致病性弧菌外膜蛋白及其免疫原性研究進(jìn)展

陸盼盼 郭松林 關(guān)瑞章 馮建軍

（集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廈門 361021）

致病性弧菌外膜蛋白及其免疫原性研究進(jìn)展

陸盼盼 郭松林 關(guān)瑞章 馮建軍

（集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廈門 361021）

弧菌為水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中常見的條件致病菌，其暴發(fā)可導(dǎo)致養(yǎng)殖魚蝦貝類大量死亡。由于常用的化學(xué)藥物防治方法存在耐藥性、藥物殘留等問題使得弧菌病的防治面臨新的挑戰(zhàn)，因而如何獲得安全有效的防治方法成為弧菌所致疾病研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)?；【鸀楦锾m氏陰性菌，外膜是該類型菌細(xì)胞壁特有的結(jié)構(gòu)，由蛋白、糖和脂質(zhì)構(gòu)成。其中外膜蛋白易為宿主免疫系統(tǒng)識別為異物，可以激發(fā)機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫，有可能作為弧菌疫苗的有效成分。對弧菌外膜蛋白免疫原性的研究進(jìn)展作一綜述，以期為弧菌病的防治在外膜蛋白水平上提供一種有效的解決途徑。

弧菌 外膜蛋白 免疫原性 免疫保護(hù)作用 交叉免疫保護(hù)作用

1 致病性弧菌及其所致疾病

近年來，隨著魚類養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，魚類病害頻繁發(fā)生，對魚類規(guī)模化養(yǎng)殖和發(fā)展造成了巨大的威脅，海水養(yǎng)殖魚類尤以弧菌病較為嚴(yán)重，已成為人們研究關(guān)注的焦點(diǎn)?；【鸀橐活惛锾m氏陰性、兼性需氧的桿菌和彎曲桿菌，是水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中常見的條件致病菌，弧菌病的暴發(fā)可導(dǎo)致養(yǎng)殖魚蝦貝類大量死亡［1］?；【鷮俟舶?6個種類，其中12種與人類感染相關(guān)，超過27種與魚類和貝類感染有關(guān)［2］。國內(nèi)外學(xué)者調(diào)查發(fā)現(xiàn)弧菌病的發(fā)生既沒有宿主種屬選擇性和地理差異性，亦無季節(jié)性和時間的區(qū)分，夏秋兩季較多發(fā)，流行適宜溫度為25-32℃。引發(fā)弧菌病的病原性弧菌最早從歐洲鰻鱺中分離獲得，迄今為止報道的水產(chǎn)養(yǎng)殖動物致病性弧菌有數(shù)十種之多（表1）。感染弧菌病的水產(chǎn)動物主要有皮膚潰瘍、爛尾、爛鰭及出血等癥狀，從而引發(fā)動物對外界反應(yīng)遲鈍以及攝食率下降等。國內(nèi)外已經(jīng)報道的弧菌病病原主要有副溶血弧菌（V. parahaemolyticus）、鰻弧菌（V. anguillarum）、溶藻弧菌（V. alginolyticus）、哈維氏弧菌（V. harveyi）、

創(chuàng)傷弧菌（V. vulnificus）、擬態(tài)弧菌（V. mimi cus）、產(chǎn)氣弧菌（V. gazogenes）和河弧菌（V. f luvialis）等［3］?；【〕２捎没瘜W(xué)藥物消毒預(yù)防和抗生素治療，但近年來長期濫用抗菌素不僅造成嚴(yán)重的環(huán)境污染和藥物殘留問題，而且使得致病性弧菌對藥物的耐藥性不斷增強(qiáng)，產(chǎn)生了許多新的耐藥菌株，傳統(tǒng)藥物的治療效果越來越差，使得弧菌病的防治面臨著新的挑戰(zhàn)［1］。因此，如何獲得安全有效的防治方法成為該研究領(lǐng)域的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

