大伏革菌產(chǎn)纖維素酶條件優(yōu)化及高效菌株篩選

李杏春 何雙輝 戴玉成

（北京林業(yè)大學(xué)微生物研究所，北京 100083）

大伏革菌產(chǎn)纖維素酶條件優(yōu)化及高效菌株篩選

李杏春 何雙輝 戴玉成

（北京林業(yè)大學(xué)微生物研究所，北京 100083）

真菌胞外纖維素酶活可作為高效生防菌株篩選的指標(biāo)之一，通過測定野生大伏革菌（Phlebiopsis gigantea）菌株在最優(yōu)條件下所產(chǎn)生纖維素酶活力高低來達(dá)到篩選防治針葉樹根腐病高效菌株的目的。以大伏革菌菌株液體培養(yǎng)過程中纖維素酶活力為指標(biāo)，通過單因素和正交試驗結(jié)合的方法，篩選出大伏革菌最適產(chǎn)纖維素酶條件為（g/L）：葡萄糖30.00，蛋白胨5.00，磷酸二氫鉀3.00，硫酸鎂1.50，裝液量120 mL/250 mL，接種量5%（V/V），初始pH為4.0。測定野生大伏革菌菌株纖維素酶活力的大小顯示：08077號菌株纖維素酶活力最大，13025號菌株最小。研究得出08077號菌株比芬蘭商業(yè)化生物制劑Rotstop-F具有更好的防治中國小孔異擔(dān)子菌的潛能。

大伏革菌 液體培養(yǎng) 優(yōu)化 纖維素酶活力 正交試驗

大伏革菌（Phlebiopsis gigantea）隸屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、傘菌綱（Agaricomycetes）、多孔菌目（Polyporales）、原毛平革菌科（Phanerochaetaceae），是防治針葉樹干基腐朽病的重要菌株。針葉樹干基腐朽病是北半球溫帶針葉林最為嚴(yán)重的病害之一，也是經(jīng)營林分最嚴(yán)重的森林病害［1］，該病害在我國東北、西北和西南地區(qū)的針葉林區(qū)內(nèi)也比較普遍［2-5］。如今，利用大伏革菌防治針葉樹干基腐朽病已成為防治該病害的主要手段［2，6］。

纖維素酶是一組能夠降解纖維素生成葡萄糖的酶的總稱。它是一種多組分酶，現(xiàn)已確定的纖維素酶主要組分有內(nèi)切型葡聚糖苷酶（也稱Cx酶、CMC酶）、外切型葡萄糖苷酶（也稱纖維二糖水解酶或微晶纖維素酶）和纖維二糖酶（也稱β-葡萄糖苷酶，簡稱BG）。纖維素酶的來源很廣泛，昆蟲、軟體動物、原生動物、細(xì)菌、真菌、放線菌等都可以產(chǎn)生纖維素酶［7-9］。

近年來，纖維素酶廣泛應(yīng)用于食品發(fā)酵、飼料、

釀造行業(yè)、農(nóng)副產(chǎn)品深加工、紡織、醫(yī)藥、化工、環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域［10，11］，同時，在病原菌的生物防治中，纖維素酶也發(fā)揮了巨大的作用，它能夠降解樹木細(xì)胞壁纖維素結(jié)構(gòu)，利用降解產(chǎn)物葡萄糖來滿足自身對于營養(yǎng)物質(zhì)的需要，同時達(dá)到在植物組織中快速定殖的目的。Anna等［12，13］認(rèn)為，防治樹木根部病害的生物防治菌株必須能夠降解新鮮樹樁及其根部組織，故真菌胞外纖維素酶活可作為高效生防菌株篩選的指標(biāo)之一。過去，對大伏革菌的篩選研究多數(shù)利用室內(nèi)平板拮抗及室外木樁防治結(jié)合的方法，很少把酶活力做為篩選指標(biāo)，本研究針對已選定大伏革菌（Phlebiopsis gigantea）菌株，首先優(yōu)化其產(chǎn)纖維素酶的條件，其次通過測定野生菌株在最優(yōu)培養(yǎng)基中所產(chǎn)生纖維素酶活力的大小以達(dá)到篩選高效菌株的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 芬蘭野生大伏革菌菌株04052、08076、08077（引進(jìn)于芬蘭林業(yè)研究所，經(jīng)由平板拮抗試驗從14株芬蘭野生大伏革菌中初步篩選出拮抗中國小孔異擔(dān)子菌效果較好的菌株），中國野生大伏革菌菌株13009、13025，Rotstop生物制劑（Rotstop-F，引進(jìn)于芬蘭Verdera公司）。

