吡格列酮對大鼠顱腦損傷后核轉錄因子、腫瘤壞死因子-α和細胞凋亡的影響

陳慧慧，王永青，彭余江，邵波，朱良才，段紅宇，何璽君，李慧勇，楊鵬翔，楊帆

吡格列酮對大鼠顱腦損傷后核轉錄因子、腫瘤壞死因子-α和細胞凋亡的影響

陳慧慧，王永青，彭余江，邵波，朱良才，段紅宇，何璽君，李慧勇，楊鵬翔，楊帆

目的探討吡格列酮（PGZ）干預對大鼠顱腦損傷后腦組織中核轉錄因子NF-B、腫瘤壞死因子-（TNF-）和細胞凋亡的變化及其可能機制。方法84只健康雄性SD大鼠隨機分為PGZ組（=42）及對照組（=42），前者通過改良Feeney法建立顱腦損傷模型后立即予以腹腔注射PGZ 10mg/kg，對照組則建立模型后予腹腔靜脈注射0.9%氯化鈉注射液2m l/kg，以后各組分別每24小時腹腔注射一次等量PGZ或0.9%氯化鈉注射液，直至動物被處死，根據(jù)傷后處死時間隨機分為1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、3 d和7 d共7個亞組，每亞組各6只。取損傷灶周圍組織采用免疫組織化學方法檢測并比較挫傷灶周圍腦組織中NF-B及TNF-蛋白表達情況，同時采用TUNEL法觀察并比較腦挫傷灶周圍細胞凋亡情況。結果PGZ組NF-B及TNF-蛋白表達水平較對照組均明顯下降（均Ρ＜0.05）。以NF-B含量水平為自變量，TNF-含量水平為應變量，回歸方程Y(PGZ組)＝－0.432+0.271X，2=0.947（Ρ＜0.01）；Y（對照組）＝－4.168+0.748X，2=0.961（Ρ＜0.01）。結論顱腦損傷后PGZ可能通過降低NF-B活性，控制炎癥反應，減少細胞凋亡，從而發(fā)揮對顱腦損傷后的神經(jīng)細胞發(fā)揮保護作用。

吡格列酮；顱腦損傷；核轉錄因子腫瘤壞死因子；細胞凋亡

吡格列酮（PGZ）是一種人工合成的胰島素增敏劑噻唑烷二酮類藥，臨床上廣泛應用于II型糖尿病的治療。目前有報道提示PGZ能通過激活PPARΥ，

從而增強神經(jīng)元的存活能力，促進神經(jīng)祖細胞的增殖、控制炎癥反應和抑制凋亡等，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后起一定的神經(jīng)保護作用[1]，但具體保護機制尚未完全闡明。本研究采用改良Feeney法制備顱腦損傷模型后予以PGZ干預后觀察核轉錄因子NF-ΚB表達的變化，以及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）表達及細胞凋亡的變化，探討顱腦損傷后PGZ對繼發(fā)性腦損傷的影響及可能機制，為進一步的臨床應用提供理論依據(jù)。報道如下。

1 資料與方法

1.1 動物分組清潔級SD雄性大鼠84只（浙江大學醫(yī)學院動物實驗中心提供），體質量250～280 g。術前12 h禁食，不禁水，隨機數(shù)字法將84只大鼠分為PGZ組(n=42)及對照組(n=42)，上述兩組再根據(jù)傷后處死時間分為1 h、3h、6 h、12h、24 h、3 d和7 d共7個亞組，每亞組各6只。

1.2 試劑PGZ及10%二甲基亞砜(DMSO)(Sigma公司，美國)；NF-ΚB-p65及TNF-α免疫組化試劑盒(R&D Systems公司，美國)；原位末端標記(TUNEL)試劑盒(Promega公司，美國)；電子顯微鏡(OLYMPUS，日本)等。

1.3 動物模型制備及處置采用改良的霍永強等[2]自由落體腦創(chuàng)傷模型制作閉合性顱腦損傷模型。模型成功標志[3]：存在不同程度的瞳孔改變、肢體抽搐及意識障礙，傷后各項反射消失并在30m in內恢復。待大鼠自然蘇醒后PGZ組立即予以腹腔注射PGZ 10 mg/kg，對照組則經(jīng)腹腔注射0.9%氯化鈉注射液2m l/kg，以后各組分別每24小時腹腔注射一次等量PGZ或0.9%氯化鈉注射液，直至動物被處死。