表 1 水產(chǎn)動物主要致病性弧菌及其宿主

2 外膜蛋白的基本特征和弧菌主要外膜蛋白

革蘭氏陰性細(xì)菌的外膜是細(xì)胞壁的主要結(jié)構(gòu)，在細(xì)菌與宿主的相互關(guān)系中發(fā)揮著重要作用，外膜具有典型的非對稱性磷脂雙層結(jié)構(gòu)，位于菌體胞漿膜和肽聚糖的外側(cè)，將整個細(xì)菌包圍，膜厚度約8-10 nm，由蛋白、糖和脂質(zhì)構(gòu)成［4］。外膜蛋白（Outer membrane proteins，OMPs）位于細(xì)胞壁表層，是革蘭氏陰性菌特有的外膜主要結(jié)構(gòu)成分，在維持細(xì)菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、細(xì)胞的物質(zhì)交換及細(xì)菌的致病過程中起著十分重要的作用，并且易為宿主免疫系統(tǒng)識別為異物，不僅可以激發(fā)機(jī)體的體液免疫應(yīng)答，而且還可引起細(xì)胞免疫且副作用較小，有可能作為疫苗的有效成分［5-8］。Chart等［9］從鰻弧菌中分離出的2個小分子量的外膜蛋白，能夠有效地刺激機(jī)體的免疫反應(yīng)。

OMPs是重要的黏附因子，宿主的免疫防御系統(tǒng)能很容易識別這些外來物質(zhì)［10］。OMPs具有高度疏水結(jié)構(gòu)可維持結(jié)合反應(yīng)，在宿主感染和致病性中起重要作用，同時OMPs可粘附于黏膜上，與肝臟相關(guān)的淋巴組織抗原遞呈細(xì)胞可很容易地將其作為抗原遞呈給免疫細(xì)胞［11］。通過NCBI對弧菌外膜蛋白基因搜索可發(fā)現(xiàn)弧菌的外膜蛋白主要有OmpK、 OmpU、OmpW及TolC，比對分析表明這些外膜蛋白在不同弧菌間的保守性均較高。

氨基酸序列比對結(jié)果表明，外膜蛋白OmpU、OmpW和OmpK在副溶血弧菌、溶藻弧菌、霍亂弧菌及創(chuàng)傷弧菌中有高度相似性，表明這些蛋白有相似的生物功能［12］。OmpU是重要的膜孔蛋白之一，也是疫苗開發(fā)的重要保護(hù)性抗原，由OmpU基因編碼，分子量為38 kD，是一種孔通道蛋白，可作為親水性和低分子量物質(zhì)輸入輸出的通道；OmpU占外膜蛋白總量的30%左右，研究證明，外膜蛋白OmpU 是霍亂弧菌（Vibrio cholerae）的重要保護(hù)性抗原之一［13-16］。富含β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的外膜蛋白W（OmpW），成熟蛋白分子量為21 kD，該蛋白的表達(dá)依賴體外環(huán)境，可能與壓力條件下的適應(yīng)機(jī)制有關(guān)［17，18］。外膜蛋白K（OmpK）為弧菌屬的廣泛受體，屬于TSX孔蛋白家族，富含β折疊結(jié)構(gòu)，形成狹長的疏水離子通道，該蛋白與調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓功能有關(guān)［2］。

3 弧菌外膜蛋白免疫原性研究

外膜蛋白位于病原菌表面，多數(shù)外膜蛋白具有良好的免疫原性，容易被宿主免疫防御系統(tǒng)識別為異物，從而通過一系列連鎖反應(yīng)引發(fā)機(jī)體的體液免疫與細(xì)胞免疫。目前已有大量關(guān)于弧菌外膜蛋白免疫原性研究的報道，獲得外膜蛋白主要有分離純化和重組表達(dá)兩種方法。

3.1 弧菌外膜蛋白的分離純化及其免疫原性

目前用于分離獲得外膜蛋白的方法主要有十二烷基磺酸鈉SDS、SarkosyⅠ和苯甲基磺酰氟PMSF法。其中PMSF分離獲得的蛋白條帶多且密集，難以區(qū)分主要外膜蛋白；SarkosyⅠ操作方法簡便且能達(dá)到與SDS法相似的效果［19］。研究表明，無論是粗提的外膜蛋白混合物OMPs還是進(jìn)一步分離獲得的單一外膜蛋白成分均具有良好的免疫原性［20］，并且某些弧菌外膜蛋白能對相應(yīng)弧菌病原菌的感染提供65%-100%的免疫保護(hù)率（表2）。這些研究為開發(fā)以弧菌外膜蛋白作為主要抗原的弧菌疫苗奠定了良好的基礎(chǔ)，但分離純化法一次獲得的外膜蛋白量少并且操作過程復(fù)雜，因而廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐還有一定的困難。

