離線二維高速逆流色譜分離制備湖北海棠葉中的黃酮化合物

丁 瓊 任達(dá)兵 秦燕華 梁逸曾

(中南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院中藥現(xiàn)代化研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410083)

引言

湖北海棠(Malus hupehensis)，又稱茶海棠、野海棠，廣泛地作為一種觀賞樹(shù)種，其嫩葉可作茶，果能消食并供釀酒[1]。湖北海棠廣泛生長(zhǎng)于湖北西部山地，長(zhǎng)江中游，湖南，云南中、南部。湖北海棠含有茶多酚、黃酮、Zn、Cr、Mn等多種礦物質(zhì)等,具有抗菌消炎、耐缺氧、抗疲勞、降血糖等多種藥理作用[2]。

高速逆流色譜(high-speed countercurrent chromatography，簡(jiǎn)稱HSCCC)是由美國(guó)的Ito博士在液-液分配色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的新型制備分離色譜技術(shù)[3]。相對(duì)于其他色譜技術(shù)，HSCCC具有不需要固定相支撐體、溶劑可回收、樣品前處理要求低等優(yōu)點(diǎn)[4]。尤其是其無(wú)不可逆吸附的特點(diǎn)在天然物質(zhì)的分離提取中有無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)。雖然高速逆流色譜的引進(jìn)時(shí)間比較晚，但是它已經(jīng)廣泛用于天然產(chǎn)物的分離分析[5]。本文采用離線二維高速逆流色譜法[6]分離提取湖北海棠葉中的主要黃酮成分，獲得三個(gè)高純度黃酮化合物，為該中藥的提取工藝提供了一個(gè)新的選擇。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

TBE-300B半制備型高速逆流色譜儀(上海同田生物技術(shù)有限公司)，包括恒流泵，紫外檢測(cè)儀(254nm,280nm)，N2010色譜工作站，采用多層聚四氟乙烯螺旋管(直徑1.6nm，總?cè)莘e280mL)，20mL進(jìn)樣圈，HX-1050恒溫循環(huán)器(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)，BSZ-100自動(dòng)餾分收集器(上海青浦滬西儀器廠)。Ultimate 3000高效液相色譜(HPLC)儀(美國(guó)Dionex公司)，包括HPG-3x00RS二元梯度泵，WPS-3000RS自動(dòng)進(jìn)樣器，MWD-3000RS DAD檢測(cè)器，TCC-3000 RS柱溫箱，CHROMELEON色譜工作站，在線脫氣機(jī)。R-1002型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)；KQ3200B型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；AL104十萬(wàn)分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；QE-200 克中藥藥材粉碎機(jī)(浙江省武義縣屹立工具有限公司)；質(zhì)譜儀LCQ Advantage(美國(guó)Finnigan公司)；核磁共振儀INOVA-400(美國(guó)Varian公司)。

HPLC分析所用甲醇為色譜純?cè)噭?安徽時(shí)聯(lián)特種溶劑股份有限公司)；其余試劑正己烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、冰醋酸為分析純?cè)噭?天津恒興化學(xué)試劑制造有限公司)；水為自制二次蒸餾水。氘代二甲亞砜DMSO-d6(美國(guó)Cambridge Isotope Laboratories公司)用作核磁共振氫譜分析的溶劑。

1.2 湖北海棠葉的粗提取

稱取50 g干燥湖北海棠葉用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)60目標(biāo)準(zhǔn)篩，再用30倍量的60%甲醇溶液超聲提取3次，每次1 h。過(guò)濾后合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干得到浸膏。所得浸膏用80%甲醇重新溶解后，加入3倍體積水混溶，依次用正己烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取。乙酸乙酯萃取層旋蒸干得到浸膏1.03 g，置于真空干燥箱35 ℃中完全干燥，所得產(chǎn)物為黃褐色粉末狀物質(zhì)，置于冰箱中備用。