1.1.2 培養(yǎng)基 菌種活化固體培養(yǎng)基（g/L）：麥芽浸粉20.00，KH2PO43.00，瓊脂20.00，pH自然；液體種子培養(yǎng)基（g/L）：麥芽浸粉20.00，酵母浸粉5.00，KH2PO41.00，MgSO4·7H2O 0.50，維生素B1 0.01，pH自然；碳源篩選培養(yǎng)基（g/L）：碳源20.00，酵母浸粉5.00，KH2PO41.00，MgSO4·7H2O 0.50，CaCl20.50，維生素B1 0.01，pH自然；氮源篩選培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20.00，氮源5.00，KH2PO41.00，MgSO4·7H2O 0.50，CaCl20.50，維生素B1 0.01，pH自然。

1.2 方法

1.2.1 液體種子制備 將大伏革菌菌株在固體培養(yǎng)基上活化，用打孔器取長勢一致、直徑6 mm的菌餅5塊接種至液體種子培養(yǎng)基中（100 mL/250 mL），28℃，150 r/min培養(yǎng)7 d，得到一級發(fā)酵種子，勻漿后按10%（V/V）接種量接至液體種子培養(yǎng)基中（100 mL/250 mL），28℃，150 r/min培養(yǎng)3 d 得二級發(fā)酵種子，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 培養(yǎng)基組成優(yōu)化 本試驗考慮到影響大伏革菌生長的4個條件——碳源、氮源、KH2PO4、MgSO4·7H2O，首先設(shè)計單因素試驗，篩選最適碳、氮源；其次，設(shè)計4因素、3水平正交試驗L9（34），用以優(yōu)化培養(yǎng)基成分最適比例，確定最佳培養(yǎng)條件（正交試驗的因素水平設(shè)計見表1）。

表1 正交試驗因素水平表

1.2.3 液體培養(yǎng)方法 將二級液體發(fā)酵種子按10%（V/V）接種量接種至篩選用培養(yǎng)基中，28℃，150 r/min培養(yǎng)7 d，每個處理重復(fù)3次。

1.2.4 粗酶液制備 取培養(yǎng)7 d的發(fā)酵液，24℃，12 000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 DNS試劑（3，5-二硝基水楊酸）制備 見參考文獻(xiàn)［14］。

1.2.6 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 分別取7支具塞試管，其中一支加入2.0 mL蒸餾水做空白，另外6支分別加入不同體積（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和1.2 mL）的濃度為1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，補充水到2.0 mL。然后每支試管加入1.5 mL DNS試劑，將各試管搖勻，在沸水浴中準(zhǔn)確煮沸5 min，取出，冰浴冷卻至室溫，用蒸餾水定容至25 mL，加塞后顛倒混勻，在紫外-可見分光光度計540 nm處測定吸光值，用空白調(diào)零點。以A540吸光值為縱坐標(biāo)，葡萄糖含量（mg）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.7 纖維素酶活力測定 本試驗采用羧甲基纖維素鈉鹽（CMC-Na）酶活性測定方法，取0.1 mL粗酶液，加入1.9 mL羧甲基纖維素鈉溶液，混勻，置于40℃水浴鍋中保溫30 min后，立即加入1.5 mL DNS試劑，沸水浴5 min，取出冷卻至室溫，用蒸餾水稀釋至25 mL，顛倒混勻后，于540 nm處測定吸光值，以0.1 mL 煮沸的粗酶液加1.9 mL底物羧甲基纖維素鈉溶液做對照，每個處理重復(fù)3次，求平均值。按

