棉鈴蟲(chóng)（Helicoverpa armigera）FK506結(jié)合蛋白基因的克隆、表達(dá)與純化

劉小寧 李芬 趙文博 朱燕 趙潔

（新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830046）

棉鈴蟲(chóng)（Helicoverpa armigera）FK506結(jié)合蛋白基因的克隆、表達(dá)與純化

劉小寧 李芬 趙文博 朱燕 趙潔

（新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830046）

為了深入了解FK506結(jié)合蛋白基因的作用和探索調(diào)控棉鈴蟲(chóng)CYP6B6的表達(dá)機(jī)制，基于單酵母雜雜交結(jié)果采用RT-PCR的方法從棉鈴蟲(chóng)的中腸cDNA中擴(kuò)增得到了FK506結(jié)合蛋白基因，將測(cè)序正確的目的片段克隆至原核表達(dá)載體pET32a中，在大腸桿菌BL21中用異丙基-β-D-硫代半乳糖（IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)，通過(guò)鎳柱離子親和層析純化目的蛋白。用SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)和純化結(jié)果，并用Western blotting進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，克隆得到的目的基因大小為327 bp，編碼108個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子量和等電點(diǎn)分別是11.78 kD和7.87。氨基酸序列分析表明該序列具有完整的開(kāi)放閱讀框，且沒(méi)有信號(hào)肽。重組質(zhì)粒pET32a-FKBP在大腸桿菌BL21中獲得表達(dá)，主要以可溶性形式存在，經(jīng)親和層析柱純化獲得目的蛋白，Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)純化的目的蛋白大小正確且純度高。

棉鈴蟲(chóng) FK506結(jié)合蛋白基因 單酵母雜交

酵母單雜交技術(shù)可以通過(guò)對(duì)報(bào)告基因的表型檢測(cè)，分析DNA與蛋白之間的相互作用，以研究真核細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制。因此現(xiàn)階段，該技術(shù)常用來(lái)尋找與DNA順式作用元件相互作用的特定轉(zhuǎn)錄因子［1］。前期本課題組構(gòu)建了含有細(xì)胞色素P450CYP6B6基因上應(yīng)答植物次生物質(zhì)脅迫的順式作用元件AhR（Aryl hydrocarbon receptor）的酵母報(bào)告株（酵母誘餌報(bào)告子），通過(guò)與植物次生物質(zhì)2-十三

烷酮脅迫后的六齡棉鈴蟲(chóng)的cDNA文庫(kù)蛋白進(jìn)行雜交，以期尋找能夠與芳香烴受體AhR相互作用的轉(zhuǎn)錄因子或調(diào)控蛋白。經(jīng)過(guò)一系列的篩選與鑒定，最終捕獲到一些獵物蛋白，其中一個(gè)長(zhǎng)度為327 bp的序列在NCBI上用Blast軟件比對(duì)發(fā)現(xiàn)其與多種登錄昆蟲(chóng)的FK506結(jié)合蛋白基因（FK506 binding protein，F(xiàn)KBP）序列同源性很高，為79%-84%，與煙草天蛾（Manduca sexta）及家蠶（Bombyx mori）FKBP的同源性最高，如圖1所示。

將該基因的蛋白序列輸入到PDB數(shù)據(jù)庫(kù)（protein data bank）中尋找與其同源關(guān)系較近的蛋白，發(fā)現(xiàn)其三級(jí)結(jié)構(gòu)與肽基-脯氨酰基-順?lè)串悩?gòu)酶（Peptidylprolyl cis-trans isomerase，PPIases）FKBP1A的同源性最高，達(dá)77.8%，圖2-A顯示了該酶的第一模型結(jié)構(gòu)圖，圖2-B紅色鏈給出了FKBP-型肽基-脯氨?；?順?lè)串悩?gòu)酶的活性中心結(jié)構(gòu)模式圖。因此推測(cè)該蛋白應(yīng)該屬于FKBP-C超家族。

