去泛素化酶與腫瘤＊

唐時(shí)珺，陳 松，葉 茂*

(1．湖南大學(xué)生物學(xué)院分子科學(xué)與分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙410082;2．湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖南 長沙410006)

泛素是由76個(gè)氨基酸組成的球形熱穩(wěn)定蛋白。在真核細(xì)胞中，泛素的結(jié)構(gòu)高度保守，蛋白質(zhì)接受一些信號(如磷酸化、氧化、錯(cuò)誤折疊、損傷等)能引發(fā)其泛素-蛋白酶體降解途徑。泛素-蛋白酶體降解途徑是指靶蛋白通過一系列的酶促反應(yīng)被泛素鏈標(biāo)記進(jìn)而在蛋白酶體中降解，而泛素分子則可以被釋放出來重復(fù)利用的過程。酶促反應(yīng)包括三步:泛素激活酶E1激活游離的泛素分子并形成E1-泛素復(fù)合物;泛素結(jié)合酶E2催化E1-泛素復(fù)合物形成高能磷酸鍵相連的E2-泛素復(fù)合物;泛素連接酶E3識別靶蛋白并將泛素鏈連接到靶蛋白上，真核生物中還存在一些E2(如RAD6/UBC2等)，不需要E3的參與就能直接識別靶蛋白并標(biāo)記上泛素鏈［1］。近來研究表明，泛素化是一個(gè)可逆的過程，去泛素化酶能夠水解泛素羧基末端的異肽鍵，將泛素分子特異性地從底物蛋白或者前體蛋白上水解下來，逆轉(zhuǎn)泛素化過程。去泛素化酶的活性直接影響細(xì)胞內(nèi)多種蛋白的周轉(zhuǎn)率、活性、再生以及定位，在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境自穩(wěn)態(tài)的維持、促進(jìn)蛋白的穩(wěn)定或降解以及細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起著極其重要的作用［2］。其蛋白結(jié)構(gòu)的改變、異常的時(shí)空表達(dá)以及活性的失控都會引起多種疾病，如關(guān)節(jié)炎、神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病、腫瘤等。在人類腫瘤中，去泛素化酶可以作為癌基因或抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，以其作為分子靶標(biāo)，通過藥物干預(yù)其活性，抑制腫瘤的生長，已經(jīng)成為目前開發(fā)新型抗腫瘤藥物的熱點(diǎn)。本文綜述了近年來去泛素化酶在腫瘤領(lǐng)域的相關(guān)研究進(jìn)展。

1 去泛素化酶家族

至今已發(fā)現(xiàn)去泛素化酶家族有99個(gè)成員，大部分都屬于半胱氨酸蛋白酶?；谒鼈兊陌被嵝蛄泻头肿咏Y(jié)構(gòu)的相似性，可將它們分為以下6個(gè)家族，各家族的成員統(tǒng)計(jì)如圖1。

1．1 泛素蛋白羧基端水解酶家族(ubiquitin C-terminal hydrolase，UCHs)

UCH屬于半胱氨酸蛋白酶，已發(fā)現(xiàn)人類基因編碼的UCH有UCHL1、UCHL3、UCHL5/UCH37和BAP1(BRCA1 associated protein-1)，它們作用的底物通常是一些小分子多肽。UCHs可以通過裂解C末端的氨基酸和酯鍵，將泛素分子從底物上釋放出來。UCHs活性位點(diǎn)上的狹窄裂隙和環(huán)狀結(jié)構(gòu)直徑的限制在一定程度上起到了特異性識別底物的功能，阻止了它對一些大分子泛素化蛋白的結(jié)合和催化［3］。

1．2 泛素蛋白特異性蛋白酶家族(ubiquitin-specific protease，USPs)

