MSCs 上清可減輕雷公藤甲素對(duì)KGN 細(xì)胞的損傷作用①

周 雪 趙光鋒 陳士雯 侯亞義 (南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫與生殖生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，南京 210093)

雷公藤在治療免疫性疾病和炎性疾病的過(guò)程中可對(duì)生殖系統(tǒng)產(chǎn)生副作用，引起女性的月經(jīng)周期紊亂以及閉經(jīng)［1］，甚至可能對(duì)卵巢造成不可逆性損害［2，3］，激素療法雖能回復(fù)部分女性卵巢功能，但對(duì)某些病例不起作用［2］，且激素療法會(huì)增加血栓、卵巢癌和乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)［4，5］。有研究提示，雷公藤可造成卵泡顆粒細(xì)胞層變薄，影響卵泡發(fā)育［6-8］。雷公藤甲素是雷公藤的主要活性成分［9］，對(duì)女性卵巢顆粒細(xì)胞的損害及作用機(jī)制尚不詳，且無(wú)改善這種損害的策略。間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)具有免疫抑制和免疫調(diào)節(jié)功能［10］，目前已逐漸用于自身免疫性疾病、炎性疾病及組織修復(fù)治療的研究［11］。有研究報(bào)道，MSCs 能夠分泌多種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，改善卵巢蛋白及環(huán)磷酰胺等誘導(dǎo)的卵巢損傷［12-14］。但目前對(duì)于MSCs 的培養(yǎng)上清是否能改善雷公藤引起的卵巢顆粒細(xì)胞損傷尚未有研究。因此，本研究探討了MSCs 上清對(duì)雷公藤甲素?fù)p害人的卵巢顆粒細(xì)胞系KGN 的作用及其機(jī)制，試圖提出改善雷公藤甲素?fù)p害卵巢的策略。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 正常足月健康新生兒的新鮮臍帶取自于南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院婦產(chǎn)科，均經(jīng)產(chǎn)婦及家屬授權(quán)同意，嚴(yán)格遵守醫(yī)學(xué)倫理道德，并得到相關(guān)倫理部門批準(zhǔn)。人卵巢顆粒細(xì)胞系KGN 由南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院婦產(chǎn)科惠贈(zèng)。DMEM/F12 培養(yǎng)基、FBS 胎牛血清購(gòu)于Gibco 公司;流式抗體小鼠抗人CD29-PE、CD44-PE、CD90-PE、CD105-PE、CD31-PE、CD34-PE、CD45-FITC 以 及HLA-DR-PE 購(gòu)于eBioscience 公司;CCK-8 試劑購(gòu)于日本同仁化學(xué)所，PI 購(gòu)于Sigma 公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

1.2.1 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的分離培養(yǎng)及表型鑒定 無(wú)菌條件下取出臍帶，立即放入滅菌預(yù)冷PBS 保存。取回后4 h 內(nèi)按照本實(shí)驗(yàn)室方法進(jìn)行處理。首先，用含1%青鏈霉素混合液的PBS 洗去臍帶表面血塊，用眼科鑷子將臍動(dòng)脈和靜脈剝除，放入含DMEM/F12 的培養(yǎng)皿中，剪碎至8～10 mm3小塊。然后，離心去除培養(yǎng)基，加入預(yù)先配置好的含250 U/ml 膠原酶Ⅱ，100 U/ml 中性蛋白酶及10 U/ml 透明質(zhì)酸酶混合液，放入37℃搖床，振蕩消化2～3 h 至組織基本消化完全。經(jīng)PBS 洗3 遍、DMEM/F12 洗2 遍，去除混合酶液。將細(xì)胞及組織碎片倒入培養(yǎng)瓶，加入含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素混合液及DMEM/F12 的完全培養(yǎng)基，放入37℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)(5%CO2)，避免移動(dòng)。3 d 后，除去未貼壁細(xì)胞及組織碎片，更換完全培養(yǎng)液，以后每3 d 更換一次，待成纖維樣細(xì)胞集落密度達(dá)80%左右，用0.25%EDTA 胰酶消化傳代，取第4～8 代細(xì)胞進(jìn)行免疫表型鑒定。消化收集后，用PBS 洗兩遍，調(diào)整細(xì)胞密度為大約1×106ml-1，每管加入100 μl 細(xì)胞懸液，再按照建議濃度分別加入各自的流式抗體進(jìn)行標(biāo)記。避光孵育30 min，PBS 洗兩遍去除未標(biāo)記抗體;加入2%多聚甲醛，4℃避光固定30 min;應(yīng)用BD 公司FACSCalibur 流式細(xì)胞儀檢測(cè)免疫表型:CD29、CD44、CD90、CD105、CD31、CD34、CD45 以及HLA-DR，確認(rèn)為MSCs 后用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 KGN 細(xì)胞培養(yǎng) 與MSCs 用相同的完全培養(yǎng)基在37℃二氧化碳培養(yǎng)箱進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，保持5%的CO2以維持pH 恒定。