圖1 酵母單雜交捕獲的獵物蛋白在NCBI上比對(duì)結(jié)果

圖2 肽酰脯氨酰順?lè)串悩?gòu)酶的結(jié)構(gòu)模型

FKBPs是一類能與大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑FK506和雷帕霉素特異性結(jié)合的高度同源的受體類蛋白家族，在原核生物與真核生物細(xì)胞中廣泛存在且含量豐富［2-4］，它們具有PPIases活性，可催化多肽或蛋白質(zhì)底物中的肽-脯氨酸順?lè)醋拥霓D(zhuǎn)換，從而影響其活性、磷酸化狀態(tài)、蛋白質(zhì)間相互作用、亞細(xì)胞定位及穩(wěn)定性［5，6］，F(xiàn)KBPs還有許多其它的重要的生理功能，如細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)、通道活性的調(diào)節(jié)以及在發(fā)育上的作用等。當(dāng)FK506與FKBP結(jié)合后，F(xiàn)K506特有的立體化學(xué)結(jié)構(gòu)就抑制了FKBP的PPIases活性，進(jìn)而發(fā)揮其免疫抑制效應(yīng)［7-9］。

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)FKBP家族成員有20多個(gè)，在植物、哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)較多［9，11］，昆蟲(chóng)中較少，棉鈴蟲(chóng)中還未見(jiàn)報(bào)道，目前FKBP在棉鈴蟲(chóng)體內(nèi)的功能和作用，以及該蛋白與CYP6B6基因啟動(dòng)子的關(guān)系尚不明確。因此本研究對(duì)捕獲到的FKBP基因進(jìn)行克隆和原核表達(dá)，并對(duì)表達(dá)的蛋白進(jìn)行鑒定與純化，為后期的研究提供素材。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試蟲(chóng)、菌株和載體 棉鈴蟲(chóng)源自中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲(chóng)毒理室，于室內(nèi)用人工飼料長(zhǎng)期飼養(yǎng)，為未接觸過(guò)農(nóng)藥的敏感品系昆蟲(chóng)?？寺【闑. coliDH5α和表達(dá)菌株E. coliBL21感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自北京全式金公司；表達(dá)載體PET32a為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑 高保真的Pfu DNA聚合酶購(gòu)自Promega公司；dNTP、DNA Maker、限制性核酸內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Oligo d（T）18Primers，Reverse Transcriptase M-MLV（RNase Hˉ），Recombinant Ribonuclease Inhibitor均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；DNA凝膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒、實(shí)驗(yàn)引物合成、DNA序列測(cè)定均來(lái)自上海生工生物有限公司；總RNA提取試劑RNAiso Plus試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司；蛋白Maker購(gòu)自Fermentas公司；Ni-NTA Agarose 購(gòu)自Qiagen公司；一抗鼠抗His-Tag單克隆抗體、二抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgA抗體購(gòu)自中杉金橋公司；ECL顯色試劑購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；其余

所用的化學(xué)試劑（無(wú)水乙醇、三氯甲烷、異丙醇等）均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 寡核苷酸引物的設(shè)計(jì)合成 根據(jù)酵母單雜交捕獲的獵物蛋白FK506結(jié)合蛋白基因的編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)合成了RT-PCR 擴(kuò)增所需的兩個(gè)引物，擴(kuò)增目的片段約為327 bp，下劃線為引入的酶切位點(diǎn)（BamH I和Hind III）序列：上游引物：5'-CGGATCCATGGGAGTTAACGTTGAAAC-3'；下游引物：5'-CAAGCTTTTATTCGAGACGCAGGAGTTC- 3'。

1.2.2 FK506結(jié)合蛋白基因的擴(kuò)增 使用RNAiso Plus試劑提取六齡棉鈴蟲(chóng)幼蟲(chóng)的RNA，當(dāng)制備的RNA較純，無(wú)蛋白質(zhì)污染時(shí)，按照Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）試劑1st-Strand cDNA 合成的實(shí)驗(yàn)操作方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得棉鈴蟲(chóng)的cDNA，取其中1 μL作為PCR反應(yīng)的模板。循環(huán)參數(shù)為：94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，反應(yīng)35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7 min。1%瓊脂糖電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物中的目的片段。