1.4 指標檢測

1.4.1 腦組織中NF-ΚB-p65及TNF-α的表達將大鼠麻醉，以0.9%氯化鈉注射液進行心臟灌洗，用4℃10%多聚甲醛灌洗固定，并迅速斷頭取腦。選取的距腦挫傷灶邊緣約5mm處腦皮質作為損傷腦組織，制成蠟塊。自前往后連續(xù)冠狀位切片，厚約5μm。每個標本取2張切片，嚴格按相關試劑盒檢測要求進行操作，在顯微鏡（×400）下隨機取損傷灶周圍5個不重復視野觀察，計數(shù)陽性細胞數(shù)，并求其平均值。

1.4.2 TUNEL染色嚴格按照試劑盒檢測步驟進行操作。TUNEL染色在光鏡下（×400）觀察凋亡細胞（以胞核出現(xiàn)棕黃染色顆粒代表），計算TUNEL陽性率，即TUNEL陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的比值并采圖。1.5統(tǒng)計方法應用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料采用均數(shù)±標準差表示，兩組間均數(shù)比較采用獨立樣本檢驗。回歸分析采用一元線性回歸分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 損傷灶周圍腦組織中NF-KB蛋白表達的變化情況PGZ組1h時NF-KB在損傷灶周圍組織細胞核中開始表達，1～12h陽性細胞比例逐漸增高，24 h時陽性細胞比率達到高峰，3～7 d陽性細胞比率有所下降，但處于高表達狀態(tài)；與對照組比較，PGZ組各時間點均低于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（≥3.47 ，均P＜0.05）。見表1及封三彩圖1。

2.2 顱腦損傷后損傷灶周圍腦組織中TNF-α蛋白表達的變化情況PGZ組在損傷后1h損傷灶周圍組織中TNF-α開始表達，3 h大量表達；6～24 h處于高度表達狀態(tài)，損傷后3 d TNF-α呈強表達，至7 d

TNF-α表達下降。與對照組比較，PGZ組各時間點陽性細胞率較低（≥4.27，均Ρ＜0.05）。見表1及封三彩圖2。

2.3 損傷灶周圍腦組織中細胞凋亡變化情況TUNEL染色后細胞核呈棕褐色提示為凋亡細胞，PGZ組1 h損傷灶周圍開始出現(xiàn)凋亡細胞，3～24h隨時間遞增，凋亡細胞數(shù)逐漸增多，3 d達到高峰，7 d凋亡細胞有所減少，與對照組變化規(guī)律一致，但各時間凋亡細胞數(shù)較對照組低，差異均有統(tǒng)計學意義（≥4.30，均＜0.05）。見表1及封三彩圖3。

2.4 NF-ΚB含量水平與TNF-α蛋白表達的回歸方程

以NF-ΚB含量水平為自變量，用X表示。TNF-α含量水平為應變量，用Y表示?；貧w方程Y(PGZ組)＝－0.432+0.271X，Υ2=0.947（Ρ＜0.001）；Y（對照組）＝－4.168+0.748X，Υ2=0.961（Ρ＜0.001）。

3 討論

目前顱腦損傷的發(fā)病率呈持續(xù)升高的趨勢[4]，如何阻止顱腦損傷后繼發(fā)性損傷的出現(xiàn)和發(fā)展，一直是眾多科研工作者和臨床醫(yī)師研究的熱點。國內外實驗研究證實，顱腦損傷灶和周圍組織存在炎性反應，是繼發(fā)性腦損傷的重要環(huán)節(jié)[5-7]，其中TNF-α被認為是腦損傷后最早出現(xiàn)的細胞因子，且是一種多效性促炎性細胞因子，可由小膠質細胞、星形細胞、神經(jīng)細胞和血管內皮細胞產(chǎn)生，在觸發(fā)炎性反應及神經(jīng)損傷過程中處于中心地位[8]。因此，如何降低炎癥因子的表達，從而減少神經(jīng)細胞的凋亡，保護受損細胞，是目前治療顱腦損傷后繼發(fā)性損傷的一大靶點。