USPs亦屬半胱氨酸蛋白酶，是目前已知包含成員最多(＞50個(gè))的去泛素化酶家族。該家族成員都含有一個(gè)高度保守的USP結(jié)構(gòu)域，由3個(gè)亞結(jié)構(gòu)域組成，類似于人右手的大拇指、手掌和手指。手掌和大拇指亞結(jié)構(gòu)域之間形成催化活性中心，而手指亞結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)與泛素相互作用［4］。此外，許多USPs還有其它的結(jié)構(gòu)域和末端延伸，對它們的活性和特異性也起著非常重要的作用，包括B-box結(jié)構(gòu)域(CYLD)、鋅 指USP結(jié) 構(gòu) 域(USP3、USP5、USP39、USP44、USP45、USP49和USP51)、泛素相關(guān)結(jié)構(gòu)域(USP5和USP13)、核酸外切酶III結(jié)構(gòu)域(USP52)等。盡管USPs成員結(jié)構(gòu)具有多樣性，但是大多數(shù)USPs都具有共同的特征，即與泛素結(jié)合后引起構(gòu)象改變，促進(jìn)其由失活狀態(tài)向催化活性狀態(tài)的轉(zhuǎn)變。

1．3 卵巢腫瘤(ovarian tumor)相關(guān)蛋白酶(the OTU-related protease，OTUs)

OTU結(jié)構(gòu)域最初是通過生物信息學(xué)的方法在黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)的卵巢腫瘤基因中被發(fā)現(xiàn)［5］。雖然OTU與其他已知的去泛素化酶沒有序列同源性，但是它也有一個(gè)半胱氨酸蛋白酶位點(diǎn)，因此也具有去泛素化酶的活性。在人體內(nèi)有16種OUT存在，從進(jìn)化上可以分為四類:OTUs，Otubains(OTUBs)，A20類似的OTUs以及OTULIN(ovarian tumor DUB with linear linkage specificity)［6］。OTU

家族成員對不同類型的多泛素鏈連接具有明顯的識別特異性。OTUB1對識別K48(表示泛素蛋白第48號的賴氨酸)連接的多泛素鏈有高度的特異性，而OTUB2能剪切K63和K48連接的多泛素鏈［7，8］。A20和Cezanne分別特異性識別K48和K11連接的多泛素鏈，而TRABID既可以作用于K29也可以作用于K33連接的多泛素鏈，OTULIN能特異性水解M1連接的多泛素鏈［9］。OUT家族成員具有識別不同連接類型的多泛素鏈的特異性很可能是其識別底物的基礎(chǔ)。

1．4 Machado-Joseph病蛋白酶(Machado-Joseph disease protein domain proteases，MJDs)

目前，該家族僅有四個(gè)成員:ATXN3(ataxin3)、ATXN3L、JOSD1和JOSD2。ATXN3可以作為多泛素鏈編輯酶調(diào)控蛋白折疊和穩(wěn)定［10］，而且它的泛素水解酶活性對于維持正常壽命必不可少［11］。此外，ATXN3L、JOSD1和JOSD2也具有去泛素化活性。所有成員都有由高度保守的一個(gè)半胱氨酸和兩個(gè)組氨酸殘基形成的催化三聯(lián)體。除了Josephlin結(jié)構(gòu)域，ATXN3和ATXN3L還有泛素相互作用基序，很可能介導(dǎo)蛋白多聚體中蛋白與泛素的相互作用［12］。

1．5 JAMM/MPN結(jié)構(gòu)域相關(guān)的金屬蛋白酶家族(JAMM/MPN domain-associated metallopeptidases，JAMMs)

JAMMs是去泛素化酶中唯一具有金屬蛋白酶活性的家族。AMSH(associated molecule with SRC homology 3 domain of STAM)和AMSH-LP(AMSH-like protein)能特異性裂解K63連接的聚泛素鏈［13］，而JAMM的其他成員對于K63連接的聚泛素鏈沒有特異性，卻有異肽酶(isopeptidase)活性，如POH1/PSMD14(26Sproteasome-associated PAD1 homolog 1)、MPND(MPN domain-containing protein)等［14］。

1．6 MCPIP(monocyte chemotactic protein-induced protein)

該家族是最近發(fā)現(xiàn)具有去泛素化酶活性的新家族。MCPIP有7個(gè)成員，MCPIP1～7。它的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為:N端為泛素結(jié)合域，中間序列為CCCH-Zn指結(jié)構(gòu)，C端富含多個(gè)脯氨酸。酶活性中心包含類似于其他去泛素化酶的半胱氨酸盒和天冬氨酸盒，但是沒有組氨酸盒。MCPIP1能對TRAF-2(TNF receptor associated factor)、TRAF-3和TRAF-6去泛素化來負(fù)向調(diào)節(jié)JNK(c-Jun N-terminal kinase)的活性［15］。