表2 分離純化的弧菌OMPs免疫原性分析

3.2 弧菌外膜蛋白的重組表達(dá)及其免疫原性

隨著基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)以及生物信息學(xué)等學(xué)科的迅速發(fā)展，越來越多的弧菌OMPs基因序列測序工作得以完成。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫獲得所需外膜蛋白基因序列設(shè)計特異性引物擴(kuò)增出目標(biāo)基因，構(gòu)建合適的載體進(jìn)行重組表達(dá)，從而在一定程度上提高了外膜蛋白疫苗抗原篩選的進(jìn)度。這類基因工程疫苗生產(chǎn)成本低，易于規(guī)模化生產(chǎn)。目前，已有來源于副溶血弧菌［26，27］、哈維氏弧菌［28，29］、溶藻弧菌［30］等弧菌的OMPs得以成功重組表達(dá)與純化，并且分別在魚體中進(jìn)行了免疫接種試驗。結(jié)果顯示，這些重組OMPs保持了天然OMPs的免疫原性和免疫保護(hù)作用，能有效刺激魚體產(chǎn)生特異性抗體，并且能對相應(yīng)病原菌的感染提供67.6%-90%不等的免疫保護(hù)率（表3）。

3.3 弧菌OMPs多聯(lián)疫苗的免疫原性

細(xì)菌脂多糖、外膜蛋白偶聯(lián)疫苗是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的新型疫苗。李華等［22］制備了哈氏弧菌外膜蛋白與溶藻弧菌脂多糖偶聯(lián)疫苗，結(jié)果表明免疫卵形鯧（Trachinotus ovatus）后，脂多糖偶聯(lián)外膜蛋白免疫原性顯著增強(qiáng)，對哈氏弧菌的免疫保護(hù)率為95%，高于單獨(dú)0MPC免疫組的75%保護(hù)率?；蚬こ碳夹g(shù)的迅速發(fā)展使得漁用疫苗的開發(fā)周期和成本大幅度縮短和降低，并且利用生物技術(shù)構(gòu)建的重組OMP疫苗也頗具應(yīng)用前景。值得一提的是，鄭磊等［31］利用副溶血弧菌外膜蛋白K（OmpK）和鞭毛蛋白A基因（flaA）構(gòu)建融合表達(dá)載體，重組表達(dá)的融合蛋白（r-FlaA-OmpK）免疫美洲黑石斑魚，與單一的重組蛋白（r-OmpK）相比，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生更高水平的抗體效價和免疫保護(hù)作用。副溶血弧菌tdh2基因和鰻弧菌OmpU基因二聯(lián)疫苗免疫大菱鲆可對副溶血弧菌和鰻弧菌感染分別提供100%和35%的免疫保護(hù)率［32］。

3.4 弧菌外膜蛋白共同抗原的免疫原性

弧菌病的暴發(fā)給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重?fù)p失。水生動物尤其是魚類弧菌病的發(fā)生常常是多種（血清型或亞種）弧菌的混合感染，因此篩選具有潛在的交叉保護(hù)性蛋白抗原，作為制備多價疫苗或聯(lián)合疫苗的侯選成分具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，革蘭氏陰性菌的外膜蛋白中存在保守成分，同種細(xì)菌不同菌株的外膜蛋白圖譜很相似，僅有很小的差異，這些差異與菌株的血清型、致病性及生長條件有關(guān)［33］。張崇文等［34］利用雙向電泳和免疫印跡相結(jié)合的方法，借助于質(zhì)譜分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)，溶藻弧菌的 一種功能未知的孔蛋白（Porin，GenBank Accession No. ZP_01260407）和副溶血弧菌的一種麥芽糖孔蛋白的前體蛋白（Maltoporin precursor，GenBank Accession No. NP_801154）能夠和哈維氏弧菌全菌多抗產(chǎn)生免疫反應(yīng)，表明這兩種蛋白可以作為此3種弧菌的交叉保護(hù)性抗原。根據(jù)SDS-PAGE圖譜及免疫印跡發(fā)現(xiàn)，來源于8株弧菌的36 kD外膜蛋白均能與兔抗SR1菌株的血清發(fā)生免疫反應(yīng)，證明36 kD 的外膜

蛋白可能是弧菌共有的特異性抗原［4］。田丁等［35］研究發(fā)現(xiàn)38 kD為溶藻弧菌與創(chuàng)傷弧菌共有的外膜蛋白，為探討研制兩者的外膜蛋白亞單位聯(lián)合疫苗、達(dá)到一種疫苗有效防治2種疾病的目的提供了可能性［35］。另外，研究發(fā)現(xiàn)28 kD的OMP是鰻弧菌（V.anguillarum）和副溶血弧菌的共同抗原［36］，但該外膜蛋白對這兩種弧菌的免疫防治效果尚未見研究報道。