1.3 分配系數(shù)測(cè)定

在分液漏斗中將配制溶劑體系，完全混合后靜置1 h，取一定量的提取物溶于裝有等量上下相中，充分振蕩混合后靜置1 h。上下相各取1 mL進(jìn)行HPLC檢測(cè)，并計(jì)算分配系數(shù)，根據(jù)結(jié)果選擇合適的溶劑比例。分配系數(shù)計(jì)算公式：K=AU/AL(式中：AU、AL分別為上、下相中化合物的峰面積)。

1.4 離線二維高速逆流色譜分離制備

本研究中，采用兩步逆流色譜對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行分離純化。第一步，采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1：4：1：4，v/v)溶劑體系，作為分離制備湖北海棠葉乙酸乙酯萃取部位的高速逆流色譜分離體系。按比例將溶劑移取到分液漏斗中，充分振蕩混合后分層，室溫下靜置1 h，分取上下相，超聲脫氣備用。取200 mg乙酸乙酯萃取浸膏溶解與5 mL上相和5 mL下相，得到樣品溶液。逆流色譜分離中，首先以流速15 mL/min將上相泵入螺旋管柱作為固定相，待固定相充滿柱子后，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速至900 r/min，控溫在25 ℃，以2 mL/min的流速泵入流動(dòng)相。待系統(tǒng)平衡后，將10 mL樣品溶液通過(guò)進(jìn)樣閥注入分離管柱中，同時(shí)開(kāi)始采集數(shù)據(jù)，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為 280 nm。利用餾分收集器自動(dòng)收集流出液，各餾分經(jīng)HPLC分析后合并，并進(jìn)行核磁以及質(zhì)譜檢測(cè)。

第一步逆流色譜中，組分2和3未能達(dá)到理想分離，遂采用新的溶劑體系對(duì)其進(jìn)行分離。第二步逆流色譜中，采用的溶劑體系為正己烷-乙酸乙酯-甲醇-0.1 mol/L Cu2+水溶液(1：4：1：4，v/v)，逆流色譜操作條件同第一步。

1.5 液相色譜條件及產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定

液相條件：色譜柱：Hypersil ODS C18柱(250×4.6 mm，5 m)(大連依利特分析儀器有限公司)；流動(dòng)相：乙腈/0.4%醋酸水溶液(20：80，v/v),流速1.0 mL·min-1；檢測(cè)溫度25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；進(jìn)樣量10μL。

HSCCC各分離組分的結(jié)構(gòu)根據(jù)HPLC、ESI-MS和1H NMR數(shù)據(jù)進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理方法選擇

對(duì)湖北海棠葉的乙酸乙酯萃取層進(jìn)行HPLC分析，如圖1所示，圖中標(biāo)記組分1、2、3為主要組分，也即目標(biāo)提取物。以它們的HPLC峰面積為標(biāo)準(zhǔn)，摸索樣品前處理方法。圖2～4分別表明了甲醇濃度、超聲提取時(shí)間、料液比對(duì)目標(biāo)提取物濃度的影響。由圖2可以看到3種組分隨甲醇濃度的增加趨勢(shì)不一，為了在總黃酮含量較多的前提下，使含量相對(duì)少的組分更多地被提取，選擇提取溶劑為60%的甲醇溶液。由圖3可以看到3種組分濃度在超聲時(shí)間由0.5 h增加到1 h時(shí)增加迅速，而1 h之后增加緩慢，因此選擇超聲提取1 h。由圖4可以看到3種組分隨料液比的增加趨勢(shì)不一，同樣綜合考慮，選擇料液比1：30為提取條件。綜上，選擇湖北海棠葉的提取條件為60%的甲醇溶液、超聲提取1 h、料液比為1：30。