圖1 去泛素化酶家族成員統(tǒng)計(jì)圖Fig．1 The classification of human DUBs

2 去泛素化酶的作用機(jī)制

2．1 泛素前體的加工

真核細(xì)胞中有兩種編碼泛素的基因類型，第一類是多個(gè)泛素基因的重復(fù)序列，編碼出來的是多個(gè)泛素首尾相連鏈;第二類是泛素與核糖體的融合基因，融合基因表達(dá)出單個(gè)泛素和核糖體的融合體。這兩類基因的初表達(dá)產(chǎn)物都稱為泛素前體蛋白(ubiquitin precursor)。UCHL1通過水解作用把第一類泛素前體蛋白分解成多個(gè)泛素單體，把第二類泛素前體蛋白分解成單個(gè)泛素及核糖體［16］。

2．2 泛素鏈的編輯

泛素分子中含有多個(gè)賴氨酸位點(diǎn):Lys6(K6)、Lys11(K11)、Lys27(K27)、Lys29(K29)、Lys33(K33)、Lys48(K48)、Lys63(K63)。泛素鏈中相鄰泛素之間大部分是通過賴氨酸殘基來連接。因此泛素鏈中泛素的連接形式有很多種(可以是上面任意兩種的搭配，K48和K63這兩種類型混合居多，其中以兩種及兩種以上的賴氨酸位點(diǎn)相連接的泛素鏈稱為異形鏈)，分別傳遞不同的信息。去泛素化酶能夠編輯和改變泛素鏈中泛素分子的連接形態(tài)，轉(zhuǎn)變傳達(dá)的信號，防止底物被降解。

2．3 底物降解的調(diào)節(jié)

在底物被泛素-蛋白酶體復(fù)合物降解之前，E3連接酶能起到增加底物上泛素分子的作用，因而也是一些去泛素化酶的靶蛋白。這些去泛素化酶通過對E3連接酶的修飾來改變或阻斷E3連接酶的連接功能，因而阻止了底物與泛素鏈的連接，達(dá)到去泛素化的作用。p53是細(xì)胞中的抑癌蛋白，Mdm2是p53泛素化-蛋白酶體降解途徑中的E3連接酶。去泛素化酶USP10分子能抑制Mdm2對p53和泛素鏈的連接作用，通過對p53進(jìn)行去泛素化來增強(qiáng)p53的穩(wěn)定性［17］。

2．4 底物活性的調(diào)節(jié)

去泛素化酶能直接水解底物上的單個(gè)泛素分子或聚泛素鏈，將底物從泛素連接中釋放出來，底物的活性被激發(fā)。

2．5 泛素的循環(huán)利用

在連有異形泛素鏈的底物被蛋白酶體降解之前，去泛素化酶可以先將整個(gè)異形泛素鏈從底物上切掉，這條被切掉的泛素鏈再進(jìn)一步被水解成單個(gè)泛素，以便循環(huán)利用。例如，Ubp6通過其氨基末端的一個(gè)類似于泛素分子的結(jié)構(gòu)直接與蛋白酶體的19S調(diào)節(jié)亞基結(jié)合并引起構(gòu)象改變，協(xié)助將進(jìn)入蛋白酶體中的泛素化底物上的泛素分子分離再循環(huán)［18］。基因Ubp6缺失引起細(xì)胞內(nèi)蛋白去泛素化及降解異常，并導(dǎo)致游離狀態(tài)的泛素和靶蛋白的水平均降低。

2．6 去泛素化酶活性的調(diào)節(jié)

與去泛素化酶相連接的某些特異性蛋白能通過在底物上聚集去泛素化酶或調(diào)節(jié)去泛素化酶的去泛素化特性，起到激活去泛素化酶的作用，進(jìn)而將底物去泛素化。如研究發(fā)現(xiàn)，26S蛋白酶體含有Rpn13結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域可以富集一部分UCH37到26S蛋白酶體的表面［19］。UCH37因而被激活，分離泛素分子以便循環(huán)作用。

3 去泛素化酶在腫瘤中的功能作用

3．1 細(xì)胞周期調(diào)控

腫瘤是一類細(xì)胞周期性疾病，許多癌基因、抑癌基因直接參與細(xì)胞周期的調(diào)控，或者本身就是細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制的主要成分，它們的異常，常導(dǎo)致細(xì)胞周期的失控，使細(xì)胞獲得以增殖過多、凋亡過少為主要形式的失控性生長特征。