1.2.3 原核表達(dá)質(zhì)粒pET-FKBP的構(gòu)建 將回收產(chǎn)物和載體pET32a分別用BamH I和Hind III進(jìn)行雙酶切，純化后16℃過(guò)夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α，篩選陽(yáng)性重組子，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，正確的重組質(zhì)粒命名為pET32a-FKBP，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

應(yīng)用DNAMAN軟件進(jìn)行核酸序列、氨基酸序列的相似性以及同源性分析；應(yīng)用SignalP 3.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）軟件進(jìn)行信號(hào)肽的預(yù)測(cè)；應(yīng)用ExPASy ProtParam（http：//web. expasy.org/protparam/）軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)分子量、等電點(diǎn)預(yù)測(cè)；應(yīng)用ExPASy Protscale（http：//web.expasy. org/protscale/）軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)疏水性的預(yù)測(cè)。

1.2.4 融合蛋白pET32a-FKBP的表達(dá)、鑒定及純化 將測(cè)序結(jié)果正確的陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)細(xì)胞中，將菌液PCR鑒定正確的克隆活化至對(duì)數(shù)期后，加入終濃度為0.5 mmol/L的誘導(dǎo)物IPTG，37℃振蕩培養(yǎng)4 h。以同時(shí)轉(zhuǎn)化有空載體pET32a的BL21及未誘導(dǎo)的菌液作對(duì)照，15%的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。

通過(guò)Western blot檢驗(yàn)?zāi)康牡鞍自贐L21菌株中的正確表達(dá)。用5%脫脂奶粉4℃過(guò)夜封閉；TBST沖洗，加入1∶500稀釋的抗His標(biāo)簽的抗體（一抗），室溫孵育2 h；TBST沖洗后加入1∶2 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體（二抗），室溫孵育1 h。采用ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，LAS-4000成像系統(tǒng)（美國(guó)）進(jìn)行觀察。

將重組菌誘導(dǎo)后超聲破碎至相對(duì)透亮（間隔5 s，共30 min），并將上清和沉淀分開(kāi)處理，用15%的SDS-PAGE檢驗(yàn)該重組蛋白的可溶性。將處理得到的總蛋白按照Ni-NTA His Tag Kit說(shuō)明書(shū)依次用含不同濃度咪唑（5 mmol/L，5次；30 mmol/L，2次；50 mmol/L，2次；800 mmol/L，1次）進(jìn)行洗脫，分別收集所有過(guò)程的流出液并進(jìn)行標(biāo)記。15%的SDSPAGE檢測(cè)，與預(yù)測(cè)大小一致、條帶較粗且單一的樣品所對(duì)應(yīng)的流出液即是所需要純化的目的蛋白。

采用孔徑大小為10 kD的超濾管過(guò)濾濃縮（7 000 r/min離心30 min）目的蛋白，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果

2.1 目的基因的RT-PCR擴(kuò)增

用設(shè)計(jì)的特異性引物，以棉鈴蟲(chóng)的 cDNA為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，35個(gè)循環(huán)后，將PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果（圖3）顯示，在327 bp處有一條明顯的特異性擴(kuò)增帶。

圖3 RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a-FKBP的構(gòu)建與鑒定

目的基因經(jīng)BamH I和Hind III雙酶切后與表達(dá)載體pET32a連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取重組質(zhì)粒，再用BamH I和Hind III進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果如圖4所示，質(zhì)粒提取質(zhì)量較好，酶切后目的基因