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算CMC-Na被羧甲基纖維素酶分解的葡萄糖含量，1個酶活單位定義為每分鐘生成1 μmol 葡萄糖所需要的酶量。

1.2.8 高效大伏革菌菌株篩選 將芬蘭和中國野生大伏革菌菌株的二級液體發(fā)酵種子按10%（V/V）的接種量接種至優(yōu)化后的產(chǎn)纖維素酶培養(yǎng)基中，28℃，150 r/min培養(yǎng)7 d，取發(fā)酵液，離心后測定纖維素酶活力，每個處理重復(fù)3次。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理 采用SPSS17.0對單因素和正交試驗的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，檢驗數(shù)據(jù)間的差異性，P＜0.05 時為差異顯著，用EXCEL作圖。

2 結(jié)果

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

根據(jù)1.2.6方法測定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，運用SPSS17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，對應(yīng)的回歸方程為：y=0.581 1x+0.014 9，R2=0.998 8。此標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系很好，可用于纖維素酶活力的測定。

2.2 碳源篩選結(jié)果與分析

本試驗分別以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、復(fù)合碳源1（麥芽糖∶甘露醇=2∶1）和復(fù)合碳源2（葡萄糖∶甘露醇=2∶1）為篩選碳源，羧甲基纖維素酶活力為指標(biāo)進(jìn)行試驗。結(jié)果（圖1）顯示，當(dāng)碳源為葡萄糖時，大伏革菌的纖維素酶活力達(dá)到最大（1 749.71 U/L），復(fù)合碳源2次之，而以蔗糖為碳源時，大伏革菌的纖維素酶活力最低（316.72 U/L）。方差分析結(jié)果（表2）顯示，所用碳源不同，不同處理間大伏革菌纖維素酶活力差異極顯著。因此，選擇葡萄糖作為大伏革菌產(chǎn)纖維素酶的最適碳源。

圖1 碳源對纖維素酶活力的影響

表2 碳源方差分析表

2.3 氮源篩選結(jié)果與分析

本試驗分別以蛋白胨、酵母浸粉、硝酸鈉、硫酸銨和復(fù)合氮源1（酵母浸粉∶蛋白胨=1∶1）為篩選氮源，羧甲基纖維素酶活力為指標(biāo)進(jìn)行試驗，結(jié)果（圖2）顯示，當(dāng)?shù)礊榈鞍纂藭r，大伏革菌的纖維素酶活力達(dá)到最大（892.46 U/L），復(fù)合氮源1次之，而以硝酸鈉為氮源時，大伏革菌的纖維素酶活力最低（725.69 U/L）。方差分析結(jié)果（表3）顯示，所用氮源不同，不同處理間大伏革菌維素酶活力差異極顯著。選擇蛋白胨作為大伏革菌產(chǎn)纖維素酶的最適氮源。

圖2 不同氮源對纖維素酶活力的影響

表3 氮源方差分析表

2.4 正交試驗結(jié)果分析

4因素3水平3重復(fù)正交試驗結(jié)果見表4，分別使用極差分析和方差分析法對試驗結(jié)果進(jìn)行分析。極差分析結(jié)果顯示，碳源對纖維素酶活力影響最大，其次是氮源，影響最小的因素為磷酸二氫鉀。從平均值看，碳源、磷酸二氫鉀、硫酸鎂的第3水平最好，氮源的第1水平最好，因此，大伏革菌產(chǎn)纖維素酶最佳培養(yǎng)基組合為A3B1C3D3。

