飼料亮氨酸水平對(duì)青蝦主要非特異性免疫指標(biāo)的影響

付天增 趙麗娟 李 嫻 曹振杰* 王雪鵬

（①山東省淡水漁業(yè)研究院 山東 濟(jì)南 250013 ②山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 山東 泰安）

蛋白質(zhì)是一切生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，同時(shí)蛋白質(zhì)也是水產(chǎn)動(dòng)物飼料中價(jià)值最高的成分。 蛋白質(zhì)由20種氨基酸組成，其中10種非必需氨基酸，8種必需氨基酸。亮氨酸(Leucine)被證明是青蝦的必需氨基酸之一，此外，亮氨酸和擷氨酸以及異亮氨酸被稱為支鏈氨基酸(BCAAs)。亮氨酸是支鏈氨基酸中唯一的生酮氨基酸，可以刺激胰島細(xì)胞釋放胰島素，和擷氨酸和異亮氨酸一起可以起到保護(hù)肌肉的作用，同時(shí)也可以抑制蛋白降解和促進(jìn)機(jī)體蛋白合成，主要表現(xiàn)在骨骼肌上；對(duì)血紅蛋白合成和維持血糖水平以及激素的增加有重要作用，同時(shí)是肌肉應(yīng)激和能量代謝上起重要作用；氨酸的缺乏可導(dǎo)致各組織和器官功能降低。

目前關(guān)于青蝦的蛋白取值范圍[1-2]已有所研究，魚(yú)類和凡納濱對(duì)蝦亮氨酸需要量及日本沼蝦賴氨酸的研究也有部分報(bào)道[3]，但對(duì)青蝦亮氨酸非特異性免疫的影響報(bào)道極少。本實(shí)驗(yàn)的研究目的是飼料中不同亮氨酸含量對(duì)一些主要非特異性免疫指標(biāo)丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)，超氧化物歧化酶(SOD)和酚氧化酶(PO)等的影響。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和飼料的制備 飼料配方及其營(yíng)養(yǎng)組成見(jiàn)表1。飼料以中糧蝦飼料為基礎(chǔ)飼料，添加L-晶體氨基酸以滿足蝦除亮氨酸外其它必需氨基酸的需要。飼料中亮氨酸的添加水平分別為0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%，實(shí)測(cè)各組飼料亮氨酸含量分別為：1.91%、2.13%、2.32%、2.50%、2.74%。

準(zhǔn)確稱量飼料，然后添加亮氨酸，采取逐級(jí)擴(kuò)大法混合均勻，用雙螺桿擠壓機(jī)制成粒徑為1mm以及1.5mm的顆粒飼料。晾干至含水分約10%，之后分別放入封口袋中存放入-20℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)管理 飼養(yǎng)試驗(yàn)在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)養(yǎng)殖基地營(yíng)養(yǎng)車間進(jìn)行，所用青蝦蝦購(gòu)自山東微山湖。試驗(yàn)蝦選用同一批進(jìn)口一代蝦苗。試驗(yàn)前，試驗(yàn)蝦苗暫養(yǎng)于桶中，并以蝦片和商業(yè)飼料飽食投喂。選擇1.0g左右的青蝦進(jìn)行分組試驗(yàn)。

表1 飼料配方組成及營(yíng)養(yǎng)成分分析(干物質(zhì)) (%)

每個(gè)試驗(yàn)組分三個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)30尾蝦，放養(yǎng)于0.7×0.9×1.0的網(wǎng)箱中，養(yǎng)殖試驗(yàn)持續(xù)8周，投喂4次/d，投喂時(shí)間分別為7:00、12:00、17:00以及21:00，按照體重的8%～10%進(jìn)行投喂，早晚投喂量為總投喂量的60%，投喂1h后觀察其攝食情況，以調(diào)整其投餌量。前期每?jī)商鞊Q一次水，中后期每天換水。試驗(yàn)過(guò)程中不間斷充氣，試驗(yàn) 水 溫 為26～31℃、水 質(zhì)pH 為7.5-7.6、DO 為6.12～ 6.45mg/L；氨氮為0.14～0.25mg/L。