線性化，大小正確。

圖4 重組質(zhì)粒pET32a-FKBP雙酶切鑒定結(jié)果

雙酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒，經(jīng)過(guò)生工測(cè)序后對(duì)序列進(jìn)行分析，用DNAMAN軟件與酵母單雜交獲得的序列比對(duì)，結(jié)果一致，說(shuō)明獲得正確的目的基因，該基因具有完整的開(kāi)放閱讀框及起始密碼子ATG，其編碼區(qū)含324 bp核苷酸，正確編碼108個(gè)氨基酸（圖5）；利用SignalP 3.0 Server在線軟件預(yù)測(cè)出該蛋白在N端沒(méi)有信號(hào)肽，利用其它生物信息學(xué)軟件得知該蛋白的分子量為11.78 kD，等電點(diǎn)為7.87，為親水性蛋白。

圖5 FKBP基因序列和氨基酸序列的信息

2.3 FKBP融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、鑒定及純化

通過(guò)15%的SDS-PAGE檢測(cè)顯示（圖6），空載體pET32a及重組pET32a-FKBP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后與誘導(dǎo)表達(dá)前相比，均有一條明顯的蛋白質(zhì)增強(qiáng)條帶，表達(dá)載體分子量為20 kD左右，F(xiàn)KBP的分子量為11.78 kD，故融合蛋白應(yīng)為32 kD左右，誘導(dǎo)表達(dá)后與與預(yù)期的FKBP蛋白相對(duì)分子量相似，說(shuō)明目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)成功。

圖6 FKBP 誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果

對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)正確的融合蛋白做Western blot驗(yàn)證，用ECL法在NC膜上顯色，結(jié)果（圖7）顯示目的條帶單一且清晰，說(shuō)明目的蛋白表達(dá)正確。

超聲破碎后的菌體將上清和沉淀分別處理后經(jīng)15%的SDS-PAGE檢測(cè)顯示，表達(dá)的融合蛋白主要存在于上清液中，充分說(shuō)明該蛋白屬于可溶性蛋白。由于融合蛋白的N端帶有His標(biāo)簽，所以選用Ni-NTA-agarose親和層析柱進(jìn)行純化。15%的SDSPAGE檢測(cè)顯示，用50 mmol/L咪唑洗脫第二次的目的蛋白條帶單一、清晰而且相對(duì)表達(dá)量較大，將收集的蛋白液用10 kD的超濾管過(guò)濾濃縮，同樣經(jīng)Western blot驗(yàn)證，結(jié)果（圖7）顯示純化后的蛋白與目的蛋白大小一致，說(shuō)明表達(dá)的融合蛋白被純化為單一條帶。

圖7 Western blotting 檢測(cè)融合蛋白及純化后的目的蛋白

3 討論

FKBPs 主要通過(guò)它們各自分子量的大小不同而進(jìn)行區(qū)分和命名［12］，該家族基因的數(shù)量仍在增長(zhǎng)，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的有FKBP12，12.6，13，15，22，23，25，36，38，51，52，55，60，63和65［13］。這些蛋白具有不同特征，不僅在染色體上的定位和氨基

酸序列不同，而且在細(xì)胞內(nèi)的位置和功能也不同［14］。其中12 kD的FKBP12蛋白是該家族的代表性成員，它的結(jié)構(gòu)已經(jīng)通過(guò)X-射線和核磁共振技術(shù)（Nuclear magnetic resonance，NMR）得到［4］。目前為止人們?cè)诓溉閯?dòng)物中發(fā)現(xiàn)FKBP12的兩種亞型，分別命名為FKBP12和FKBP12.6，這兩個(gè)FKBP12都由108個(gè)氨基酸殘基組成，含有PPIase結(jié)合域，分子量分別為11.95 kD和11.78 kD［15］。

本試驗(yàn)利用RT-PCR法擴(kuò)增得到的棉鈴蟲(chóng)FKBP基因開(kāi)放閱讀框長(zhǎng) 327 bp，編碼108個(gè)氨基酸，蛋白大小為11.78 kD，等電點(diǎn)為7.87，經(jīng)BLAST比對(duì)，具有FKBP家族特有的結(jié)構(gòu)域且與其他物種尤其是昆蟲(chóng)的FKBP有很高的同源性，如煙草天蛾、家蠶等。所以作者認(rèn)為得到的確實(shí)為棉鈴蟲(chóng)的FKBP序列，且為FKBP12的一種亞型。

