余甘子葉中總黃酮的最佳提取條件的研究

鄭純麗 衷明華

(韓山師范學(xué)院化學(xué)系，廣東 潮州 521041)

余甘子葉Phyllanthus emblica L.系大戟科( Euphorbiaceae)葉下珠屬( Phyllanthus)落葉小喬木或灌木的葉。其具有廣泛的藥理作用，能清除自由基、抗氧化、抗肝損傷、抗炎、抗誘變、抗致畸和抗腫瘤等[1]。

黃酮是廣泛存在于自然界的一大類化合物，存在于植物的所有部分，包括根、心材、樹皮、葉、果實(shí)和花中[2]。植物中總黃酮的提取方法主要有乙醇浸提法、微波萃取法、超聲波法、酶解法等。目前關(guān)于余甘子葉中黃酮類化合物提取的研究報道并不多見,所以本課題以乙醇為溶劑超聲波輔助提取余甘子葉中的總黃酮，并對其最佳提取條件進(jìn)行研究。

1 實(shí)驗(yàn)材料、儀器和試劑

1.1 材料

余甘子葉采摘于汕頭市潮陽區(qū)。

1.2 儀器

DDG-9240電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海精密儀器儀表有限公司)；

JFSD-100-Ⅱ粉碎機(jī)(上海嘉定糧油儀器有限公司)；

T-214型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；

15QC73-30升旋片式真空泵(廣東省清城醫(yī)療器械廠)；

KQ-250型超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器有限公司)；

TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)。

1.3 試劑

蘆丁、石油醚、無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉。

2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和方法

2.1 黃酮含量的測定

2.1.1 材料預(yù)處理

將采摘回來的余甘子葉進(jìn)行篩選，用蒸餾水清洗，晾干后于60℃的干燥箱中干燥48h，充分干燥后粉碎、進(jìn)行二次篩選，將篩選所得粉末裝入干凈的藥劑瓶中，備用。

2.1.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱取在100℃干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20.0 mg ,用50%的乙醇溶液溶解，并轉(zhuǎn)入100 mL 的容量瓶中，用50%的乙醇溶液稀釋到刻度，搖勻，使之成為濃度為0.2mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.1.3 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別取0.5mL,1.0mL、1.5mL、2.0mL、3.0mL、3.5mL、4.0mL，4.5mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于8支25 mL比色皿中。加入1 mL5%亞硝酸鈉溶液,搖勻，放置7 min，加入1 mL10%硝酸鋁溶液，搖勻，放置7 min，加10 mL10%氫氧化鈉，加50%的乙醇溶液至刻度，搖勻，放置15 min 。按分光光度法，在510 nm 波長處測定吸光度，用空白試劑做參比。

以吸光度A為縱坐標(biāo)y，濃度C為橫坐標(biāo)x，得到蘆丁質(zhì)量濃度C和吸光值A(chǔ)的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程

y=9.8350x+0.0388，R2=0.9945。即A=9.8350C+0.0388

2.1.4 總黃酮的含量測定

用電子天平精確稱取粉碎后的余甘子葉粉末1.0000g，用石油醚出去余甘子葉中的脂類和部分色素。加入一定濃度乙醇，在一定的時間和溫度下采用超聲波法提取。提取后將溶液定容為100mL，即為待測液。

取1mL上層提取液于25mL比色管中，加入1mL5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，放置7min后加入1mL10%硝酸鋁溶液，搖勻，放置6min后，再加入10mL氫氧化納溶液，用乙醇稀釋至刻度，搖勻，放置15min后在510nm處，測定其吸光度，用空白試劑做參比。

由蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程可以計(jì)算出黃酮的含量，進(jìn)而得出黃酮的提取率。

總黃酮含量(mg)=C×n×100

總黃酮提取率/% =(總黃酮含量/余甘子葉粉末的質(zhì)量)×100%

式中：C 為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的總黃酮質(zhì)量濃度/(mg/mL)；n 為稀釋倍數(shù)。

2.2 超聲波法提取余甘子葉中總黃酮的單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 乙醇濃度對黃酮提取率的影響

用電子天平精確稱取6份1.0000g的余甘子葉粉末，加入25倍量體積的石油醚靜置25min，除去余甘子葉中的脂類和部分色素，抽濾后將濾渣烘干。分別加入30ml濃度為30%，40%，50%，60%，70%，80%的乙醇溶液，在溫度為50℃，功率為250W的超聲波清洗器中提取40min，趁熱過濾，在510nm處測定吸光度，并計(jì)算黃酮的含量和提取率，結(jié)果見表1和圖1 。

表1 乙醇濃度對黃酮提取率的影響表

圖1 乙醇濃度對黃酮提取率的影響圖

由圖1可以看出，隨著乙醇濃度的增加，黃酮的提取率增加。當(dāng)乙醇濃度在40%-70% 時，隨著乙醇濃度的增加，黃酮的提取率增幅不大，當(dāng)乙醇濃度>70% 時，黃酮的提取率隨著乙醇濃度的增加大幅度增加。當(dāng)乙醇的濃度達(dá)到80%時，黃酮的含量最多。為了提高提取率，節(jié)約經(jīng)濟(jì)成本，所以不考慮乙醇濃度大于80%對黃酮提取率的影響，因此確定乙醇的最佳濃度為80% 。

