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    耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌氟喹諾酮類耐藥基因研究

    2014-03-18 02:45:12蔣佩軍許小敏馮偉云梁珊燕
    關(guān)鍵詞:異構(gòu)酶密碼子鮑曼

    蔣佩軍,許小敏,馮偉云,梁珊燕

    耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌氟喹諾酮類耐藥基因研究

    蔣佩軍,許小敏,馮偉云,梁珊燕

    目的了解耐藥不動(dòng)桿菌氟喹諾酮類耐藥基因的存在狀況。方法GNS-448藥敏卡及K-B法測(cè)定抗菌藥物的敏感性,聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測(cè)靶位DNA回旋酶編碼基因(gyrA)與拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ編碼基因(parC)之氟喹諾酮耐藥決定區(qū)突變分析,以及可移動(dòng)遺傳元件可介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因[qnrA、qnrB、qnrS、qepA、aac(6')-Ⅰb-cr]。結(jié)果20株不動(dòng)桿菌對(duì)12種常用抗菌藥物嚴(yán)重耐藥,對(duì)左氧氟沙星耐藥率85%,亞胺培南90%,美洛培南耐藥率達(dá)到95%。19株耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌均檢出gyrA基因氟喹諾酮耐藥決定區(qū)(QRDR)第83位密碼子TCA→TTA有義突變(氨基酸序列Ser→Leu);20株不動(dòng)桿菌中,parC基因均檢出存在QRDR區(qū)第80位密碼子TCG→TTG有義突變(氨基酸序列Ser→Leu);沒有檢出耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌可移動(dòng)遺傳元件可介導(dǎo)的氟喹諾酮類耐藥基因qnrA、qnrB、qnrS、qepA、aac(6')-Ⅰb-cr。結(jié)論鮑曼不動(dòng)桿菌氟喹諾酮類藥物的耐藥機(jī)制主要與gyrA和parC基因QRDR區(qū)突變相關(guān)。

    不動(dòng)桿菌,耐藥;-內(nèi)酰胺酶基因;氟喹諾酮類;耐藥基因

    據(jù)我國(guó)Mohnarin 2011年的監(jiān)測(cè)報(bào)告顯示,鮑曼不動(dòng)桿菌重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)分離率為21.9%,占ICU病房分離率首位。ICU病房鮑曼不動(dòng)桿菌分離株的-內(nèi)酰胺類藥物耐藥率高出同期銅綠假單胞菌分離株的1倍以上,氨基糖苷類耐藥率高出同期銅綠假單胞菌分離株的2~3 倍,氟喹諾酮類藥物耐藥率高出同期銅綠假單胞菌分離株的2倍以上[1]。為了解一組(20株)耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌氟喹諾酮類藥物耐藥機(jī)制,筆者對(duì)氟喹諾酮類藥物作用靶位DNA回旋酶編碼基因(gyrA)與拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ編碼基因(parC)之氟喹諾酮耐藥決定區(qū)(QRDR)突變分析,以及可移動(dòng)遺傳元件可介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因(qnrA、qnrB、qnrS、qepA、aac (6')-Ⅰb-cr)進(jìn)行檢測(cè),現(xiàn)報(bào)道如下。

    1 資料與方法

    1.1 菌株收集20株耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌分離自2011年2—10月寧波市第二醫(yī)院和浙江省舟山市普陀區(qū)中醫(yī)院住院患者。

    1.2 菌種鑒定及藥敏試驗(yàn)由于常規(guī)生化鑒定法無法區(qū)分鮑曼不動(dòng)桿菌/乙酸鈣不動(dòng)桿菌復(fù)合體,因此菌種鑒定為先用法國(guó)生物梅里埃公司全自動(dòng)微生物鑒定儀作初步篩查,繼而本研究參照文獻(xiàn)[2],采用gyrA測(cè)序并經(jīng)BLASTn比對(duì)進(jìn)一步確認(rèn)為鮑曼不動(dòng)桿菌。gyrA測(cè)序試劑盒由無錫市克隆遺傳技術(shù)研究所提供。藥敏試驗(yàn)為K-B法,抗菌藥物敏感性判斷根據(jù)2011年CLSI進(jìn)行。

    1.3 細(xì)菌基因檢測(cè)模板制備挑取經(jīng)純培養(yǎng)的單個(gè)菌落,置入0.5m leppendorf離心管(內(nèi)有新鮮配制濃度為200 g/L的蛋白酶K溶液400 l),放置56℃水浴2h(消化細(xì)菌細(xì)胞膜裸露DNA),然后改放置95℃水浴10 m in(滅活蛋白酶K)。放置-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.4 基因檢測(cè)gyrA、parC基因以及可移動(dòng)遺傳元件可介導(dǎo)的喹諾酮類耐藥基因[qnrA、qnrB、qnrS、qepA、aac(6')-Ⅰbcr]檢測(cè)均為PCR法,氟喹諾酮類藥物作用靶位基因gyrA與parC經(jīng)PCR擴(kuò)增后另作DNA測(cè)序。產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳,出現(xiàn)與陽性對(duì)照分子相當(dāng)?shù)哪康臈l帶為陽性。PCR參數(shù)、靶基因PCR引物序列和基因檢測(cè)試劑盒由無錫市克隆遺傳技術(shù)研究所提供。靶基因引物序列和目的產(chǎn)物長(zhǎng)度見表1。