近年來發(fā)現(xiàn)多種去泛素化酶參與細(xì)胞周期各時(shí)期的調(diào)控。USP37在被CDK2活化后，通過去泛素化cyclin，促進(jìn)細(xì)胞分裂進(jìn)入S期。去泛素化酶BAP1(BRCA1-associated protein-1)能與轉(zhuǎn)錄因子YY1(Yin Yang1)［20］，HCF1(host cell factor1)［21］形成復(fù)合物共同調(diào)控HCF1/E2F應(yīng)答的啟動(dòng)子，從而控制基因的轉(zhuǎn)錄，影響細(xì)胞從G1至S期的轉(zhuǎn)變。去泛素化酶還可以通過影響核轉(zhuǎn)錄因子的穩(wěn)定性來調(diào)控細(xì)胞周期。c-Myc是一個(gè)癌基因編碼蛋白，能調(diào)控細(xì)胞生長、增殖及凋亡。c-Myc的泛素化依賴于E3連接酶SCFFbw7α(SKP1，CUL1，ROC1 and FBW7α)，去泛素化酶USP28通過識別SCFFbw7α來與c-Myc結(jié)合，將其去泛素化，最終促進(jìn)細(xì)胞增殖［22］，而DNA損傷可以導(dǎo)致USP28與c-Myc解離，引起細(xì)胞周期停滯，因此，USP28功能上可以作為DNA損傷檢查點(diǎn)的調(diào)控因子。去泛素化酶HAUSP(USP7)能特異性結(jié)合核轉(zhuǎn)錄因子p53，去泛素化并穩(wěn)定p53蛋白，促進(jìn)其靶標(biāo)基因p21的表達(dá)，引起細(xì)胞周期的阻滯，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長［23］。

3．2 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控

在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，細(xì)胞在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)上表現(xiàn)出與正常細(xì)胞的許多區(qū)別，一些與細(xì)胞生長、分裂和增殖有關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路處于異?；钴S的狀態(tài)，一些在腫瘤細(xì)胞中本應(yīng)處于活化狀態(tài)的一些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如凋亡通路則往往傳遞信號受阻。目前研究表明，DUBs通過介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控，參與腫瘤的演進(jìn)過程。

3．2．1 p53-Mdm2通路 到目前為止，USP2，USP4，USP5，USP7，USP10，USP29以及Otub1(Otubain1)都參與p53-Mdm2通路的調(diào)控。HAUSP/USP7能動(dòng)態(tài)調(diào)控p53-MDM2通路，促進(jìn)p53和MDM2的穩(wěn)定。而USP2只能對MDM2去泛素化，間接調(diào)控p53［24］。OTUB1能抑制MDM2對p53的泛素化，穩(wěn)定p53［25］。USP10雖然不與MDM2相互作用，但能穩(wěn)定野生型和突變型p53［26］。在應(yīng)激條件下，USP29能去泛素化并穩(wěn)定p53［27］。最近研究還報(bào)道出USP4能去泛素化ARF-BP1(一種泛素連接酶)，促進(jìn)p53的降解［28］。

3．2．2 NF-κB通路 去泛素化酶CYLD(cylindromatosis)是USP家族中的一員，是NF-κB信號通路的負(fù)調(diào)控因子。A20(TNFAIP3)雖然屬于去泛素化酶OTU家族，但其C端有一個(gè)促泛素連接的結(jié)構(gòu)域，因此又能促進(jìn)RIP的K48聚泛素化。當(dāng)然，A20和CYLD的去泛素化酶活性區(qū)域能把IKKγ、TRAF-2及TRAF-6上K63連接的聚泛素化鏈去掉［29，30］。相似的，USP21與Cezanne都能通過調(diào)控RIPK1的泛素化水平來抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性［31，32］。最新研究發(fā)現(xiàn)STAMBPL1(me-talloprotease STAM-binding proteinlike1)是一種調(diào)節(jié)Tax介導(dǎo)NF-κB活性的正調(diào)控因子［33］。Otud7b(又 稱Cezanne)能 通 過 去 泛 素 化TRAF-3阻 止 異 常 的 非 經(jīng) 典NF-κB途 徑 激 活［34］。OTULIN與CYLD以及LUBAC(linear ubiquitin chain assembly complex)形成復(fù)合物能抑制LUBAC介導(dǎo)的線性泛素化以及NF-κB的激活［35］。

