自養(yǎng)條件下高氯酸鹽降解細菌群落研究

謝宇軒關(guān)翔宇于麗莎劉菲

（1.中國地質(zhì)大學水資源與環(huán)境學院，北京 100083；2.中國地質(zhì)大學海洋學院，北京 100083）

自養(yǎng)條件下高氯酸鹽降解細菌群落研究

謝宇軒1關(guān)翔宇2于麗莎1劉菲1

（1.中國地質(zhì)大學水資源與環(huán)境學院，北京 100083；2.中國地質(zhì)大學海洋學院，北京 100083）

旨在研究自養(yǎng)條件下以氫氣作為電子供體高氯酸根離子（ClO4-）的微生物降解機制，利用HiSeq 2000對微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性進行高通量測序及分析。結(jié)果表明，添加氫氣的HD（hydrogen degradation）體系將10 mg/L ClO4-降至檢出限以下共經(jīng)歷71 d。ClO4-完全降解后HD體系中總細菌的相對豐度為84.96%，絕大多數(shù)降解細菌分布的變形菌門相對豐度為68.11%，占總細菌數(shù)的比例達到80.16%。其中屬于β-變形桿菌綱的ClO4-代表性降解細菌（perchlorate-reducing bacteria，PRB）Dechloromonas的相對豐度為2.7%，另一種Azospira為3.1%。通過KEGG注釋對菌種功能進行分析。參與糖代謝的基因相對豐度為4.75%，參與能量代謝的基因相對豐度為3.35%，其中參與氮循環(huán)的基因相對豐度為0.72%，參與氯代物降解和氯循環(huán)的基因相對豐度為0.83%，補充氫氣對反應(yīng)體系內(nèi)生物群落結(jié)構(gòu)變化起到選擇純化作用，使優(yōu)勢菌群趨于單一。

高氯酸根離子（ClO4-） 電子供體 氫氣 細菌群落結(jié)構(gòu) 高通量測序

作為一種環(huán)境污染物，高氯酸根（ClO4-）最早于1997年被美國加利福尼亞州飲用水衛(wèi)生監(jiān)測部門發(fā)現(xiàn)，當?shù)?78個檢測井的109口中有高氯酸鹽的檢出（包括地下水和地表水）［1，2］。至2007年美國已有超過400個位點的地下水，地表水，飲用水和土壤中都有高氯酸鹽污染的檢出發(fā)現(xiàn)。目前已

有報道的高氯酸鹽污染最大質(zhì)量濃度，飲用水中為811 μg/L；地下水中為3.7×106μg/L，地表水中為1.2×105μg/L［3］。2011年美國EPA制定的最新規(guī)劃將高氯酸鹽正式納入飲用水安全標準（http：//water. epa.gov/drink/contaminants/unregulated/perchlorate. cfm）并將于隨后的24個月內(nèi)公布最大污染界限值（MCL）［4］。

高氯酸鹽的分子結(jié)構(gòu)決定了其化學性質(zhì)較穩(wěn)定，通常情況下很難去除［5-7］。目前常用的去除高氯酸鹽的方法有離子交換法（IX）和生物降解法。生物降解作用的本質(zhì)是由參與高氯酸鹽降解細菌（perchlorate reducing bacteria，PRB）的活性決定的。添加無機電子供體實現(xiàn)自養(yǎng)條件下高氯酸鹽降解的研究及應(yīng)用相對較多的是H2，其理論依據(jù)是許多自養(yǎng)型細菌可以利用氫作為電子供體滿足自身生長需求。自然界中的高氯酸鹽去除往往并非單一菌種的作用，而是多種細菌共同作用，而自養(yǎng)型細菌的種群密度正是決定氫還原體系下高氯酸鹽降解速率的關(guān)鍵［8-10］。參與高氯酸鹽降解的細菌可分為4類：高氯酸鹽降解細菌，如Dechloromonas和Dechlorosoma（Azospira）；氯酸鹽降解細菌（chlorate reducing bacteria，CRB），如Ideonella dechloratans；高濃度氯酸鹽耐受條件下的高氯酸鹽降解細菌（high chlorate accumulating perchlorate reducing bacteria，HCAP），如DechloromonasPC1；一些脫氮細菌（Denitrifying bacteria），如Pseudomonas［11］、Rhodobacter sphaeroides［12］等。最常見的參與高氯酸鹽降解作用的細菌是Azospira［13］和Dechloromonas［14］。以往的研究往往針對單一菌種或在特定的培養(yǎng)條件下進行，少有對復雜介質(zhì)中生物降解高氯酸鹽菌種及功能的分析。