1.3 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活力

1.3.1 細(xì)胞毒性檢測(cè) CCK-8 試劑盒是基于WST-8 還原性的檢測(cè)試劑，WST-8 被細(xì)胞內(nèi)脫氫酶生物還原后生成橙色甲臜染料，培養(yǎng)基顏色與活細(xì)胞數(shù)量成正比。KGN 細(xì)胞以3×103個(gè)/孔，接種至96 孔板，置于37℃培養(yǎng)箱過(guò)夜預(yù)培養(yǎng)，第二天分別加入2.5、5、10、20、40 及80 nmol/L 的雷公藤甲素處理24 h 和48 h，按照CCK-8 說(shuō)明書加入試劑，孵育1～4 h，測(cè)定450 nm 處的吸光值。

1.3.2 細(xì)胞活力檢測(cè) KGN 分組:(1)Control 組;(2)MSCs 上清組;(3)雷公藤甲素組;(4)MSCs 上清+雷公藤甲素組。用胰酶常規(guī)消化KGN 細(xì)胞，同樣將KGN 細(xì)胞以3×103個(gè)/孔，接種至96 孔板過(guò)夜預(yù)培養(yǎng)。向(3)(4)組加入40 nmol/L 雷公藤甲素處理24 h，(1)(2)用等量DMSO 作為對(duì)照;再向(2)(4)組加入MSCs 上清，(1)(3)加入完全培養(yǎng)基，24 h 后檢測(cè)細(xì)胞活力。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 碘化丙啶PI(Propidium Iodide)是一種核酸熒光染料，能夠與DNA 和RNA 分子的堿基對(duì)進(jìn)行插入性結(jié)合。將處理后的KGN 加入無(wú)EDTA 胰酶消化，用PBS 洗兩遍，再加入預(yù)冷的70%乙醇固定，置于4℃過(guò)夜;離心去除乙醇，再加入PBS 洗兩遍，加入含0.1% Triton X-100及2%RNase 的PI 工作液(PI 終濃度為50 μg/ml)懸起細(xì)胞，室溫避光孵育30 min，上機(jī)檢測(cè)，用ModFit LT 軟件分析周期。

1.5 Real-Time PCR 法檢測(cè)mRNA 表達(dá) 利用Trizol 法提取KGN 的總RNA，經(jīng)氯仿抽提、分相及異丙醇沉淀后，用預(yù)冷的DEPC-75% 乙醇洗滌RNA，加入DEPC 水，在56℃條件下金屬浴熔解10 min，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度。定量0.5 μg 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)在TaKaRa 公司的PCR 儀中進(jìn)行，20 μl 的反轉(zhuǎn)錄體系為:5× RT buffer 4 μl、dNTP 2 μl、RNase inhibitor 1 μl、Oligo d(T)1 μl、ReverTra Ace 0.5 μl、RNA 0.5 μg，再加入DEPC 水補(bǔ)足20 μl;反應(yīng)在42℃20 min、99℃5 min 及4℃5 min，得到cDNA。隨后利用ABI 公司的StepOnePlus 熒光定量PCR 儀檢測(cè)mRNA 表達(dá)。引物序列為:βactin:Fp 5'-TCTGGCACCACACCTTCTA-3'，Rp 5'-AGGCATACAGGGACAGCAC-3';CDKN1A:Fp 5'-CTCATCCCGTGTTCTCCTTT-3'，Rp 5'-GTACCACCCAGCGGACAAGT-3'。10 μl 反應(yīng)體系為:SYBR Green Supermix 5 μl、Forward primer 0.5 μl、Reverse primer 0.5 μl、cDNA 2 μl(預(yù)先稀釋10 倍)以及ddH2O 2 μl，反應(yīng)條件:95℃10 min;95℃15 s、60℃30 s、72℃30 s 共40 循環(huán);95℃15 s、60℃30 s、95℃15 s 繪制溶解曲線，用2-ΔΔCT法計(jì)算得出CDKN1A 的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果均重復(fù)三次，數(shù)據(jù)用Graphpad Prism 5 軟件統(tǒng)計(jì)，計(jì)量數(shù)據(jù)以±s 表示。組間單因素采用One-way-ANOVA，雙因素采用Twoway-ANOVA，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雷公藤甲素抑制KGN 活力 將KGN 以3×103個(gè)/孔接種于96 孔板，過(guò)夜預(yù)培養(yǎng)后，分別用2.5、5、10、20、40 及80 nmol/L 的雷公藤甲素處理KGN 24 及48 h，CCK-8 檢測(cè)雷公藤甲素對(duì)KGN 的細(xì)胞毒作用，結(jié)果顯示，雷公藤甲素處理24 h 后，KGN 活力在40 nmol/L 以上受到抑制(圖1A)，光鏡下也可以看出這種抑制作用(圖2B，40 nmol/L);而處理48 h 后，雷公藤甲素對(duì)KGN 活力的抑制呈劑量依賴性(圖1A)。