圖1 湖北海棠葉乙酸乙酯萃取層高效液相色譜圖

圖2 甲醇濃度對(duì)各組分HPLC峰面積的影響

圖3 超聲提取時(shí)間對(duì)各組分HPLC峰面積的影響圖

圖4 料液比對(duì)各組分HPLC峰面積的影響

2.2 HSCCC溶劑體系的選取

溶劑選擇是高速逆流色譜的最關(guān)鍵的一步。本研究中考慮到待分離化合物極性及常用性等因素，考察了樣品在幾種溶劑體系不同體積比下的分配系數(shù)K。

對(duì)于HSCCC來(lái)說(shuō)，K的最佳范圍為0.4～2.5[7]，分離因子α要大于1.5才能使兩組分分離效果好[8]。由表5 a)、b)兩組數(shù)據(jù)可以看出，組分2和組分3的K值一直很接近，在這些溶劑體系中均不能分開(kāi)，因此在組分1能分離出來(lái)的前提下，選擇耗時(shí)最少的正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1：4：1：4，v/v)體系。為了將未分開(kāi)的組分2和組分3分離，需要再做一次HSCCC分離?？紤]到Cu2+溶于水相，跟某些有機(jī)化合物能形成配合物，極大增加這些組分在水相中的溶解度，從而改變其分配系數(shù)，因此在已選擇的溶劑體系基礎(chǔ)上添加Cu2+。在表5中c)組數(shù)據(jù)可以看到，添加Cu2+之后，組分1和組分3的K值沒(méi)有顯著變化，而組分2的K值顯著減小，說(shuō)明Cu2+與組分2形成了配合物，從而增加了其在水相(下相)的溶解度，使組分2與組分3的分離因子大于1.5，然而在該體系中組分1和組分2在一次分離中不能分開(kāi)，所以該體系依然不能用于一次分離。所以，在第二次分離中，選擇正己烷-乙酸乙酯-甲醇-0.1 mol/LCu2+水溶液(1：4：1：4，v/v)為溶劑系統(tǒng)。

綜上所述，第一次HSCCC分離選擇正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1：4：1：4，v/v)分離出組分1，第二次HSCCC分離用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-0.1 mol/LCu2+水溶液(1：4：1：4，v/v)分離組分2和組分3。

表5 湖北海棠葉中三種組分在不同溶劑體系中的分配系數(shù)

2.3 離線二維高速逆流分離制備的結(jié)果

溶劑為正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1：4：1：4，v/v)時(shí)，對(duì)湖北海棠葉粗提物進(jìn)行第一次分離的固定相保留率為46%，分離時(shí)間為150 min。如圖5(a)所示，得到兩個(gè)峰，經(jīng)檢測(cè)第一個(gè)峰為組分1，第二個(gè)峰為圖1中組分2和組分3的混合物，幾乎完全重合，與選擇溶劑時(shí)的預(yù)判吻合。正己烷-乙酸乙酯-甲醇-0.1 mol/L Cu2+水溶液(1：4：1：4，v/v)時(shí)，對(duì)組分2和組分3進(jìn)行二次逆流分離的固定相保留率為48%，分離時(shí)間為120 min，如圖2(b)所示，兩峰完全分開(kāi)。將組分1、2、3分別通過(guò)HPLC檢測(cè)，面積歸一化法測(cè)定其純度分別為96.5%，98.1%和98.9%，濃縮干燥后得到質(zhì)量依次為25.4 mg，8.5 mg，31.3 mg。此結(jié)果表明離線二維對(duì)湖北海棠葉中主要成分的分離制備有很好的效果。提純合并后三種組分的HPLC色譜圖和紫外光譜圖光譜圖如圖6所示。

圖5 湖北海棠葉的離線二維高速逆流色譜圖：(a)湖北海棠葉粗提物HSCCC色譜圖；(b)湖北海棠葉2號(hào)和3號(hào)組分HSCCC色譜圖

圖6 三種物質(zhì)的HPLC色譜圖和紫外光譜圖

2.4 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：黃色粉末，UV max(nm)：285，220；ESI-MS m/z：451 [M-H]-，1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)：2.72(2H，t，J=7.4 Hz，β-H)，3.10～3.80(5H，m，多糖-H，α- H)，4.65(2H，t，J=7.2 Hz，α- H)，4.95(1H，d，J=7.3 Hz，H-1'')，5.93(1H，d，J=2.0 HZ，H-3')，6.12(d，J=7.0，2.1 Hz，H-5')，6.48(1H，dd，J=7.0，2.0 Hz，H-6)，6.58(1H，d，J=8.0 Hz，H-5)，6.60(1H，d，J=2.0 Hz，H-2)，其數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[9]3-羥基根皮苷的數(shù)據(jù)一致，故確定化合物為3-羥基根皮苷。