本研究選用常見的厭氧生物反應(yīng)器作為高氯酸鹽降解的培養(yǎng)基質(zhì)，添加氫氣作為電子供體支持ClO4

-的完全降解，采用高通量測序的方法對該體系內(nèi)菌種的結(jié)構(gòu)和功能進行分析。該方法可以更詳盡地把握環(huán)境中的微生物群落結(jié)構(gòu)及其功能，進一步反映電子供體的存在對反應(yīng)基質(zhì)的選擇性影響，闡釋混合體系中高氯酸鹽生物降解作用的本質(zhì)，旨在為原位或異位高氯酸鹽生物修復技術(shù)的強化提供理論支持和現(xiàn)實依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 高氯酸鹽降解試驗體系的設(shè)置

用于高氯酸鹽降解的厭氧生物反應(yīng)器培養(yǎng)條件為pH值6.92-7.35，溫度30℃，測定溶解氧（DO）質(zhì)量濃度為0.46 mg/L［15］。生物培養(yǎng)采用的基礎(chǔ)營養(yǎng)液成分參考王蕊等［16］研究內(nèi)容。

高氯酸鹽降解試驗體系的設(shè)置如下所示：

以上各反應(yīng)體系的條件為：DO＜2.0 mg/L，pH：7.0-8.0，溫度：30℃。

1.2 微生物數(shù)據(jù)分析方法

1.2.1 樣品總DNA的提取 使用細菌基因組提取試劑盒（天根，TIANGEN，北京）對HD體系降解完畢的樣品進行總DNA提取，產(chǎn)物保存于-20℃冰箱以備后續(xù)生物群落分析研究。

1.2.2 高通量測序分析 通過高通量測序（High-Throughput Sequencing）的方法獲得生物群落的信息。通過Stratagene Mx3000P Real-time PCR Cycler（Agilent，Santa Clara，CA，USA）分析儀進行定量分析［Qubit Fluorometer（Invitrogen，Life Technologies，Grand Island，NY，USA）作為染料］。使用Illumina HiSeq 2000高通量測試儀上機測序（Sequencing），所得的堿基對末端序列（PE）需進行篩選，排列（6-40 bp）和拼接（Data Analysis）。整理所得序列與BLASTX（Basic Local Alignment Search Tool）進行比對和注釋，并與NCBI（National Center for Biotechnology Information，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）的NR

（non-redundant）數(shù)據(jù)庫進行比對，最后通過MEGANv4.0軟件構(gòu)建HD體系系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果

2.1 HD體系ClO4-降解與菌種多樣性分析

研究中HD體系ClO4-初始質(zhì)量濃度為10 mg/L。反應(yīng)開始較長一段時間（約15 d）內(nèi)，排除儀器測試誤差等因素外，ClO4-的質(zhì)量濃度基本無變化。反應(yīng)進行至20 d后，經(jīng)歷了降解延滯期的ClO4-質(zhì)量濃度緩慢下降，至ClO4-質(zhì)量濃度達到2 mg/L左右時，如圖1所示，60 d后ClO4-的降解出現(xiàn)加速的過程，并于70 d時降至檢出限以下。ClO4-降解完全后，對體系內(nèi)生物群落構(gòu)成進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建分析，高通量測序所得數(shù)據(jù)大小為1.13 GB。MEGAN（version 4.70.4）軟件比對結(jié)果表明，HD體系中總細菌相對豐度為84.96%，HD體系系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。

變形桿菌門細菌在總細菌群落中所占比例最大，達到80.16%。屬于變形桿菌門的細菌結(jié)構(gòu)比例如圖3所示。

圖1 HD體系高氯酸鹽降解圖

屬于α-變形桿菌綱的細菌占體系內(nèi)總細菌數(shù)的比例為18.62%，β-變形桿菌綱的細菌相對豐度為34.17%，占總細菌數(shù)的比例為40.22%，而γ-變形桿菌綱的細菌占總細菌數(shù)的比例為11.12%。除δ-proteobacteria變形桿菌綱所占比例極少外，HD體系中的α-變形桿菌綱、β-變形桿菌綱和γ-變形桿菌綱的細菌分布相對較均勻。其中代表性的高氯酸鹽（氯酸鹽）降解細菌，如Dechloromonas，Azospira和一部分可以參與ClO4-降解的反硝化細菌如Pseudomonas［17-20］等均有檢出，且相對豐度較大。該體系內(nèi)主要以β-變形桿菌綱的細菌為主。

2.2 HD體系基因功能性分析

HD體系降解完畢后，通過高通量測序和KEGG注釋的功能分析可知，HD體系中參與物質(zhì)代謝過程的基因總相對豐度為17.67%。維持生物體正常生命活動和能量代謝常見的幾種重要功能基因的相對豐度較大，如參與氨基酸類物質(zhì)代謝的基因相對豐度最大為5.46%，其次為參與生物體內(nèi)糖代謝的基因，其相對豐度為4.75%，參與能量代謝的基因相對豐度為3.35%。對于環(huán)境中能夠降解某些特定污染物的功能基因分析結(jié)果表明，可參與氮循環(huán)的基因相對豐度為0.72%，參與氯循環(huán)的基因豐度為0.83%。部分基因KEGG功能分析結(jié)果如圖4所示。