2.2 MSCs 的培養(yǎng)及鑒定 取回的新鮮臍帶經(jīng)處理、培養(yǎng)，得到大量擴(kuò)增的成纖維樣細(xì)胞(圖2A)。傳代后其免疫表型的檢測(cè)結(jié)果如圖2B 所示，CD29、CD44、CD90 及CD105 分子的表達(dá)呈陽(yáng)性，CD31、CD34、CD45 及HLA-DR 的表達(dá)呈陰性，符合MSCs表面抗原的表達(dá)特征，經(jīng)鑒定后確認(rèn)為MSCs，其培養(yǎng)上清用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

2.3 MSCs 上清可提高雷公藤甲素處理的KGN 細(xì)胞活力 為了獲取MSCs 的培養(yǎng)上清，我們先進(jìn)行了MSC 預(yù)鋪板(按照MSC∶KGN=1∶5的比例)，過(guò)夜后更換完全培養(yǎng)基，24 h 后收集MSCs 上清。用CCK-8 法對(duì)KGN 的活力進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)MSCs 上清對(duì)正常KGN 活力沒有明顯影響，而對(duì)雷公藤甲素?fù)p傷的KGN 活力有顯著提升(圖3)。

2.4 MSCs 上清可緩解雷公藤甲素對(duì)KGN 的S期阻滯 我們用PI染色法對(duì)KGN的周期分布進(jìn)行了分析，分組同上，每組設(shè)置3 復(fù)孔。結(jié)果如圖4 所示，在雷公藤甲素的作用下，我們發(fā)現(xiàn)KGN 的細(xì)胞周期出現(xiàn)了明顯的S 期阻滯(Control 組:Dip G1:76.17%，Dip S:13.10%，Dip G2:10.73%;雷公藤甲素組:Dip G1:45.96 %，Dip S:47.11 %，Dip G2:6.927 %);而用MSCs 上清處理后，雷公藤甲素阻滯的KGN S 期細(xì)胞比例有所下降(MSCs 上清+雷公藤甲素組:Dip G1:54.35 %，Dip S:41.99 %，Dip G2:3.665 %)，說(shuō)明MSCs 培養(yǎng)上清能夠減輕雷公藤甲素引起的S 期阻滯程度。此外，單獨(dú)MSCs上清作用不影響KGN 細(xì)胞周期(Dip G1:77.96%，Dip S:13.87%，Dip G2:8.170%)。

圖1 雷公藤甲素對(duì)KGN 活力的影響Fig.1 Effect of triptolide on cell viability of KGN

圖2 MSCs 的形態(tài)學(xué)觀察及免疫表型鑒定Fig.2 Morphological observation and immunophenotype identification of MSCs

圖3 MSCs 上清對(duì)雷公藤甲素處理的KGN 活力的影響Fig.3 Effect of MSCs conditioned medium on cell vitality of triptolide treated KGN

圖4 MSCs 上清對(duì)雷公藤甲素處理的KGN 周期的影響Fig.4 Effect of MSCs conditioned medium on cell cycle distribution of triptolide treated KGN

2.5 MSCs 上清減輕雷公藤甲素引起的周期阻滯與CDKN1A 有關(guān) 我們采用Real-time PCR 法檢測(cè)了p21 編碼基因CDKN1A 的表達(dá)，見圖5。結(jié)果表明，雷公藤甲素處理使KGN 的CDKN1A 表達(dá)呈現(xiàn)顯著上調(diào)，說(shuō)明雷公藤甲素誘導(dǎo)的KGN S 期阻滯與CDKN1A 異常上調(diào)有關(guān);同時(shí)，在雷公藤甲素處理過(guò)損傷的KGN 組中，MSCs 上清的作用在一定程度上降低了CDKN1A 的表達(dá)，但無(wú)顯著性差異。這提示，MSCs 上清可能通過(guò)調(diào)控雷公藤甲素導(dǎo)致的CDKN1A 異常表達(dá)而減輕雷公藤甲素引起的KGN S期阻滯。

圖5 MSC 上清對(duì)雷公藤甲素處理的KGN 表達(dá)CDKN1A的影響Fig.5 Influence of MSCs conditioned medium on expression of CDKN1A in triptolide treated KGN