以大伏革菌纖維素酶活力為因變量對正交試驗結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果（表5）顯示，不同水平的碳源、氮源、磷酸二氫鉀和硫酸鎂對大伏革菌纖維素酶活力影響均顯著。綜合兩種分析方法，得出大伏革菌產(chǎn)纖維素酶最佳培養(yǎng)基組合為A3B1C3D3，即1 L培養(yǎng)基中含葡萄糖30.00 g，蛋白胨5.00 g，磷酸二氫鉀3.00 g，硫酸鎂1.50 g。由于正交表中沒有該組合，所以設(shè)置1組試驗來進(jìn)一步驗證最佳培養(yǎng)基組合的合理性，得出大伏革菌纖維素酶活力分別為：3 002.29、3 142.51和3 091.52 U/L，平均值為3 078.77 U/L，大于正交表中最大值1 304.78 U/L，認(rèn)為該組合適合大伏革菌產(chǎn)纖維素酶。

表4 四因素三水平正交試驗結(jié)果

表5 正交試驗方差分析表

2.5 pH 值對大伏革菌纖維素酶活力影響

培養(yǎng)基的酸堿度對真菌生命活動有很大的影響，本試驗在單因素和正交試驗的基礎(chǔ)上，探索不同pH值對大伏革菌纖維素酶活力的影響?？刂瞥跏紁H值分別為：3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0和8.0，酶反應(yīng)時間30 min，測定羧甲基纖維素酶活力，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，隨著培養(yǎng)基酸堿度遞增，羧甲基纖維素酶活力先增高后降低，在pH4.0時，大伏革菌纖維素酶活力達(dá)到最大，pH8.0時，酶活力最低。方差分析結(jié)果（表6）顯示，不同pH值對大伏革菌纖維素酶活力影響有顯著差異，故選擇pH4.0作為大伏革菌產(chǎn)纖維素酶最適初始pH。

圖3 pH值對纖維素酶活力的影響

表6 pH值方差分析表

2.6 接種量對大伏革菌纖維素酶活力影響

本試驗在單因素和正交試驗的基礎(chǔ)上，探索不同接種量對大伏革菌纖維素酶活力的影響。分別接種2%、5%、10%和15%種子液于100 mL/250 mL三角瓶中，酶反應(yīng)時間30 min，測定羧甲基纖維素酶活力。結(jié)果（圖4）顯示，在100 mL培養(yǎng)基中接入5%的種子液，纖維素酶活力最大，而接入15%的種子液，酶活力最小。方差分析結(jié)果（表7）顯示，不同接種量對大伏革菌纖維素酶活力影響有顯著差異，5%的接種量最適合大伏革菌產(chǎn)纖維素酶。

圖4 接種量對纖維素酶活力的影響

表7 不同接種量方差分析表

2.7 裝液量對大伏革菌纖維素酶活力影響

本試驗在單因素和正交試驗的基礎(chǔ)上，探索不同裝液量對大伏革菌纖維素酶活力的影響。在250 mL三角瓶中，分別裝入50、70、100、120、140和160 mL培養(yǎng)基，酶反應(yīng)時間30 min，測定羧甲基纖維素酶活力，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，隨著裝液量的增加，大伏革菌纖維素酶活力先增高后降低，裝液量為120 mL時，酶活力最大；50 mL時，酶活力最小。方差分析結(jié)果（表8）顯示，不同裝液量對大伏革菌纖維素酶活力影響有顯著差異，故選擇120 mL作為大伏革菌產(chǎn)纖維素酶最佳裝液量。