化合物2：黃色粉末，UV max(nm)：348，256，203；ESI-MS m/z：301 [M-H]-，1H-NMR(500 MHz, DMSO-d6)：6.16(1H，d，J=2.0 Hz，H-6)，6.36(1H，d，J=2.0 Hz，H-8)，6.87(1H，d，J=8.0 Hz，H-5')，7.61(1H，dd，J = 8.1，2.3 Hz，H-6')，7.72(1H，d，J=2.4Hz，H-2')，其數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[10]槲皮素的數(shù)據(jù)一致，故確定化合物為槲皮素。

化合物3：黃色粉末，UV max(nm)：285，222；ESI-MS m/z：435 [M-H]-，1H-NMR(500 MHz，DMSO-d6)：2.78(2H，t，β-H)，3.10～3.75(5H，m，多糖-H，α-H)，3.71(1H，d，J=11.1 Hz，H-5'')，4.93(1H，d，J=7.4 Hz，H-1'')，5.93(1H，d，J=2.0 Hz，H-3')，6.12(1H，d，J=2.2 Hz，H-5')，6.64(2H，dd，J=2.7，8.4 Hz，H-3，H-5)，7.04(2H，d，J=8.5 Hz，H-2，H-6)，其數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道根皮苷的數(shù)據(jù)一致[9], 故確定化合物為根皮苷。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)首次采用高速逆流色譜法對(duì)湖北海棠葉中的主要黃酮成分進(jìn)行分離制備。實(shí)驗(yàn)中采用離線二維HSCCC分離法，對(duì)于一次分離不成功的組分進(jìn)行再分離，成功得到了3種純度比較高的黃酮化合物，分別是3-羥基根皮苷、槲皮素、根皮苷。第一次耗時(shí)2.5 h，第二次耗時(shí)2.0 h，總耗時(shí)4.5 h，效率高，制備量大，有很好的工業(yè)應(yīng)用前景。

[1]方榮,楊茜,李莉,等.湖北海棠中根皮苷含量測(cè)定[J].食品科技, 2008, (06):195-6.

[2]汪鋆植,楊遠(yuǎn)兵.湖北海棠飲料的質(zhì)量研究[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2002,(02):59-61.

[3]ITO Y, CONWAY W D. High-speed countercurrent chromatography[J].1986.

[4]邸多隆,鄭媛媛,陳小芬,等.高速逆流色譜技術(shù)分離純化天然產(chǎn)物中黃酮類化合物的研究進(jìn)展[J].分析化學(xué),2011,(02):269-75.

[5]郭輝.高速逆流色譜技術(shù)在藥物和天然產(chǎn)物分離中的應(yīng)用[J].海峽藥學(xué),2007,(03):95-8.

[6]LIU Q, SHI S, LIU L, et al. Separation and purification of bovine serum albumin binders from Fructus polygoni orientalis using off-line two-dimensional complexation high-speed counter-current chromatography target-guided by ligand fishing [J]. J Chromatogr A,2013,1304(0):183-93.

[7]BRENT FRIESEN J, PAULI G F. GUESS—A generally useful estimate of solvent systems for CCC [J]. J Liq Chromatogr Relat Technol,2005,28(17):2777-806.

[8]ITO Y. Golden rules and pitfalls in selecting optimum conditions for high-speed counter-current chromatography [J]. J Chromatogr A,2005,1065(2):145-68.

[9]金弘昕,趙亞,賴小平,等.野金柴化學(xué)成分的分離和研究[J].中成藥,2012,34(12):2362-4.

[10]張旭,及元喬,李萍,等.松針的化學(xué)成分研究[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā),2006,18(4):621-3.