農(nóng)桿菌介導(dǎo)韭菜遺傳轉(zhuǎn)化相關(guān)因素的研究

農(nóng)桿菌介導(dǎo)韭菜遺傳轉(zhuǎn)化相關(guān)因素的研究

常婧1高行英1李小東2侯雷平1李梅蘭1
（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，太谷 030801；2.方興現(xiàn)代農(nóng)業(yè)有限公司，長治 046600）

以“漢中冬韭”韭菜品種為試驗(yàn)材料，用含有pCAMBIA3301質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌菌株EHA105對影響韭菜遺傳轉(zhuǎn)化效率的多種因素進(jìn)行研究。結(jié)果表明，誘導(dǎo)40 d的愈傷組織，GUS基因瞬時(shí)表達(dá)率達(dá)到93%，且最適宜于不定芽的分化；當(dāng)乙酰丁香酮（AS）的濃度為100 μmol/L時(shí)，愈傷的GUS表達(dá)率達(dá)到91%，植株再生率為7.9%，AS濃度增加時(shí)其值也不會(huì)增加；菌液OD600值為0.6侵染10 min時(shí)，與其他組合相比，外植體受傷程度小，GUS表達(dá)率及再生率最高；侵染后的愈傷共培養(yǎng)3 d后，農(nóng)桿菌生長較少，GUS表達(dá)率為91.1%，而再生率達(dá)到7.2%，為最佳的共培養(yǎng)時(shí)間。通過試驗(yàn)得到韭菜遺傳轉(zhuǎn)化因素的最佳條件，為今后的遺傳轉(zhuǎn)化提供一些參考。

韭菜 農(nóng)桿菌 GUS染色 遺傳轉(zhuǎn)化

韭菜（Allium tuberosumRottl. Ex Spreng）別名草鐘乳、起陽草，是百合科蔥屬多年生宿根草本植物，具有一種特殊而且強(qiáng)烈的韭香氣味，主要以葉片、假莖供食，為我國特有的一種蔬菜［1］。韭菜不僅營養(yǎng)豐富，而且具有多方面的保健功能［2］。另外，韭菜的自然群體內(nèi)缺乏有效的抗病、蟲、草等基因，因此應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行韭菜新品種的開發(fā)是相當(dāng)必要的。

目前國內(nèi)外關(guān)于韭菜遺傳轉(zhuǎn)化的研究較少。僅張松等［3］以GUS報(bào)告基因建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)韭菜轉(zhuǎn)化體系，尚沒有轉(zhuǎn)基因品種成功的報(bào)道。但蔥蒜類其他作物的遺傳轉(zhuǎn)化已經(jīng)比較成熟，尤其是洋蔥和大蒜［4］。迄今為止，已經(jīng)成功獲得了抗除草劑［5］、抗蟲［6］和抗逆性［7］等多個(gè)品種，盡管轉(zhuǎn)化的方法法有基因槍法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，但大多數(shù)采用的是農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法。由于農(nóng)桿菌介導(dǎo)法具有簡便、

單拷貝等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于植物的遺傳轉(zhuǎn)化中，但是該方法的建立需要高效的再生系統(tǒng)作為前提。因此，本試驗(yàn)就影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)韭菜遺傳轉(zhuǎn)化效率的主要因素包括愈傷組織大小、乙酰丁香酮（AS）濃度、菌液濃度和侵染時(shí)間及共培養(yǎng)時(shí)間等進(jìn)行研究，得到韭菜遺傳轉(zhuǎn)化的最佳因素，為今后的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 試驗(yàn)采用韭菜品種“漢中冬韭”，種子購于山西省侯馬市農(nóng)人種業(yè)有限公司。供試根癌農(nóng)桿菌菌株為EHA105，內(nèi)含pCAMBIA3301載體，該載體攜帶有選擇標(biāo)記Bar 基因和GUS報(bào)告基因。

1.1.2 培養(yǎng)基 本試驗(yàn)過程中所用的培養(yǎng)基，見表1。

表1 韭菜遺傳轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基

各種培養(yǎng)基配好后，在121℃高溫高壓滅菌20 min，其中AS、頭孢霉素（Cef）和草丁膦（PPT）在培養(yǎng)基滅菌后降溫到55℃時(shí)再加入。