圖5 裝液量對纖維素酶活力的影響

表8 裝液量方差分析表

2.8 高效大伏革菌菌株篩選

本試驗從芬蘭和中國野生大伏革菌中通過測定其纖維素酶活力的方法來篩選生物防治異擔(dān)子菌的高效菌株，芬蘭Verdera公司的商業(yè)制劑Rotstop-F作為對照菌株，試驗所用培養(yǎng)基為優(yōu)化后培養(yǎng)基，即1 L培養(yǎng)基中含葡萄糖30.00 g，蛋白胨5.00 g，磷酸二氫鉀3.00 g，硫酸鎂1.50 g，裝液量120 mL/250 mL，接種量5%（V/V），初始pH為4.0。結(jié)果（圖6）顯示，不同大伏革菌其纖維素酶活力不同，菌株08077纖維素酶活力最高，Rotstop-F次之，13025最低。方差分析結(jié)果（表9）顯示，不同菌株間纖維素酶活力酶活力有顯著差異，經(jīng)多重比較，菌株

08077和對照Rotstop-F間纖維素酶活力有顯著差異，08077比商業(yè)化的生物制劑具有更高的纖維素酶活力，能更好的防治中國的異擔(dān)子菌。

圖6 高效大伏革菌菌株篩選

表9 高效大伏革菌菌株篩選方差分析表

3 討論

纖維素酶是誘導(dǎo)酶，不同碳源對纖維素酶的合成具有顯著的影響［15］，本試驗通過單因子試驗，從5種碳源中最終選擇葡萄糖作為大伏革菌產(chǎn)纖維素酶的最適碳源，通過方差分析，該選擇具有合理性；碳源濃度為30 g/L，濃度過低不能滿足微生物生長、繁殖和代謝所需的營養(yǎng)物質(zhì)和能源，不利于產(chǎn)酶。氮源是微生物細(xì)胞蛋白質(zhì)和核酸的主要成分，對微生物的生長發(fā)育有著重要的意義［16］，本試驗中蛋白胨對纖維素酶的合成有較大的誘導(dǎo)作用，這與勇強等［19］在2004年得出的里氏木霉產(chǎn)纖維素酶最適氮源是一致的。正交試驗顯示，蛋白胨最適用量為5 g/L，蛋白胨濃度過高反而不利于產(chǎn)酶，原因可能為氮源濃度過高，菌體生長過于旺盛，發(fā)酵液黏稠，影響溶解氧和營養(yǎng)物質(zhì)的利用［17］，從而對酶的生產(chǎn)帶來不利的影響，所以“高碳低氮”比較適合大伏革菌產(chǎn)生纖維素酶。

無機(jī)鹽也是微生物生長過程中不可缺少的營養(yǎng)物質(zhì)。K+是細(xì)胞中的主要無機(jī)陽離子，是許多酶的激活劑，它與原生質(zhì)膠體特性和細(xì)胞膜透性密切相關(guān)［18］，而磷酸二氫鉀還具有調(diào)節(jié)滲透壓和緩沖調(diào)節(jié)pH的作用［19］，本試驗最佳磷酸二氫鉀用量為3 g/L；Mg2+在微生物的生長代謝中起著重要作用，是許多重要酶的輔助因子，在細(xì)胞中起著穩(wěn)定核糖體、細(xì)胞膜和核酸的作用［18］，本試驗最佳硫酸鎂的用量為1.5 g/L。

pH值通過影響菌體細(xì)胞膜的帶電荷性質(zhì)、膜的穩(wěn)定性及相應(yīng)酶的活性來影響菌體生命活動［18］，本試驗最佳pH為4.0，隨著培養(yǎng)基酸堿度的遞增，酶活力降低，此結(jié)論與黑曲霉的最適pH大體一致［20］，由此判斷大伏革菌適合在酸性條件下產(chǎn)纖維素酶，最終選擇pH4.0作為大伏革菌產(chǎn)纖維素酶初始pH。

培養(yǎng)基裝液量和接種量通過影響其通氣量和營養(yǎng)物質(zhì)的利用來影響菌體產(chǎn)酶［21］，裝液量越小，其通氣量越高，本試驗最佳裝液量為120 mL，裝液量繼續(xù)增大，纖維素酶活力沒有明顯增大，相反搖床負(fù)荷變大，不利于儀器的長久使用。在營養(yǎng)物質(zhì)含量固定的情況下，接種量越大，隨著培養(yǎng)時間的延長，營養(yǎng)物質(zhì)消耗過快，導(dǎo)致營養(yǎng)不足，影響微生物生長，所以本試驗最佳接種量為5%（V/V）。