3 討論

卵巢顆粒細(xì)胞參與了卵泡的發(fā)生以及激素合成，已有不少研究表明雷公藤具有生殖毒性，且有研究指出這可能與對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞的損傷有關(guān)［6］，Chen 等［7］發(fā)現(xiàn)雷公藤能夠使卵泡顆粒細(xì)胞層減少，從而影響卵泡發(fā)育。此外，作為雷公藤的主要成分，雷公藤甲素對(duì)多種細(xì)胞都表現(xiàn)出抗增殖能力［9］，能下調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞的多種細(xì)胞因子受體及周期調(diào)控因子的表達(dá)，抑制VEGF 和COX-2 等分泌，從而調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細(xì)胞周期進(jìn)程、抑制其增殖及遷移［15］;Zhao等［16］研究表明雷公藤還能抑制卵巢癌細(xì)胞的侵襲，而且對(duì)其增殖的抑制具有劑量依賴性。這提示，作為雷公藤的主要成分，雷公藤甲素的毒性可能對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響。但是對(duì)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的研究表明，較低濃度的雷公藤甲素可以影響對(duì)雌二醇和孕酮的分泌，而對(duì)于其細(xì)胞活力沒有明顯影響［17，18］，這提示雷公藤甲素對(duì)人和鼠的卵巢顆粒細(xì)胞的影響可能存在濃度及種屬差別。我們用CCK-8 法檢測(cè)了雷公藤甲素對(duì)KGN 細(xì)胞活力的影響，發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素能夠劑量依賴性地抑制KGN 活力(圖1A)，影響其細(xì)胞數(shù)目的增多(圖1B)。雷公藤甲素不僅影響細(xì)胞活力，還能夠造成多種細(xì)胞系的周期阻滯，比如對(duì)乳腺癌細(xì)胞系MDA-231 細(xì)胞及膽囊癌細(xì)胞系GBC-SD 及SGC-996 的S 期細(xì)胞周期阻滯［19，20］，對(duì)子宮內(nèi)膜癌及卵巢癌細(xì)胞的S 期阻滯等［21］。我們對(duì)KGN 細(xì)胞周期進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素同樣能夠引起KGN 的S 期阻滯(圖4)。

為探討MSCs 上清對(duì)雷公藤甲素?fù)p傷的KGN活力是否有影響，我們分離培養(yǎng)了臍帶來(lái)源MSCs，并對(duì)其免疫表型進(jìn)行了檢測(cè)。MSCs 一般呈長(zhǎng)梭形，表達(dá)CD29、CD44、CD90、CD105 分子，不表達(dá)造血系分子表型CD34 及CD45，內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD31 及人MHCⅡ類分子HLA-DR［22］。我們用混合酶消化結(jié)合貼壁法獲得的MSCs 形態(tài)均一，純度在90%以上，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，其表面分子的表達(dá)符合MSCs 的普遍特征(圖2)。MSCs 能夠產(chǎn)生和分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)、血小板源生長(zhǎng)因子(PDGF)及基質(zhì)細(xì)胞衍生因子(SCF)等多種生長(zhǎng)因子，具有營(yíng)養(yǎng)與支持、免疫調(diào)節(jié)、抗凋亡抗體、促進(jìn)血管生成等屬性［23］，能支持細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)卵巢損傷等組織修復(fù)。此外，MSCs 上清還可保護(hù)化療藥物對(duì)細(xì)胞的殺傷［24］。我們的實(shí)驗(yàn)表明，雷公藤甲素?fù)p傷的KGN 在MSCs 上清作用下，其活力顯著高于損傷的對(duì)照(圖3)，進(jìn)一步的細(xì)胞周期分析更顯示，MSCs 上清能夠顯著降低其S 期阻滯的阻滯程度(圖4)。

CDKN1A 是細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)節(jié)因子p21 的編碼基因，p21 的過(guò)度表達(dá)提示細(xì)胞周期阻滯［25］。我們推測(cè)，雷公藤甲素引起的KGN 細(xì)胞S 期阻滯可能與CDKN1A 有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雷公藤甲素將KGN的CDKN1A 表達(dá)上調(diào)了約15 倍，此外，MSCs 上清的處理可以降低CDKN1A 的表達(dá)，雖沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但這也提示了CDKN1A 可能與MSCs 上清緩解雷公藤甲素引起的KGN S 期阻滯程度有關(guān)(圖4)。

總之，我們的研究發(fā)現(xiàn)雷公藤甲素能夠直接抑制KGN 的活力，造成KGN 的S 期阻滯，從而抑制KGN 的生長(zhǎng)，表現(xiàn)出對(duì)CDKN1A 的異常上調(diào);而MSCs 上清則提高了雷公藤甲素?fù)p傷的KGN 的活力，降低了其S 期阻滯程度，同時(shí)還輕微降低了其CDKN1A 的表達(dá)。提示MSCs 上清可能減輕雷公藤甲素對(duì)KGN 細(xì)胞的損傷作用，這可能和影響CDKN1A 的表達(dá)有關(guān)。

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