3 討論

研究所選用的降解基質(zhì)本身經(jīng)傳代過程驗證，具有降解ClO4-的潛在能力，說明該厭氧反應(yīng)器自身的細菌群落組成中即有高氯酸鹽降解細菌的存在。

添加氫氣作為電子供體支持高氯酸鹽降解的生物修復過程較緩慢，整個反應(yīng)周期共需要約71 d。王蕊等［16］研究表明，降解初始質(zhì)量濃度為9 mg/L的ClO4-，ClO4-初期的降解速率低，當ClO4-降至2 mg/L時，降解過程可提速2倍，延滯期的時長占整個降解周期的約1/4，此現(xiàn)象與Nozawa-Inoue等［21］利用氫氣作為電子供體降解高氯酸鹽反應(yīng)初期延滯期較長（41 d）的特點一致。造成HD體系延滯期較長的原因：（1）由于H2本身在水中的溶解度很低（0.08 mg/L at 5% H2）。根據(jù)亨利定律，在等溫等壓的條件下，某種氣體在溶液中的溶解度與液面上該氣體的平衡壓力成正比。本研究中當通入氣體流量一致時，H2在溶液中的溶解度應(yīng)與液面上該氣體的平衡壓力成正比。因此，通入H2的時間越長，則H2的溶解度應(yīng)當越高，故反應(yīng)初期H2在反應(yīng)溶液中的低溶解度會影響自養(yǎng)型降解細菌的適應(yīng)和發(fā)育；（2）由于HD體系的培養(yǎng)基質(zhì)是由原始厭氧生物反應(yīng)器傳代而來，整個反應(yīng)體系內(nèi)的細菌相當于經(jīng)歷了一次異養(yǎng)降解過程，導致系統(tǒng)初始細菌種群密度有所變化，故將此體系轉(zhuǎn)為由H2提供電子供體的自養(yǎng)降解環(huán)境時，細菌的適應(yīng)期會更長，從而對后續(xù)的試驗研究造成影響；（3）當H2存在時，反

應(yīng)體系內(nèi)同時發(fā)生電子供體的競爭作用。NO3-、O2、ClO4-三者間電子利用的優(yōu)先級順序為：O2＞NO3-＞ClO4-［22，23］。綜合以上3點，HD體系中ClO4-降解初期反應(yīng)速率很低。隨著反應(yīng)的進行，經(jīng)歷延滯期的細菌開始加速高氯酸鹽的降解。也有相關(guān)研究表明，用Dechloromonassp. PC1細菌降解高氯酸鹽，反應(yīng)后期高氯酸鹽降解速率增加，有一部分原因是當體系內(nèi)的ClO4-質(zhì)量濃度變低時，高氯酸鹽降解細菌在整個生物群落中所占的比例增加，并逐漸成為體系內(nèi)的優(yōu)勢種群［18，24］。該降解過程最終降解周期為65 d。2000年Miller等［8］利用污水處理廠的污泥作為菌源和反應(yīng)基質(zhì)，同樣通過通入H2作為電子供體，進行高氯酸鹽的降解柱試驗研究。145 d的時間內(nèi)，高氯酸鹽降解率達45%。當利用H2作為電子供體進行高氯酸鹽的降解研究時，其反應(yīng)時間往往較

長，是由于自養(yǎng)細菌本身對能量的利用方式在與異養(yǎng)型細菌共存競爭時往往處于劣勢。

圖2 HD體系基于reads序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 HD降解體系中變形桿菌門細菌分布比例圖

圖4 KEGG注釋功能分析圖

HD體系中總細菌相對豐度為84.96%，導致該體系內(nèi)菌種豐度較大的兩個因素：一是由于添加氫氣促進了反應(yīng)體系內(nèi)所有可利用氫氣作為電子供體的細菌生長，另一方面則是由于該反應(yīng)的降解周期較長且用于生物多樣性分析的樣品取自ClO4-剛剛降解完畢，培養(yǎng)時長會導致該體系內(nèi)菌種數(shù)量明顯增加。大部分的高氯酸鹽降解細菌（PRB）分布于β-變形桿菌綱，而氯酸鹽降解細菌（CRB）則主要分布于γ-變形桿菌綱［12］。HD體系中Dechloromonas的相對豐度為2.7%，證明了作為高氯酸鹽降解最具代表性的細菌，Dechloromonas廣泛存在于自養(yǎng)條件下的高氯酸鹽降解體系中［7，17，18，25，26］。另一種常見的高氯酸鹽降解細菌Azospira的相對豐度也有3.1%。有文獻［27-29］表明，許多已經(jīng)分離得到的高氯酸鹽降解菌都同時具有脫氮作用。本研究HD體系中也有較多既參與高氯酸鹽還原又可以參與反