3．2．3 RTKs通路 現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)至少有4種去泛素化酶(USP8，USP18，AMSH，POH1)動(dòng)態(tài)調(diào)控RTKs信號通路中的因子如EGFR，Met及ErbB2等。USP8能通過去泛素化RTKs以達(dá)到RTKs的循環(huán)利用［36］。AMSH能促進(jìn)EGFR在溶酶體中的循環(huán)［37］。USP18則調(diào)控EGFR的合成及激活miR-7(microRNA-7)宿主基因的轉(zhuǎn)錄，從而有利于癌細(xì)胞的生長［38］，而POH1能對EbrB2的泛素水平進(jìn)行調(diào)控［39］。

3．2．4 Wnt通路 Wnt是胚胎發(fā)展期必需蛋白，在癌癥中有高表達(dá)。去泛素化酶CYLD能去泛素化Dvl(Dishevelled)，負(fù)調(diào)控Wnt信號通路［40］。相似的，USP4去泛素化T-Cell factor4(TCF4)，USP15穩(wěn)定APC(adenomatous polyposis coli)，USP4和USP15都是Wnt信號通路的負(fù)調(diào)控因子［41，42］。而USP34則通過阻礙β-catenin轉(zhuǎn)錄，正調(diào)控Wnt信號通路［43］。

3．2．5 TGF-β通路 目前研究表明，五種去泛素化酶(USP4，USP15，USP9X，AMSH-LP，UCHL5)在TGF-β信號通路中都有重要作用。USP9X能對SMAD4(mothers against decapentaplegic homolog 4)去泛素化，USP9X的缺失會阻礙由TGF-β介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞軸突形成［44］。USP15能去泛素化R-SMADs(receptor-activated SMADs)［45］。AMSH-LP和UCHL5能與SMAD的抑制蛋白I-SMADs相互作用來調(diào)控TGFβ應(yīng)答［46，47］。USP4去泛素化TβR1(TGF-βtype1 receptor)，因而是TGF-β信號通路的誘導(dǎo)物［48］。

3．3 DNA損傷修復(fù)與染色質(zhì)的修飾

腫瘤發(fā)生與DNA損傷修復(fù)機(jī)制密切相關(guān)。USP1能調(diào)控增殖細(xì)胞中的核抗原泛素化水平，還能與U2AF1(U2 small nuclear ribonucleoparticle auxiliary factor1)形成復(fù)合物通過同源重組促進(jìn)雙鏈DNA損傷修復(fù)［49］。BRCC36、USP3、USP16、OTUB1和USP44能對參與DNA雙鏈損傷修復(fù)的泛素連接酶RNF8/RNF168(ring finger protein 8/168)進(jìn) 行 調(diào) 控［50，51］。USP7、USP21、USP22以及MYSM1(myb-like，SWIRM and MPN domains 1)能和組蛋白(主要是H2A和H2B)相 互 作 用 來 調(diào) 節(jié) 染 色 質(zhì) 的 動(dòng) 態(tài) 結(jié) 構(gòu)［52，53］。UCHL5能與蛋白酶體聯(lián)合調(diào)控染色質(zhì)的修飾復(fù)合物lno80［54］。

4 總結(jié)和展望

去泛素化酶的種類較多，結(jié)構(gòu)多樣，功能復(fù)雜，作為蛋白泛素化的關(guān)鍵性調(diào)控因子，直接影響細(xì)胞內(nèi)多種蛋白的周轉(zhuǎn)率、活性、再生以及定位，并且與腫瘤的發(fā)生與演進(jìn)密切相關(guān)。隨著最近靶向泛素-蛋白酶體用于臨床治療的成功，去泛素化酶已經(jīng)成為非常有希望的抗腫瘤分子靶標(biāo)。到目前為止，已經(jīng)成功篩選出一批特異性靶向去泛素化酶的小分子化合物如P5091、HBX19818、HBX28258等。進(jìn)一步深入的理解去泛素化酶的催化活性、調(diào)控機(jī)制以及底物識別的特異性，將有助于靶向去泛素化酶的策略真正應(yīng)用于臨床抗腫瘤治療。

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