表 3 弧菌重組OMPs免疫原性分析

3.5 弧菌OMPs口服疫苗的嘗試

相比于注射免疫及浸泡免疫，口服免疫具有高效性，操作方便，避免對魚體造成損傷，并能同時引起黏膜免疫應(yīng)答及系統(tǒng)免疫應(yīng)答等諸多優(yōu)點(diǎn)［37］。自1942年Duff［38］首次將殺鮭氣單胞菌滅活口服疫苗應(yīng)用于硬頭鱒獲得成功后，國內(nèi)外不少學(xué)者對魚類腸道黏膜免疫機(jī)制的研究不斷深入，魚類口服疫苗的研究取得了一定的進(jìn)展。

任燕等［39］采用可生物降解的合成高分子聚DL-乳酸-聚乙二醇共聚物（DL-polylactide-co-polyethylene glycol，PELA），包裹哈維氏弧菌重組外膜蛋白OmpK后，制備成PELA-OmpK微球口服免疫鯽魚（Carassius auratus gibelio）。結(jié)果表明，加強(qiáng)免疫4周和8周后微球疫苗免疫組可對活菌攻擊提供70%的免疫保護(hù)率，顯著高于口服OmpK蛋白組和空白對照組。

4 展望

分離純化和重組表達(dá)獲得的弧菌外膜蛋白均具有良好的免疫原性，相對于分離純化法，重組表達(dá)操作過程簡單，單次獲得量多。不同種弧菌間的共同外膜蛋白的篩選可有望解決針對單一致病性弧菌研制疫苗時存在的周期長、免疫次數(shù)多的弊端，因而極有可能成為有效的弧菌亞單位疫苗抗原成分。隨著生物技術(shù)在魚用疫苗開發(fā)中的應(yīng)用，弧菌OMPs多聯(lián)疫苗的構(gòu)建使得外膜蛋白的免疫保護(hù)性顯著增強(qiáng)并可實(shí)現(xiàn)單次免疫同時抵抗多種弧菌感染的效果。然而，國內(nèi)外將不同屬病原菌外膜蛋白構(gòu)建融合表達(dá)載體制備二聯(lián)疫苗的研究十分少見。本實(shí)驗室課題組成員已成功制備遲緩愛德華氏菌OmpS2與嗜水氣單胞菌Ⅱ型孔蛋白二聯(lián)疫苗，免疫美洲鰻鱺后可提供較高的免疫保護(hù)性［40］。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行弧菌屬與其他種屬細(xì)菌二聯(lián)外膜蛋白的研究，以期能達(dá)到單次免疫防治多種細(xì)菌感染的目標(biāo)。另外值得一提的是，以弧菌OMPs進(jìn)行免疫保護(hù)研究時，常用的注射方法雖然用量小、效果好但易造成傷口感染且工作量大，免疫途徑有待優(yōu)化，可嘗試口服免疫。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Review on the Immunogenicity of Pathogenic Vibrio Outer Membrane Proteins

Lu Panpan Guo Songlin Guan Ruizhang Feng Jianjun
（Fishery College，Jimei University，Xiamen 361021）

Vibrio is a common opportunistic pathogen in aquaculture environment, which can lead to an outbreak of mass mortality of fish and shellfish farming. Traditional chemical control methods because of drug resistance, drug residues and other issues make Vibriosis prevention face new challenges, and thus how to get safe and effective prevention and treatment of diseases caused by Vibrio becomes important and difficult. Vibrio is Gram-negative bacteria, the outer membrane is unique to the cell wall of this type of bacteria, which consist of protein, sugar and lipid. The outer membrane protein is easy to be recongnized as foreign by the host immune system then stimulate the humoral and cellular immunity, which may be used as an active ingredient of Vibrio vaccines. A review on the immunogenicity of pathogenic Vibrio outer membrane protein is to provide a new solution for the prevention and treatment of Vibriosis.

Vibrio Outer membrane proteins Immunogenicity Immuno-protection Cross immuno-protection

2013-08-16

國家自然科學(xué)基金項目（31001136）

陸盼盼，女，碩士研究生，研究方向：水產(chǎn)動植物病害防治；E-mail：993814556@qq.com

郭松林，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：水產(chǎn)病原微生物學(xué)與免疫學(xué)；E-mail：gsl@jmu.edu.cn