1.2 方法

1.2.1 韭菜愈傷組織誘導(dǎo) 將韭菜種子沖洗干凈，

在75% 乙醇中消毒30 s，無菌水沖洗3-5次，再用含0.1 % 升汞和0.1 % Tween-20的混合溶液消毒10 min，無菌水沖洗3-5次，消毒后的種子放置在播種培養(yǎng)基中，黑暗環(huán)境生長2 d后，轉(zhuǎn)移到光照條件下培養(yǎng)。7 d左右，種子萌發(fā)生長獲得1 cm左右無菌胚根，切取胚根尖1.5-2 mm放置誘愈培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織用于轉(zhuǎn)化。

1.2.2 農(nóng)桿菌培養(yǎng)與活化 取30 μL EHA105原菌接種到30 mL LB（含50 mg/L卡那霉素和100 mg/L利福平）液體培養(yǎng)基中，在28℃ 200 r/min震蕩培養(yǎng)。16 h后，菌株處于對數(shù)生長期，此時(shí)活性最高，OD600值在1.2-1.5之間，5 000 r/min離心5 min。倒掉上清液，重新懸浮于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于200 r/min震蕩培養(yǎng)活化4 h即可用于轉(zhuǎn)化。

1.2.3 愈傷組織大小對轉(zhuǎn)化的影響 將分別培養(yǎng)10、20、30、40、60 d的愈傷組織（圖1-A）切成2 mm大小，在活化的菌液（OD600=0.6）中侵染10 min，用濾紙吸干多余的菌液，放置在共培養(yǎng)基中25℃黑暗培養(yǎng)3 d。之后將愈傷組織轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基中，選擇培養(yǎng)7 d后，隨機(jī)抽取20個(gè)愈傷外植體進(jìn)行GUS染色，檢測GUS基因的瞬時(shí)表達(dá)率。之后，2周轉(zhuǎn)接一次，培養(yǎng)30 d左右后，統(tǒng)計(jì)韭菜愈傷組織的再生率（圖1-B）。

圖1 愈傷組織及不定芽的分化

1.2.4 乙酰丁香酮濃度對轉(zhuǎn)化的影響 在誘導(dǎo)培養(yǎng)基和共培養(yǎng)中分別加入0、100、200 μmol/L的AS用于侵染和共培養(yǎng)，共9個(gè)試驗(yàn)組合。將愈傷組織在含不同濃度AS的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中侵染10 min，之后步驟及統(tǒng)計(jì)觀察同1.2.3。

1.2.5 農(nóng)桿菌菌液濃度對轉(zhuǎn)化的影響 將搖好的菌液重懸于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中活化后，將菌液OD600值分別調(diào)節(jié)到0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0，分別與40 d大小的愈傷組織（切成2 mm大?。┣秩?0 min，之后步驟及統(tǒng)計(jì)觀察同1.2.3。

1.2.6 農(nóng)桿菌侵染時(shí)間對轉(zhuǎn)化的影響 將40 d大小的愈傷組織切成2 mm的小塊，與OD600為0.6菌液分別侵染0、5、10、15、20 min，之后步驟及統(tǒng)計(jì)觀察同1.2.3。

1.2.7 共培養(yǎng)時(shí)間對轉(zhuǎn)化的影響 將40 d大小愈傷組織切成2 mm的小塊，與OD600為0.6菌液侵染10 min，分別共培養(yǎng)0、1、2、3、4、5 d，之后步驟及統(tǒng)計(jì)觀察同1.2.3。

1.2.8 愈傷組織的GUS染色 將愈傷組織浸沒于GUS染色液中，置于37℃恒溫箱中過夜，次日用70% 乙醇脫色，觀察GUS染色的效果。

2 結(jié)果

2.1 韭菜愈傷組織大小對遺傳轉(zhuǎn)化的影響

由韭菜胚根尖誘導(dǎo)不同時(shí)期愈傷組織的GUS染色效果（圖2）表明，愈傷培養(yǎng)10 d時(shí)，愈傷組織僅有很少面積呈現(xiàn)藍(lán)色；培養(yǎng)20 d時(shí)，愈傷的染色面積明顯增加；隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，愈傷經(jīng)過切割后，菌液侵染切面GUS染色的面積會(huì)更大。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明（表2），愈傷培養(yǎng)10 d時(shí)，GUS瞬時(shí)表達(dá)僅有55%；隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，GUS瞬時(shí)表達(dá)顯著提高；培養(yǎng)40 d時(shí)，GUS瞬時(shí)表達(dá)率達(dá)到93%；培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)一步延長，GUS瞬時(shí)表達(dá)率不再增加。

