香菇dsRNA病毒LeV的RT-PCR檢測

香菇dsRNA病毒LeV的RT-PCR檢測

郭杰1，2吳小平1
（1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 350002；2.三門峽農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，三門峽 472000）

香菇病毒HKB（Lentinula edodes mycovirus HKB，LeV）是一種具有潛隱性特點的真菌病毒，廣泛存在于香菇菌株中。為了快速、準確地檢測出LeV，根據(jù)LeV病毒基因組序列（AB.429556.2）的信息，設(shè)計合成一對引物，對25個香菇菌株進行RTPCR檢測，在20個香菇菌株中分別擴增出LeV病毒基因組特有的條帶，在5個香菇菌株中未能擴增出條帶。通過對25個香菇菌株進行dsRNA提取檢測，結(jié)果也表明不存在擴增片段的菌株提取不到dsRNA，存在擴增片段的菌株能夠提取得到dsRNA。因此建立的RT-PCR方法可以快速檢測到香菇dsRNA病毒LeV，能夠?qū)ο愎降馁|(zhì)量檢測提供技術(shù)支持。

dsRNA 真菌病毒 RT-PCR 香菇

香菇病毒HKB（Lentinula edodesmycovirus HKB，LeV），存在于多數(shù)感染病毒的香菇中。最近有報道檢測到一條與其基因組相關(guān)的dsRNA，分子大小為11 282 bp，編碼兩個閱讀框ORF1和ORF2，ORF1編碼一個假定蛋白，ORF2推測編碼RNA依賴的RNA聚合酶［1］。LeV是一種真菌病毒，具有潛隱性的特點，在生產(chǎn)過程中人們不易辯認和排除［2］。通常感染病毒的香菇可以完成自身正常的生命周期，病毒在很長的時期內(nèi)不會產(chǎn)生明顯的癥狀，但也會偶爾出現(xiàn)異常癥狀。如基質(zhì)表面白色絨毛菌絲生長不足或轉(zhuǎn)色不完全［3］，子實體畸型等，這些癥狀往往導(dǎo)致嚴重的經(jīng)濟損失。因此，為滿足香菇菌株質(zhì)量檢測和無毒化生產(chǎn)的需要，本試驗根據(jù)LeV基因序列，擬建立快速、簡單的RT-PCR方法用于香菇病毒LeV感染的檢測診斷。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 香菇菌株236，Cr33，慶科20，春菇一號，香安，9319，L0200，L0205，L0213，L0228，L0232，L0284，L0312，L0318，L0327，L0328，L0334，L0364，L0368，L0391，L0610，L0612，L0617，L0620，感染LeV的菌株L0183［4］均為福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖

20 g，瓊脂20 g，水1 000 mL。

PDB培養(yǎng)基 馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，H2O 1 000 mL。

1.1.3 主要試劑 RT試劑，DNaseⅠ和S1 Nuclease購自Fermentas公司；PCR試劑，pMD18-T，E.coliDH5α購自TaKaRa公司；Trizol試劑盒購自Invitrogen公司；其它試劑均為國產(chǎn)。根據(jù)LeV的ORF2序列信息（GenBank：AB.429556.2）設(shè)計1對引物：LeVY-02-S：5'-ACAGTAGCGGTATCTCA-3'，LeVY-02-A：5'-GCCAGGCAGTTTAGT-3'。

1.2 方法

1.2.1 菌絲體的制備 供試香菇菌種轉(zhuǎn)接于試管中活化（含PDA培養(yǎng)基），滿管后轉(zhuǎn)接于500 mL三角瓶中（含200 mL PDB培養(yǎng)基），25℃下靜置培養(yǎng)15 d，過濾收集菌絲體，用濾紙吸干，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 香菇dsRNA和RNA的提取 供試菌株dsRNA和RNA的提取方法分別參照dsRNA技術(shù)［4］和Trizol試劑盒操作說明書。

1.2.3 香菇dsRNA病毒RT-PCR檢測反應(yīng)體系 RT反應(yīng)體系，首先在0.2 mL PCR管中加入RNA模版（100 ng），10 μmol/L引物L(fēng)eVY-02-A 1 μL，二甲亞砜1 μL，補DEPC水至10 μL，100℃保溫5 min，然后迅速放置冰上5 min。再添加5×RT Buffer 4 μL、10 mmol/L dNTPs 2 μL、40 U/μL Rnase inhibitor 0.5 μL、200 U/μL 反轉(zhuǎn)錄酶M-MuLV 0.5 μL、用DEPC水補充至20 μL，反應(yīng)總體積為20 μL，反應(yīng)程序為42℃反應(yīng)1 h，70℃滅活10 min立刻置于冰上，-20℃保存。

RT反應(yīng)結(jié)束后取1 μL RT產(chǎn)物進行PCR反應(yīng)，添加10×PCR Buffer 3 μL（含15 mmol/L MgCl2），2.5 mmol/L dNTPs 1 μL、5 U/μLTaqDNA聚合酶 0.3 μL、10 μmol/L引物（LeVY-02-S，LeVY-02-A）各1 μL，用DEPC水補充至30 μL，反應(yīng)總體積為30 μL，反應(yīng)程序為95℃預(yù)變性5 min，95℃ 45 s，最佳退火溫度52℃ 45 s，72℃ 45 s，25個循環(huán)，72℃延伸10 min。