硝化過程的細菌，如Pseudomonas［11］、Rhodobacter sphaeroides［12］和Acinetobacter［29］的檢出，其相對豐度分別0.01%、4.4%和3.5%，證明HD體系由于電子供體氫氣的加入，不僅促進了反應(yīng)體系內(nèi)某些代表性的高氯酸鹽降解細菌的生長，同時也促進了其他一些可以參與高氯酸鹽（或氯酸鹽）還原過程的細菌發(fā)育。對HD體系內(nèi)檢出基因的功能分析結(jié)果證明參與氮循環(huán)的基因豐度和參與降解氯代物的基因相對豐度比例較為相似，推測這些參與氮類物質(zhì)和氯循環(huán)的細菌共同作用實現(xiàn)了HD體系中ClO4-的還原降解。雖然通過KEGG注釋分析功能基因具有一定的局限性，但亦能說明復雜條件下高氯酸鹽污染的降解是多種細菌共同作用的結(jié)果。并且由于添加了氫氣使得厭氧生物反應(yīng)器本身的菌種結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，成為適合高氯酸鹽降解的體系。

4 結(jié)論

高氯酸鹽污染在添加了電子供體氫氣后可以實現(xiàn)完全降解。10 mg/L ClO4-降至檢出限以下共經(jīng)歷71 d，降解速率較慢。ClO4-降解完全后，HD體系中總細菌相對豐度為84.96%，大多高氯酸鹽降解細菌分布的變形桿菌門細菌占總細菌的比例較大，達到80.16%。如Azospira和Dechloromonas等代表性的高氯酸鹽降解細菌相對豐度也有一定的檢出。此外，可同時參與高氯酸鹽降解和反硝化作用的細菌如Pseudomonas相對豐度為4.4%。功能分析表明高氯酸鹽的降解是多種細菌共同作用的結(jié)果。額外添加電子供體使HD體系內(nèi)的細菌種群結(jié)構(gòu)簡單化，參與某種特定污染物降解的細菌所占比例增加，從而使混合降解基質(zhì)本身的功能趨于專一。

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（責任編輯 馬鑫）

The Study of the Structure of Perchlorate（ClO4-）-degrading Bacterial Communities Under Autotrophic Conditions

Xie Yuxuan1Guan Xiangyu2Yu Lisha1Liu Fei1
（1. School of Water Resources and Environment，China University of Geosciences，Beijing 100083；2. School of Ocean Sciences，China University of Geosciences，Beijing 100083）

For the purpose of further investigating the biological degradation under an autotrophic condition and well understanding the microbial community structures in a complex environment, hydrogen was used as an electron donor to completely reduce perchlorate（ClO4-）in this study. The composition of microbial communities after degradation was analyzed via the construction of a cloning library by using the High-Throughput Sequencing method（HiSeq 2000）. 71 days were needed to completely degrade 10 mg/L ClO4-. Microbial phylogenic analysis of HD（hydrogen degradation）after degradation indicated that the relative abundance of total bacteria in the HD was 84.96% whereas the relative abundance of Proteobacteria was 68.11%, whose percentage accounting for the total bacteria reached to 80.16%. The relative abundance of Dechloromonas which is representative in PRB was 2.7% in the HD. Simultaneously, the relative abundance of Azospira was 3.1%. KEGG was used to analyze the function of bacteria in HD. The relative abundance of genes which engaged in carbohydrate metabolism was 4.75%, and the genes included in energy metabolism was 3.35%, whereas the genes participated in nitrogen cycle was 0.72%, and the genes involving chloride transformation was 0.83%. It was demonstrated that degradation of ClO4-in a complicated condition was achieved by various kinds of microbes rather than a single one. Adding hydrogen as an electron donor to change microbial community played a role in the purification or selection process in the system, which allowed the complex systems to have the specific capacity to remove given contaminates.

Perchlorate（ClO4-） Electron donor Hydrogen The composition of microbial communities High-Throughput Sequencing

2013-10-31

國家自然科學基金項目（41272268），中國地質(zhì)調(diào)查局項目（1212011121171），中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項資金（2652012071）

謝宇軒，男，博士研究生，研究方向：地下水污染生物修復；E-mail：yuxuanxie@163.com

關(guān)翔宇，女，博士，講師，研究方向：環(huán)境微生物；E-mail：guanxy@cugb.edu.cn