Davet［22］在1987年發(fā)現(xiàn)，纖維素酶在生防菌株營養(yǎng)競爭方面起著重要作用，纖維素酶活與其生物防治潛能有一定相關(guān)性，纖維素酶活越高，生防潛能越大。本試驗得出，大伏革菌的不同菌株纖維素酶活力具有差異性，使其生物防治效率不同。本人在前期初篩試驗中得出，04052、08076、08077號大伏革菌較芬蘭其他野生菌株具有較高的生長速率和拮抗率，能夠快速覆蓋小孔異擔(dān)子菌，起到顯著的生防效果，故本試驗材料選擇此3株菌株進(jìn)行，由于三者拮抗率差異不顯著，所以，本研究通過測定大伏革菌纖維素酶活力進(jìn)一步篩選高效菌株。結(jié)果表明，08077號菌株纖維素酶活力最大，比芬蘭商業(yè)化的生物制劑Rotstop-F及野生大伏革菌菌株04052、08076號具有更高的纖維素酶活力，說明08077號菌株具有更好的防治中國小孔異擔(dān)子菌的潛能。

4 結(jié)論

通過單因素和正交試驗結(jié)合的方法，以纖維素酶活力為篩選指標(biāo)，優(yōu)化大伏革菌產(chǎn)纖維素酶條件，通過測定野生大伏革菌（Phlebiopsis gigantea）菌株在最優(yōu)條件下所產(chǎn)生纖維素酶活力高低來篩選防治針葉樹根腐病的高效菌株。結(jié)果表明，大伏革菌最適產(chǎn)纖維素酶條件為（g/L）：葡萄糖30.00，蛋白胨5.00，磷酸二氫鉀3.00，硫酸鎂1.50，裝液量120 mL/250 mL，接種量5%（V/V），初始pH為4.0。供試菌株中08077號菌株纖維素酶活力最大，13025號菌株最小，顯示08077號菌株比芬蘭商業(yè)化生物制劑Rotstop-F具有更好的防治中國小孔異擔(dān)子菌的潛能。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Optimization of Submerged Culture Requirements for the Cellulase Activity by Phlebiopsis gigantea and Screening the Most Effective Strain

Li Xingchun He Shuanghui Dai Yucheng
（Institute of Microbiology，Beijing Forestry University，Beijing 100083）

The activity of extracellular cellulase could be used for screening the effective biocontrol strain. We could acquire the most effective Phlebiopsis gigantea isolate associated with biocontrol conifer root and butt rots by determining cellulase activity of them. Based on single factor and orthogonal experiment, the optimum medium compositions for the highest cellulase activity were（g/L）：glucose 30.00, peptone 5.00, KH2PO43.00, MgSO4·7H2O 1.50, the optimal liquid medium volume was 120 mL/250 mL, the optimal inoculum volume was 5%（V/V）, initial pH4.0. By determining cellulase activity of P. gigantea isolates, we concluded that P. gigantea 08077 had the highest cellulase activity and 13025 was the lowest. P. gigantea 08077 is better to control the Chinese Heterobasidion parviporum than Rotstop-F that had been registered in Finland.

Phlebiopsis gigantea Submerged culture Optimization Cellulase activity Orthogonal array design

2013-10-09

引進(jìn)國際先進(jìn)林業(yè)科學(xué)技術(shù)項目（2012-4-65）

李杏春，女，碩士研究生，研究方向：異擔(dān)子菌的生物防治；E-mail：xingchun_8914@foxmail.com

戴玉成，男，博士，教授，研究方向：菌物分類與分子系統(tǒng)學(xué)，森林病理學(xué)；E-mail：daiyucheng2013@gmail.com