    1.5 gyrA、parC基因測(cè)序PCR產(chǎn)物測(cè)序在美國(guó)ABI公司3730型毛細(xì)管全自動(dòng)測(cè)序儀上進(jìn)行),委托鉑尚(上海)生物技術(shù)有限公司完成。

    1.6 gyrA、parC基因測(cè)得序列比對(duì)讀序工具軟件為Chromas,測(cè)序結(jié)果用Chromas直接作BLASTSearch比對(duì)。

    2 結(jié)果

    2.1 藥敏檢測(cè)結(jié)果20株耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)頭孢唑啉、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢西丁的耐藥率均85%以上;亞胺培南和美洛培南耐藥率分別為90%和95%;哌拉西林/他唑巴坦耐藥率84.2%;左氧氟沙星耐藥率85%;對(duì)慶大霉素和阿米卡星30%和10%;氨芐西林/舒巴坦耐藥率21.1%。

    2.2 基因檢測(cè)狀況20株耐藥鮑曼不

    動(dòng)桿菌均檢出gyrA基因氟喹諾酮耐藥決定區(qū)(QRDR)第83位密碼子TCA→TTA有義突變(氨基酸序列Ser→Leu),parC基因均檢出存在QRDR區(qū)第80位密碼子TCG→TTG有義突變(氨基酸序列Ser→Leu),未檢測(cè)去移動(dòng)遺傳元件可介導(dǎo)的氟喹諾酮類耐藥基因qnrA、qnrB、qnrS、qepA、aac(6')Ⅰb-cr。

    3 討論

    喹諾酮類藥物是一族結(jié)構(gòu)類似于萘啶酸的人工合成抗菌化合物,均有一個(gè)喹酮環(huán),并含氟原子,故亦稱氟喹諾酮類藥物。氟喹諾酮類藥物作用強(qiáng)于萘啶酸。研究表明,氟喹諾酮類藥物會(huì)破壞細(xì)菌的DNA回旋酶與拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ傕化的DNA雙鏈被切斷的斷端重新拼接反應(yīng),造成切斷的DNA雙鏈堆積,細(xì)菌DNA復(fù)制無法完成而死亡[3]。氟喹諾酮類藥物曾是治療鮑曼不動(dòng)桿菌臨床感染的替代性藥物。但如今鮑曼不動(dòng)桿菌臨床分離株對(duì)氟喹諾酮類藥物耐藥性也在不斷上升趨勢(shì)。

    革蘭陰性細(xì)菌耐氟喹諾酮類藥物原因主要為DNA回旋酶或拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ的編碼基因gyrA、parC突變所致。后來,國(guó)內(nèi)外學(xué)者相繼報(bào)道了腸桿菌科細(xì)菌的可移動(dòng)遺傳元件可介導(dǎo)的氟喹諾酮類耐藥基因(qnrA、qnrB、qnrS、qepA、aac (6')-Ⅰb-cr)。本文結(jié)果發(fā)現(xiàn),19株耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌均檢出gyrA基因QRDR區(qū)第83位密碼子TCA→TTA有義突變(氨基酸序列Ser→Leu)。parC基因均檢出存在QRDR區(qū)第80位密碼子TCG→TTG有義突變(氨基酸序列Ser→Leu)。與本組菌株氟喹諾酮類藥物均不敏感的表型一致。而可移動(dòng)遺傳元件可介導(dǎo)的氟喹諾酮類耐藥基因qnrA、qnrB、qnrS、qepA、aac(6')-Ⅰb-cr均沒有檢出。這一結(jié)果文獻(xiàn)[4]報(bào)道相同。即鮑曼不動(dòng)桿菌氟喹諾酮類藥物的耐藥機(jī)制主要與gyrA和parC基因QRDR區(qū)突變相關(guān),喹諾酮類藥物與之結(jié)合位置發(fā)生了改變,所形成氫鍵的數(shù)量也減少[5],導(dǎo)致突變后的基因表達(dá)產(chǎn)物(變異的DNA回旋酶或拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ)逃逸了氟喹諾酮類藥物的攻擊。

    表1 基因檢測(cè)PCR引物識(shí)別序列和目的產(chǎn)物長(zhǎng)度

    [1]沈萍,魏澤慶,陳云波,等.Mohnarin2011年度報(bào)告:ICU細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2012,22(24):5472-5476.

    [2]褚少朋,汪桂華,景蓉蓉,等.一組泛耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌中發(fā)現(xiàn)拓普異構(gòu)酶Ⅳ編碼基因新的變異型[J].中華微生物和免疫學(xué)雜志,2012,32(2):157-160.

    [3]克里斯托弗·沃爾什.抗生素[M].北京,中國(guó)輕工業(yè)出版社,2009:60-61.

    [4]耿先龍,王春新,許亞豐,等.泛耐藥鮑氏不動(dòng)桿菌中發(fā)現(xiàn)拓普異構(gòu)酶Ⅳ編碼基因新的變異型[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2012,35 (11):1048-1050.

    [5]Vashist J,Vishvanath,Kapoor R,etal.Interactionofnalidixicacid and ciprofloxacin with type and m utated quinolone-resistance-determ ining region of DNA gyrase A[J].Indian JBiochem Biophys,2009,46 (2):147-153.

    10.3969/j.issn.1671-0800.2014.06.064

    R446.5

    A

    1671-0800(2014)06-0756-02

    316000 浙江省舟山,舟山市普陀區(qū)中醫(yī)院(蔣佩軍);寧波市第二醫(yī)院(許小敏、馮偉云、梁珊燕)

    蔣佩軍,Email:hhllis@163. com

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