1.2.4 病毒核酸類型鑒定 利用DNaseⅠ和S1 Nuclease鑒定該病毒基因組的核酸類型，分別參照DNaseⅠ和S1 Nuclease的操作說明書。

1.2.5 RT-PCR產(chǎn)物的克隆和測序 瓊脂糖凝膠電泳檢測RT-PCR產(chǎn)物后，隨機選取3個菌株擴增的目的片段經(jīng)PCR Fragment Recover Kit回收純化，與pMD18-T Vector連接后轉(zhuǎn)化E.coli.DH5α菌株感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆子，菌落PCR驗證后，送上海生工生物工程公司進行測序，測序結(jié)果運用NCBI Blast進行同源性搜索比較分析。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測

LeVY-02引物RT-PCR結(jié)果（圖1）表明，在25個香菇菌株中，236、L0200、L0328、L0284、L0620菌株不存在特異性目的片段，其余菌株均存在一條大小約434 bp的特異性目的片段。因此，236、L0200、L0328、L0284、L0620菌株中不含有香菇真菌病毒，其余20個菌株中可能含有香菇真菌病毒LeV。

圖1 RT-PCR檢測香菇真菌病毒LeV的瓊脂糖凝膠電泳圖譜

2.2 序列分析

L0183、L0232、L0617菌株RT-PCR擴增的目的片段克隆測序后，結(jié)果（圖2）表明3個片段的序列分別與LeV（AB.429556.2）對應(yīng)序列的相似性為 98%（L0232）、99%（L0183）、99%（L0617）。由此，可以認為存在擴增片段的20個菌株中含有香菇真菌病毒LeV，但其dsRNA可能有差異。

圖2 多序列比對結(jié)果

2.3 病毒核酸類型

經(jīng)過DNaseⅠ和S1 Nuclease鑒定該病毒基因組的核酸類型為dsRNA（圖3）。通過dsRNA的提取結(jié)果也表明不存在擴增片段的菌株提取不到dsRNA，存在擴增片段的菌株能夠提取得到dsRNA。

圖3 香菇真菌病毒LeV基因組瓊脂糖凝膠電泳

3 討論

通常dsRNA病毒可以通過電子顯微鏡進行病毒顆粒的檢測［5-8］，但是電鏡檢測需要的樣品量大，過程復(fù)雜且靈敏度相對較低，對于一些特殊的病毒，電鏡也無法進行檢測。已有研究表明，LeV是一種線性真菌病毒，通過電子顯微鏡沒有發(fā)現(xiàn)同dsRNA相關(guān)的病毒顆粒，通過原子力顯微鏡才獲得了病毒的分子成像［1］，但昂貴的設(shè)備，更高要求的檢測方法令一般的研究單位難以負擔(dān)。dsRNA病毒還可以通過提取病毒基因組進行檢測［9-11］，但傳統(tǒng)的dsRNA提取技術(shù)檢測香菇病毒，經(jīng)常性地出現(xiàn)雜帶影響或提取不到dsRNA［4］。RT-PCR檢測是一種常規(guī)的檢測技術(shù)，在動植物病毒檢測方面已有多篇報道［12-14］，在食用菌dsRNA病毒檢測中也有相關(guān)報道［15，16］，但在國內(nèi)尚未見利用RT-PCR對香菇病毒HKB（LeV）檢測的報道。經(jīng)過LeV的RT-PCR檢測試驗證實，RT-PCR方法較其他檢測方法，不需要特殊且貴重的儀器設(shè)備，也無需活性病毒，只要存在未降解的核酸片段，且達到檢測的最低病毒量就

能夠檢測，具有操作簡單，快速、靈敏性高的特點，可以避免提取病毒顆粒和基因組等檢測方法操作繁瑣或效果不理想等問題。

香菇LeV病毒RT-PCR檢測方法還需要繼續(xù)完善，如進行RT-PCR方法的優(yōu)化試驗，提高檢測的經(jīng)濟性；或開發(fā)具有熒光素標(biāo)記或其他發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記的RT-PCR，提高檢測結(jié)果的可視性；或在香菇病毒分子生物學(xué)的深入研究下，完成病毒基因組的全序列分析，建立核酸分子雜交檢測方法，免疫學(xué)血清檢測方法，酶聯(lián)免疫吸附檢測方法和蛋白質(zhì)微列陣檢測方法等，開發(fā)出簡便、靈敏的病毒檢測試紙條，無論是在研究上或應(yīng)用上都具有廣泛的現(xiàn)實意義。

4 結(jié)論

建立了一種可對香菇LeV病毒核酸進行擴增的RT-PCR方法，適用于香菇LeV病毒的診斷和快速檢測。

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（責(zé)任編輯 李楠）

RT-PCR Detection of dsRNA Virus LeV in Lentinula edodes

Guo Jie1，2Wu Xiaoping1
（1. College of Life Science，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou 350002；2. Institute of SanMenxia Agriculture Science，Sanmenxia 472000）

Lentinula edodes mycovirus HKB（LeV）is a fungal virus with the potential symptoms and exists widely in Lentinula edodes strains. In order to detect LeV from abundant strains rapidly and accurately, a pair of primers were designed according to the sequence of LeV（AB.429556.2）and amplified by RT-PCR method. In a total of 25 strains, 20 strains were positive for LeV and 5 strains were negative. The result of dsRNA extraction also showed dsRNA were obtained in the positive strains and the negative strains were not. In conclusion, the study proved that RT-PCR is a rapid and sensitive method for detection of LeV in Lentinula edodes strains and can attribute to the control of strains quality.

dsRNA Mycovirus RT-PCR Lentinula edodes

2013-09-23

福建省科技廳自然科學(xué)基金項目（2013J01080）

郭杰，男，助理農(nóng)藝師，碩士，研究方向：食用菌病害；E-mail：gjfywx_2008@163.com

吳小平，男，教授，博士，研究方向：食用菌教學(xué)與科研；E-mail：fjwxp@126.com