觀察植株轉(zhuǎn)化后的再生，培養(yǎng)10 d的愈傷經(jīng)侵染后褐化嚴(yán)重，逐漸死亡，僅有1.07%再生；培養(yǎng)20和30 d的愈傷侵染后，愈傷組織褐化減少，植株再生率分別達(dá)到3.13%和4.93%；當(dāng)愈傷培養(yǎng)40 d時(shí)，再生率達(dá)到最大為7.21%。培養(yǎng)60 d時(shí)，愈傷組織的褐化率較低，但愈傷分化不定芽反而下降。綜上所述，在韭菜遺傳轉(zhuǎn)化過程中，采用培養(yǎng)40 d的愈傷組織為最佳。

圖2 不同愈傷組織大小GUS染色的效果

表2 愈傷組織大小對轉(zhuǎn)化的影響

2.2 乙酰丁香酮對韭菜遺傳轉(zhuǎn)化的影響

不同乙酰丁香酮濃度下韭菜愈傷的GUS染色（表3）表明，當(dāng)誘導(dǎo)和共培養(yǎng)基中都不含AS時(shí)，愈傷染色面積小且顏色較淺，GUS染色率僅有32.5%；僅在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入AS時(shí)，當(dāng)AS為100 μmol/L時(shí)染色率為53.6%，當(dāng)AS為200 μmol/L時(shí)，染色率提高為72.9%，但顏色依然較淺；僅在共培養(yǎng)基中加入AS時(shí)，當(dāng)AS為100 μmol/L時(shí)染色率為66.2%，當(dāng)AS為200 μmol/L時(shí)，染色效果提高顯著為84.4%，且隨著濃度的升高顏色變深；當(dāng)誘導(dǎo)和共培養(yǎng)基中同時(shí)加入AS時(shí)，GUS染色率達(dá)到91%以上，愈傷組織的染色面積增大，且藍(lán)色很深。因此，從GUS染色的提高程度看，共培養(yǎng)基中添加AS對轉(zhuǎn)化的影響效果更高。

統(tǒng)計(jì)植株再生的結(jié)果（表3）表明，當(dāng)誘導(dǎo)和共培養(yǎng)基中都不含AS時(shí)，大部分愈傷組織選擇培養(yǎng)1周后嚴(yán)重褐化，再生率僅有0.4%；當(dāng)僅在誘導(dǎo)或共培養(yǎng)基中加入AS時(shí)，再生率都隨著AS的增加不斷地提高；當(dāng)誘導(dǎo)和共培養(yǎng)基中AS濃度為100 μmol/L時(shí)，植株再生率達(dá)到7.9%；濃度進(jìn)一步增加時(shí)，再生率達(dá)到8.0%左右與之前并沒有顯著增加。因此，在韭菜遺傳轉(zhuǎn)化中需要誘導(dǎo)和共培養(yǎng)基中同時(shí)加入100或200 μmol/L AS，考慮到成本，韭菜轉(zhuǎn)化中AS最佳濃度為100 μmol/L。

表3 乙酰丁香酮濃度對轉(zhuǎn)化的影響

2.3 菌液濃度對韭菜遺傳轉(zhuǎn)化的影響

不同菌液濃度侵染后韭菜愈傷GUS染色效果及百分率表明，當(dāng)菌液OD600為0.1時(shí)，組織染色面積小，顏色比較淺（圖3），GUS基因的瞬時(shí)表達(dá)率為44.0%（表4）；隨著菌液濃度的增加，染色位點(diǎn)越多，顏色也越深，菌液OD600為0.6時(shí)，GUS瞬時(shí)表達(dá)率達(dá)到90%；當(dāng)菌液OD600為0.8時(shí)，整個(gè)愈傷塊已完全染色，但是GUS基因的表達(dá)沒有顯著增加。

從韭菜愈傷再生方面，當(dāng)OD600為0.1時(shí)，愈傷的再生率僅有1.4%；當(dāng)OD600為0.6時(shí)，愈傷的分化達(dá)到7%，顯著的高于其他組合；濃度較低時(shí)，附著在愈傷表面的農(nóng)桿菌較少，基因未整合到植株體內(nèi)，在抗生素的作用下愈傷逐漸褐化死亡；菌液濃度過高時(shí)，附著在愈傷表面的菌液過多，不利除菌反而影響愈傷的再生效果。綜合各方面因素，OD600值為0.6是最適的菌液濃度。