為了進(jìn)一步了解該蛋白的特性，將克隆得到的目的基因與高效表達(dá)載體pET32a進(jìn)行連接，構(gòu)建了pET32a-FKBP重組表達(dá)質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞BL21中，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白。由于pET32a上帶有6個(gè)His標(biāo)簽，它是最常用的純化蛋白的融合標(biāo)簽，具有相對(duì)分子質(zhì)量小、不影響目的蛋白的功能、免疫原性相對(duì)較低、純化操作簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)［16，17］。因此，我們利用親和層析法成功純化了目的蛋白FKBP，摸索出一套改進(jìn)的構(gòu)建FKBP蛋白的原核表達(dá)體系，獲得大量FKBP蛋白。

已有報(bào)道表明FKBP12蛋白與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)，參與了新陳代謝，細(xì)胞周期，細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞存活和凋亡以及基因轉(zhuǎn)錄等多種細(xì)胞生命活動(dòng)［18-20］，本試驗(yàn)克隆、表達(dá)并純化得到了棉鈴蟲(chóng)的FKBP蛋白，這將有助于我們更好地闡明棉鈴蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，同時(shí)更好地了解細(xì)胞色素P450CYP6B6與FKBP相互協(xié)調(diào)作用的具體機(jī)制及兩者在細(xì)胞生命活動(dòng)中的作用機(jī)理。

4 結(jié)論

本研究在前期單酵母雜交工作的基礎(chǔ)上，克隆得到棉鈴蟲(chóng)FK506結(jié)合蛋白基因，成功在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)并用親和層析法純化了目的蛋白FKBP，繼而用Western blotting驗(yàn)證獲得的目的基因，為后續(xù)的研究奠定良好的基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Cloning，Expression and Purification of FK506 Binding Protein Gene from Helicoverpa armigera

Liu Xiaoning Li Fen Zhao Wenbo Zhu Yan Zhao Jie
（College of Life Science and Technology，Xinjiang University，Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering，Urumqi 830046）

In order to better understand the role of FK506-binding protein gene and its regulatory mechanism in the CYP6B6 expression of Helicoverpa armigera, the FK506-binding protein cDNA sequence from midgut of H. armigera by RT-PCR was cloned on the basis of result of yeast one-hybrid. The fragment digested by double enzymes was linked to a prokaryotic expression vector pET32a to construct the recombinant expression plasmid pET32a-FK506BP, and then converted into competent Escherichia coli BL21 cells. The fusion protein was induced to express by isopropyl-3-D-thiogalactoside（IPTG）, and purified by immobilized metal-chelating affinity chromatography（IMAC）using a Ni2+matrix column. SDS-polyaerylamide gel electrophoresis（SDS-PAGE）and Western blotting analysis were used to examine the fusion protein. The results of sequencing and sequence analysis showed that the open reading frame of the FK506 binding protein gene was 327 bp, encoding 108 amino acid residues with the predicted molecular weight and isoelectric point of 11.78 kD and 7.87, respectively. The predicted protein had no signal peptide. The recombinant containing recombinant pET32a-FK506BP expressed a soluble protein after being induced by IPTG. SDS-PAGE and Western blot analysis indicated that the fusion protein, purified using Ni2+affinity chromatography, had the predicted size and higher purity.

Helicoverpa armigera FK506-binding protein Yeast one-hybrid

2013-11-07

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31260444），農(nóng)業(yè)部行業(yè)項(xiàng)目（200903033）

劉小寧，女，博士，研究方向：農(nóng)業(yè)昆蟲(chóng)與害蟲(chóng)防治；E-mail：liuxn0103@sina.com；李芬同為本文第一作者