，MC可能作為一種癌癥治療中新的治療目標，抑制MC的功能可能會導致腫瘤回歸［30，31］。生物體為應對機體內或外的一系列刺激，體內MC可大量地招募到不同的組織。在這些誘導研究中，來源于腫瘤細胞誘導的鼠模型的實驗數(shù)據(jù)顯示了生物體內腫瘤進程中MC的功能，補充了人類患者的相關研究。本研究實驗中，利用食管癌EC109細胞和/或誘導試劑植入小鼠腹腔，觀測鼠腸組織形態(tài)及腹腔液中MC的變化。從組織化學圖像觀察:食管癌EC109細胞植入鼠腹腔對腸組織形態(tài)無明顯的影響;胰酶的植入可誘導腸組織的平滑肌層及粘膜下層增厚及MC增多;As2O3誘導腸組織的平滑肌層及粘膜下層增厚。由此可能影響MC的遷移，改變小鼠腹腔內的微環(huán)境。

Fig．4 MCC subtype，Group 3 compared with group 2 and 4，#P＜0．01;with group 1 and 5，#P＜0．05;Group 5 compared with group 1，2 and 4，#P＜0．01．MCT subtype，Group 1 compared with group 3 and 5，#P＜0．01;with group 2 and 4，#P＜0．05;Group 3 compared with group1，2，4 and 5，#P＜0．01;Group 5 compared with group1，2，3 and 4，#P＜0．01圖4 * MCC型，3組與2，4組比較，#P＜0．01，與1，5組比較，#P＜0．05;5組與1，2，4組比較，#P＜0．01。＊＊MCT型，1組與3，5組比較，#P＜0．01，與2，4組比較，#P＜0．05;3組與1，2，4，5組比較，#P＜0．01;5組與1，2，3，4組比較，#P＜0．01

因肥大細胞的特征酶在進化中的保守特性，哺乳動物MC的類胰蛋白酶和類糜蛋白酶具有同源性［17，18］。研究發(fā)現(xiàn)在某些方面，人MCTC對應嚙齒動物的漿膜肥大細胞，而MCT近似粘膜肥大細胞［14］。小鼠肥大細胞的蛋白酶mMCP-6和7(又稱類胰蛋白酶)和mMCP-4和5(即類糜蛋白酶)［19］，在腫瘤進展中，mMCP的表達不斷發(fā)生改變［32］。由此，本研究為探討鼠腹腔植入食管癌EC109細胞和/或誘導試劑，癌細胞遷入后腹腔微環(huán)境的變化。使用熒光標記的類胰蛋白酶和類糜蛋白酶抗體對鼠腹腔內環(huán)境的MC亞型進行鑒別，確認了鼠腹腔內環(huán)境應對癌細胞和/或誘導發(fā)生了改變:①未誘導組鼠腹腔MC以T型遷入為主，與人MCT型為腸道粘膜的主要遷移亞型相似［14］;②食管癌EC109細胞誘導MCT型遷入鼠腹腔比率增加;③胰酶誘導MCC遷入鼠腹腔比率增加，MCT遷入比率減弱;④As2O3對MC各亞型遷入腹腔的影響不明顯。因此，可以通過類胰蛋白酶和類糜蛋白酶亞型的差異表達，確定不同誘導物對腹腔微環(huán)境變化的影響。從以往大量的研究證明了MC亞型的組織適應性［33，34］，在實體腫瘤中MC滲透腫瘤和健康組織之間，MC的數(shù)量在惡性腫瘤顯著增加［35］;對腫瘤微環(huán)境內的MC亞型的鑒定可用于描述炎性細胞的滲透，并在腫瘤的發(fā)展中不斷地改變［30］。由此，我們可以確認:在未受胰酶的刺激下，食管癌EC109細胞可誘導MCT型遷入鼠腹腔，改變癌細胞周邊的微環(huán)境。

肥大細胞對腫瘤生長的影響可以分為直接作用于腫瘤細胞，如MC介導細胞毒性;或間接影響，如MC調控血管生成、組織周邊環(huán)境的改造和免疫細胞的募集［29，36］。有研究顯示鼠MC類胰蛋白酶mMCP-6和7可引起中性粒細胞和嗜酸性粒細胞侵入炎癥部位［37］，嗜酸性粒細胞能啟動毒殺腫瘤細胞［38］。這些類胰蛋白酶也可能參與細胞外基質成分的降解，對新血管形成和腫瘤進展至關重要［39，40］。因此，類胰蛋白酶變化可能會影響到腫瘤進展過程。本研究結果顯示:食管癌EC109細胞誘導MCT(含類胰蛋白酶)型向鼠腹腔遷移的比率增加，與胰酶誘導MCC型向鼠腹腔遷移不同，呈現(xiàn)出肥大細胞表型在不同組織及不同誘導的“異質性”，改變了癌細胞周邊的微環(huán)境，有可能誘導其它炎性細胞向鼠腹腔遷移--介導細胞毒殺作用(有待進一步研究)，進而影響食管癌細胞的生長。

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