耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌氟喹諾酮類耐藥基因研究

蔣佩軍，許小敏，馮偉云，梁珊燕

耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌氟喹諾酮類耐藥基因研究

蔣佩軍，許小敏，馮偉云，梁珊燕

目的了解耐藥不動(dòng)桿菌氟喹諾酮類耐藥基因的存在狀況。方法GNS-448藥敏卡及K-B法測(cè)定抗菌藥物的敏感性，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測(cè)靶位DNA回旋酶編碼基因（gyrA）與拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ編碼基因（parC）之氟喹諾酮耐藥決定區(qū)突變分析，以及可移動(dòng)遺傳元件可介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因[qnrA、qnrB、qnrS、qepA、aac(6')-Ⅰb-cr]。結(jié)果20株不動(dòng)桿菌對(duì)12種常用抗菌藥物嚴(yán)重耐藥，對(duì)左氧氟沙星耐藥率85%，亞胺培南90%，美洛培南耐藥率達(dá)到95%。19株耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌均檢出gyrA基因氟喹諾酮耐藥決定區(qū)(QRDR)第83位密碼子TCA→TTA有義突變（氨基酸序列Ser→Leu）；20株不動(dòng)桿菌中，parC基因均檢出存在QRDR區(qū)第80位密碼子TCG→TTG有義突變（氨基酸序列Ser→Leu）；沒有檢出耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌可移動(dòng)遺傳元件可介導(dǎo)的氟喹諾酮類耐藥基因qnrA、qnrB、qnrS、qepA、aac(6')-Ⅰb-cr。結(jié)論鮑曼不動(dòng)桿菌氟喹諾酮類藥物的耐藥機(jī)制主要與gyrA和parC基因QRDR區(qū)突變相關(guān)。

不動(dòng)桿菌，耐藥；-內(nèi)酰胺酶基因；氟喹諾酮類；耐藥基因

據(jù)我國(guó)Mohnarin 2011年的監(jiān)測(cè)報(bào)告顯示，鮑曼不動(dòng)桿菌重癥監(jiān)護(hù)病房（ICU）分離率為21.9%，占ICU病房分離率首位。ICU病房鮑曼不動(dòng)桿菌分離株的-內(nèi)酰胺類藥物耐藥率高出同期銅綠假單胞菌分離株的1倍以上，氨基糖苷類耐藥率高出同期銅綠假單胞菌分離株的2～3 倍，氟喹諾酮類藥物耐藥率高出同期銅綠假單胞菌分離株的2倍以上[1]。為了解一組（20株）耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌氟喹諾酮類藥物耐藥機(jī)制，筆者對(duì)氟喹諾酮類藥物作用靶位DNA回旋酶編碼基因（gyrA）與拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ編碼基因（parC）之氟喹諾酮耐藥決定區(qū)（QRDR）突變分析，以及可移動(dòng)遺傳元件可介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因(qnrA、qnrB、qnrS、qepA、aac (6')-Ⅰb-cr)進(jìn)行檢測(cè)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 菌株收集20株耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌分離自2011年2—10月寧波市第二醫(yī)院和浙江省舟山市普陀區(qū)中醫(yī)院住院患者。

1.2 菌種鑒定及藥敏試驗(yàn)由于常規(guī)生化鑒定法無法區(qū)分鮑曼不動(dòng)桿菌/乙酸鈣不動(dòng)桿菌復(fù)合體，因此菌種鑒定為先用法國(guó)生物梅里埃公司全自動(dòng)微生物鑒定儀作初步篩查，繼而本研究參照文獻(xiàn)[2]，采用gyrA測(cè)序并經(jīng)BLASTn比對(duì)進(jìn)一步確認(rèn)為鮑曼不動(dòng)桿菌。gyrA測(cè)序試劑盒由無錫市克隆遺傳技術(shù)研究所提供。藥敏試驗(yàn)為K-B法，抗菌藥物敏感性判斷根據(jù)2011年CLSI進(jìn)行。

1.3 細(xì)菌基因檢測(cè)模板制備挑取經(jīng)純培養(yǎng)的單個(gè)菌落，置入0.5m leppendorf離心管（內(nèi)有新鮮配制濃度為200 g/L的蛋白酶K溶液400 l），放置56℃水浴2h(消化細(xì)菌細(xì)胞膜裸露DNA)，然后改放置95℃水浴10 m in(滅活蛋白酶K)。放置－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 基因檢測(cè)gyrA、parC基因以及可移動(dòng)遺傳元件可介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因[qnrA、qnrB、qnrS、qepA、aac(6')-Ⅰbcr]檢測(cè)均為PCR法，氟喹諾酮類藥物作用靶位基因gyrA與parC經(jīng)PCR擴(kuò)增后另作DNA測(cè)序。產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，出現(xiàn)與陽性對(duì)照分子相當(dāng)?shù)哪康臈l帶為陽性。PCR參數(shù)、靶基因PCR引物序列和基因檢測(cè)試劑盒由無錫市克隆遺傳技術(shù)研究所提供。靶基因引物序列和目的產(chǎn)物長(zhǎng)度見表1。

1.5 gyrA、parC基因測(cè)序PCR產(chǎn)物測(cè)序在美國(guó)ABI公司3730型毛細(xì)管全自動(dòng)測(cè)序儀上進(jìn)行)，委托鉑尚(上海)生物技術(shù)有限公司完成。