2.2.2 提取時間對黃酮提取率的影響

用電子天平精確稱取6份1.0000g的余甘子葉粉末，加入25倍量體積的石油醚靜置25min，除去余甘子葉中的脂類和部分色素，抽濾后將濾渣烘干。加入濃度為80%的乙醇溶液，在溫度為50℃，功率為250W的超聲波清洗器中分別提取10min，20min，30min，40min，50min，60min，趁熱過濾，在510nm處測定吸光度，并計(jì)算黃酮的含量和提取率，結(jié)果見表2和圖2 。

表2 提取時間對黃酮提取率的影響表

圖2 提取時間對黃酮提取率的影響圖

由圖2可以看出，隨著提取時間的增加，黃酮的提取率先大幅度增加后趨于平緩，當(dāng)提取時間為60min時，黃酮的含量最多。由于過長時間的高溫提取對化合物結(jié)構(gòu)有影響，所以將不對于大于60min的提取時間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，故選擇最佳的提取時間為60min 。

2.2.3 料液比對黃酮提取率的影響

用電子天平精確稱取6份1.0000g的余甘子葉粉末，加入25倍量體積的石油醚靜置25min，除去余甘子葉中的脂類和部分色素，抽濾后將濾渣烘干。分別加入濃度為80%的乙醇溶液10ml，15ml，20ml，25ml，30ml，35ml，在溫度為50℃，功率為250W的超聲波清洗器中提取60min 。趁熱過濾，在510nm處測定吸光度，并計(jì)算黃酮的含量和提取率，結(jié)果見表3和圖3。

表3 料液比對黃酮提取率的影響表

圖3 料液比對黃酮提取率的影響圖

由圖3可以看出，隨著溶劑量的增加，黃酮的提取率逐漸減少，當(dāng)料液比為1:10時，黃酮的含量最多，因?yàn)橐紤]余甘子葉中的有效物質(zhì)是否充分溶出，所以不探討溶劑量小于10ml的實(shí)驗(yàn)，因此該實(shí)驗(yàn)選擇最佳的料液比是1:10 。

2.3 正交優(yōu)化試驗(yàn)

為了進(jìn)一步優(yōu)化超聲波提取總黃酮的條件，在以上單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對影響余甘子葉總黃酮得率的因素：乙醇濃度(A)、提取時間(B)、料液比(C)進(jìn)行L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，并以總黃酮含量作為提取工藝的判斷指標(biāo)。結(jié)果見表4、表5 。

表4 正交試驗(yàn)因素水平表

表5 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果

由表5的極差分析可知，因素間的交互作用對余甘子葉黃酮的提取影響很大，在本實(shí)驗(yàn)中，均值最大的其提取率最高。從表中可以看出，3種因素料液比對黃酮的提取率影響最大，由極差值可得出，各因素對余甘子葉中總黃酮提取率影響大小依次為C>A>B，即料液比>乙醇濃度>提取時間。提取余甘子葉總黃酮的最佳工藝參數(shù)為A3B2C1,即乙醇濃度為80%，提取時間為40min，料液比為1:10 。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以乙醇為溶劑超聲波輔助提取余甘子葉中的總黃酮。分析乙醇濃度、料液比和提取時間三個單因素對黃酮提取率的影響，采用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法測定，在波長為510nm測定余甘子葉中黃酮的吸光度，進(jìn)而得出黃酮的含量，找出其最佳水平，進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明料液比對余甘子葉黃酮的提取率影響最大，乙醇濃度次之，提取時間影響最小。提取余甘子葉總黃酮的最佳工藝參數(shù)為A3B2C1，即當(dāng)乙醇濃度為80%，提取時間為40min，料液比為1:10，黃酮的提取率為19.32% 。

用超聲波法具有較高的提取率[3]，工藝條件簡單，操作控制容易，穩(wěn)定性好，克服了常規(guī)方法提取時間長需要加熱處理操作步驟繁瑣等缺點(diǎn)[4]，具有廣闊的前景。

[1]鐘振國，黃金蘭，梁紅，等.余甘子葉化學(xué)成分沒食子酸對人肝癌BEL-7404細(xì)株凋亡的影響[J].中藥材，2009，32(7)：1097～1100.

[2]王芙蓉，吳冬青，安紅鋼，等.當(dāng)歸總黃酮提取工藝及體外抗氧化性研究[J].中醫(yī)獸醫(yī).

[3]蔡健，華景清，王薇，等.黃酮提取工藝研究進(jìn)展[N].淮陰工學(xué)院學(xué)報，2003,12(5)：82～85.

[4]王漢卿，王文蘋，閆津金，等.超聲提取枸杞葉中總黃酮提取工藝及其不同采收期含量變化研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17(8):44～47.