表1 PGZ組與對照組TNF-陽性細胞率、NF-B蛋白表達及細胞凋亡情況比較%

有研究發(fā)現(xiàn)，PPARΥ激動劑能活化細胞外信號調節(jié)激酶而抑制NF-ΚB的激活[9]。PGZ作為PPARΥ特異性激動劑，目前在臨床主要用于治療II型糖尿病。國內有研究報道，PGZ促進PPARΥmRNA和蛋白的表達，增強其對損傷的神經(jīng)細胞具有保護作用，并且與劑量成正比[10]。本研究發(fā)現(xiàn)顱腦損傷后予以PGZ組干預后TNF-α水平較對照組明顯下降，提示PGZ組干預后可一定程度抑制TNF-α的表達，減輕炎癥反應。

此外，細胞凋亡是細胞在體內外多種因素刺激誘導下，由多種基因調控的主動死亡過程。有研究人員證實，顱腦損傷后細胞凋亡廣泛存在并參與了繼發(fā)性腦損傷的發(fā)展過程[11]。本實驗采用T'UNEL技術檢測了神經(jīng)細胞的凋亡情況，結果發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)經(jīng)PGZ預處理后的大鼠細胞凋亡較對照組明顯改善，NF-ΚB和TNF-α的含量水平顯著降低且二者含量水平成顯著正相關，顱腦損傷后損傷灶周圍腦組織中神經(jīng)細胞凋亡數(shù)量明顯減少（Ρ＜0.05）。由此筆者認為PGZ可通過降低誘發(fā)NF-kB的釋放能力，進而減少促炎介質的含量水平，從而發(fā)揮減少細胞凋亡的作用。

綜上所述，PGZ可通過激活PPARΥ負性調節(jié)腦組織中NF-ΚB的含量水平，進一步減少TNF-α的釋放，減輕了大鼠顱腦損傷后繼發(fā)性腦損傷，從而很好的減少細胞凋亡，為該藥在顱腦損傷的治療提供更為廣闊的前景。

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Influenceof pioglitazoneon tissuenuclear transcription factor,tumornecrosis factor-and cellapoptosisafter traumatic brain injury in rats

Objective To investigate the changes of tissue nuclear transcription factor (NF-KB), tumor necrosis factor-(TNF- ) and cell apoptosis after traumatic brain injury and the influence of pioglitazone on these para-meters in rats. MethodsEighty-four male SD rats were randomly divided into two groups randomly: pioglitazone group ( n=42) and the controlgroup ( n=42).The pioglitazone group were induced by improved Feeney method and were received abdominal injectionsof pioglitazone (10 mg/kg) immediately after injury, and the control group were received abdominal injections of sodiumchloride injection (2 ml/kg) immediately after injury and one time everyday until the rats was killed. Each group wasdivided into seven subgroups by sacrificed time after injury, 1 h, 3 h, 6 h, 12 h, 24 h, 3 d, and 7 d group, each subgroup gotsix rats. Each subgroup were randomly selected three rats after being killed, detected the expression of NF- B and TNF of tissues around contusion by immunohistochemical methods, while TUNEL method was used to observe the cell apoptosisafter brain contusion.Results The expressions of NF- B and TNF- in each pioglitazone group were significantly decreased compared with the control group ( P＜ 0.05), and they showed significant positive correlations in both groups ( P＜0.01). At the same time, the number of apoptotic cells was decreasing ( P＜ 0.05).Conclusions Pioglitazone can protect of neurocytes through the route of relieving inflammation response, reducing the change of secondary brain injury after traumaticbrain injury and decreasing neural cell apoptosis.

Pioglitazone;TraumaticBrain Injury;Nucleartranscription factor;Tumornecrosisfactor-;Cellapoptosis

10.3969/j.issn.1671-0800.2014.06.004

R741

A

1671-0800(2014)06-0656-03

浙江省溫嶺市科技局基金資助項目（2011W LCB0093）

317500 浙江省溫嶺，溫嶺市第一人民醫(yī)院

楊帆，Email：yangfan5091448@163.com