1.6 gyrA、parC基因測(cè)得序列比對(duì)讀序工具軟件為Chromas，測(cè)序結(jié)果用Chromas直接作BLASTSearch比對(duì)。

2 結(jié)果

2.1 藥敏檢測(cè)結(jié)果20株耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)頭孢唑啉、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢西丁的耐藥率均85%以上；亞胺培南和美洛培南耐藥率分別為90%和95%；哌拉西林/他唑巴坦耐藥率84.2%；左氧氟沙星耐藥率85%；對(duì)慶大霉素和阿米卡星30%和10%；氨芐西林/舒巴坦耐藥率21.1%。

2.2 基因檢測(cè)狀況20株耐藥鮑曼不

動(dòng)桿菌均檢出gyrA基因氟喹諾酮耐藥決定區(qū)(QRDR)第83位密碼子TCA→TTA有義突變(氨基酸序列Ser→Leu)，parC基因均檢出存在QRDR區(qū)第80位密碼子TCG→TTG有義突變(氨基酸序列Ser→Leu)，未檢測(cè)去移動(dòng)遺傳元件可介導(dǎo)的氟喹諾酮類耐藥基因qnrA、qnrB、qnrS、qepA、aac(6')Ⅰb-cr。

3 討論

喹諾酮類藥物是一族結(jié)構(gòu)類似于萘啶酸的人工合成抗菌化合物，均有一個(gè)喹酮環(huán)，并含氟原子，故亦稱氟喹諾酮類藥物。氟喹諾酮類藥物作用強(qiáng)于萘啶酸。研究表明，氟喹諾酮類藥物會(huì)破壞細(xì)菌的DNA回旋酶與拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ傕化的DNA雙鏈被切斷的斷端重新拼接反應(yīng)，造成切斷的DNA雙鏈堆積，細(xì)菌DNA復(fù)制無法完成而死亡[3]。氟喹諾酮類藥物曾是治療鮑曼不動(dòng)桿菌臨床感染的替代性藥物。但如今鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分離株對(duì)氟喹諾酮類藥物耐藥性也在不斷上升趨勢(shì)。

革蘭陰性細(xì)菌耐氟喹諾酮類藥物原因主要為DNA回旋酶或拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的編碼基因gyrA、parC突變所致。后來，國(guó)內(nèi)外學(xué)者相繼報(bào)道了腸桿菌科細(xì)菌的可移動(dòng)遺傳元件可介導(dǎo)的氟喹諾酮類耐藥基因(qnrA、qnrB、qnrS、qepA、aac (6')-Ⅰb-cr)。本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)，19株耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌均檢出gyrA基因QRDR區(qū)第83位密碼子TCA→TTA有義突變(氨基酸序列Ser→Leu)。parC基因均檢出存在QRDR區(qū)第80位密碼子TCG→TTG有義突變(氨基酸序列Ser→Leu)。與本組菌株氟喹諾酮類藥物均不敏感的表型一致。而可移動(dòng)遺傳元件可介導(dǎo)的氟喹諾酮類耐藥基因qnrA、qnrB、qnrS、qepA、aac(6')-Ⅰb-cr均沒有檢出。這一結(jié)果文獻(xiàn)[4]報(bào)道相同。即鮑曼不動(dòng)桿菌氟喹諾酮類藥物的耐藥機(jī)制主要與gyrA和parC基因QRDR區(qū)突變相關(guān)，喹諾酮類藥物與之結(jié)合位置發(fā)生了改變，所形成氫鍵的數(shù)量也減少[5]，導(dǎo)致突變后的基因表達(dá)產(chǎn)物(變異的DNA回旋酶或拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ)逃逸了氟喹諾酮類藥物的攻擊。

表1 基因檢測(cè)PCR引物識(shí)別序列和目的產(chǎn)物長(zhǎng)度

[1]沈萍,魏澤慶,陳云波,等.Mohnarin2011年度報(bào)告:ICU細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2012,22(24):5472-5476.

[2]褚少朋,汪桂華,景蓉蓉,等.一組泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌中發(fā)現(xiàn)拓普異構(gòu)酶Ⅳ編碼基因新的變異型[J].中華微生物和免疫學(xué)雜志,2012,32(2):157-160.

[3]克里斯托弗·沃爾什.抗生素[M].北京,中國(guó)輕工業(yè)出版社,2009:60-61.

[4]耿先龍,王春新,許亞豐,等.泛耐藥鮑氏不動(dòng)桿菌中發(fā)現(xiàn)拓普異構(gòu)酶Ⅳ編碼基因新的變異型[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2012,35 (11):1048-1050.

[5]Vashist J,Vishvanath,Kapoor R,etal.Interactionofnalidixicacid and ciprofloxacin with type and m utated quinolone-resistance-determ ining region of DNA gyrase A[J].Indian JBiochem Biophys,2009,46 (2):147-153.

10.3969/j.issn.1671-0800.2014.06.064

R446.5

A

1671-0800(2014)06-0756-02

316000 浙江省舟山，舟山市普陀區(qū)中醫(yī)院（蔣佩軍）；寧波市第二醫(yī)院（許小敏、馮偉云、梁珊燕）

蔣佩軍，Email:hhllis@163. com