1.3 樣品采集和分析方法 試驗(yàn)結(jié)束時(shí)停食24h，稱重并記錄尾數(shù)。每組隨機(jī)取5～7尾蝦，保存于-20℃冰箱備用，另取10尾蝦，于圍心腔取血，置于1.5ml離心管中于4℃冰箱靜置過(guò)夜，3000 r/min離心15min，取上清液分裝于-80℃冰箱備用，并測(cè)定血淋巴中天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)、酚氧化酶(PO)和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)。取血后的蝦剝離肌肉，放于液氮罐中，保存于-80℃冰箱，以分析肌肉的常規(guī)營(yíng)養(yǎng)組成。（1）飼料常規(guī)分析：試驗(yàn)樣品的水分、粗蛋白、粗脂肪和灰分含量按照標(biāo)準(zhǔn)方法(AOAC,1984)測(cè)定。采用105℃下烘干至恒重并測(cè)定水分含量;采用凱氏定氮法測(cè)定粗蛋白質(zhì)含量；采用索氏提取法(以石油醚為提取液)測(cè)定粗脂肪含量;粗灰分含量采用550℃馬弗爐灼燒法。（2）酶活力的測(cè)定[4]：均采用南京建成生物技術(shù)有限公司試劑，用酶標(biāo)儀測(cè)定。選擇飼料3用于測(cè)定飼料的溶失率，稱取5g試驗(yàn)料置于盛有1000m1水的燒杯中，測(cè)其浸泡30、60和90min后的氨基酸組成。溶失率測(cè)定參照Lucia Elizabeth等的研究方法。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)采用“SPSS version 17.0"軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)結(jié)果以平均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示，對(duì)數(shù)據(jù)作單因素方差分析(ANOVA)，結(jié)果作Duncan's進(jìn)行多重比較，P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 飼料中不同浸泡時(shí)間對(duì)亮氨酸溶失率的變化 飼料中亮氨酸的溶失率見(jiàn)表2。再對(duì)亮氨酸含量為2.32%的試驗(yàn)飼料3分析中，得知亮氨酸在30、60、90min的溶失率分別為10.92%、13.65%及15.09%。飼料浸泡時(shí)間越長(zhǎng)飼料中亮氨酸溶失率越大，在飼喂中應(yīng)少量多次，以減小亮氨酸的溶失率。

表2 飼料不同浸泡時(shí)間的亮氨酸的溶失率 (%)

2.2 飼料亮氨酸水平對(duì)青蝦血清酶活性的影響 飼料中添加不同水平的亮氨酸對(duì)青蝦酶活力的影響見(jiàn)圖1。飼料中不同水平的亮氨酸對(duì)血清中天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)的活力無(wú)顯著影響，但對(duì)血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)，超氧化物歧化酶(SOD)和酚氧化酶(PO)的活力有顯著影響(P<0.05)。沒(méi)有額外添加亮氨酸的飼料組各種酶活力顯著低于其余各組。

圖1 飼料中添加不同水平的亮氨酸對(duì)青蝦ALT酶活力對(duì)比

圖2 飼料中添加不同水平的亮氨酸對(duì)青蝦AST酶活力對(duì)比

圖3 飼料中添加不同水平的亮氨酸對(duì)青蝦SOD酶活力對(duì)比

圖4 飼料中添加不同水平的亮氨酸對(duì)青蝦PO酶活力對(duì)比

3 討論

本試驗(yàn)中，在飼料中添加不同水平的亮氨酸，并測(cè)定血淋巴中天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)、酚氧化酶(PO)和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)。青蝦亮氨酸最適需要量低于凡納濱對(duì)蝦2.46%[5]，但是高于日本對(duì)蝦[6]、普通鯉魚(yú)[7]、尼羅羅非魚(yú)[8]等的亮氨酸需要量，不同魚(yú)蝦對(duì)亮氨酸需要有所不同。在本試驗(yàn)中，飼料中不同水平的亮氨酸對(duì)血清中丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)，超氧化物歧化酶(SOD)和酚氧化酶(PO)的活力有顯著影響(P<0.05)，另外沒(méi)有額外添加亮氨酸的飼料組各種酶活力顯著低于其余各組。綜上所述，飼料中亮氨酸的水平對(duì)青蝦非特異性免疫有顯著影響。

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[4]王建國(guó), 陸宏達(dá).酚氧化酶活力測(cè)定方法中關(guān)于測(cè)定時(shí)間的研究[J].上海海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2009(6): 765-770.

[5]王用黎.凡納濱對(duì)蝦幼蝦對(duì)蘇氨酸,亮氨酸,色氨酸和纈氨酸需要量的研究[D].湛江: 廣東海洋大學(xué), 2013, 16-22.

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