表4 菌液濃度對韭菜轉(zhuǎn)化的影響

2.4 侵染時(shí)間對韭菜遺傳轉(zhuǎn)化的影響

不同侵染時(shí)間下愈傷的GUS染色效果（圖4）表明，未經(jīng)過侵染的愈傷染色后呈現(xiàn)白色，外植體無傷害，GUS瞬時(shí)表達(dá)率與再生率均為0；侵染5 min的組織呈現(xiàn)淺藍(lán)色，GUS瞬時(shí)表達(dá)率為53.2%（表5），愈傷有較少切口變褐，再生率為3.26%；侵染10 min的愈傷呈現(xiàn)深藍(lán)色，GUS表達(dá)率達(dá)到90%以上，有部分傷口變褐，組織再生率最高，達(dá)到5.92%；侵染15 min以上的愈傷顏色繼續(xù)增大，GUS瞬時(shí)表達(dá)率并沒有顯著增加，愈傷褐化嚴(yán)重，再生率反而減低；總之，隨侵染時(shí)間的增長，GUS基因瞬時(shí)表達(dá)率越高，但愈傷受菌液傷害的程度也越嚴(yán)重，再生就越困難。綜合上述分析，愈傷組織在菌液中侵染10 min為最佳。外植體受傷程度輕，GUS基因瞬時(shí)表達(dá)率很高，再生率也最高。

2.5 共培養(yǎng)時(shí)間對韭菜遺傳轉(zhuǎn)化的影響

圖3 不同菌液濃度下（OD600值）韭菜愈傷GUS染色的效果

不同共培養(yǎng)條件下愈傷組織的GUS染色（圖5）

表明，共培養(yǎng)0 d時(shí)，GUS基因在愈傷組織即有表達(dá)，但染色效果較淺，GUS瞬時(shí)表達(dá)率為40.9%（表6）；共培養(yǎng)3 d后，愈傷呈現(xiàn)深藍(lán)色，GUS表達(dá)率接近最高值達(dá)到91.1%；共培養(yǎng)時(shí)間再長時(shí)，愈傷藍(lán)色更深，GUS表達(dá)不再顯著增加。另外，共培養(yǎng)2 d內(nèi)，農(nóng)桿菌生長不明顯，愈傷分化率低；共培養(yǎng)3 d時(shí)，農(nóng)桿菌生長菌落依稀可見，但不超過外植體周圍，再生率達(dá)到7.2%；共培養(yǎng)4 d后，在外植體周圍出現(xiàn)少量菌落，而共培養(yǎng)5 d后，在外植體周圍出現(xiàn)大量菌落，植株再生率反而下降。綜合上述分析，共培養(yǎng)3 d后，農(nóng)桿菌菌落少，GUS瞬時(shí)表達(dá)率也較高，再生率最高，為轉(zhuǎn)化時(shí)共培養(yǎng)的最佳時(shí)間。

圖4 不同侵染時(shí)間下韭菜愈傷GUS染色效果

表5 侵染時(shí)間對韭菜轉(zhuǎn)化的影響

圖5 不同共培養(yǎng)時(shí)間下韭菜愈傷GUS染色效果

表6 共培養(yǎng)時(shí)間對韭菜轉(zhuǎn)化的影響

3 討論

3.1 愈傷組織培養(yǎng)時(shí)間對轉(zhuǎn)化的影響

愈傷組織的大小是影響轉(zhuǎn)化的重要因子，前人的研究表明應(yīng)用直接誘導(dǎo)的愈傷進(jìn)行轉(zhuǎn)化效率較低，而愈傷組織經(jīng)過多代培養(yǎng)后，可能產(chǎn)生體細(xì)胞突變且愈傷組織逐漸衰老死亡，不利于轉(zhuǎn)化體篩選，轉(zhuǎn)化效率反而大大降低，所以經(jīng)過適當(dāng)繼代培養(yǎng)，使細(xì)胞處于最佳轉(zhuǎn)化狀態(tài)來提高轉(zhuǎn)化效率［8］。鄭杰［9］在水稻的研究中發(fā)現(xiàn)表面光滑、質(zhì)地致密、粒形好的愈傷組織轉(zhuǎn)化率最高。羅敬萍等［10］用不同齡期的甘蔗愈傷組織進(jìn)行轉(zhuǎn)化，25 d的愈傷組織為適齡的轉(zhuǎn)化受體。楊愛國等［11］在玉米胚性愈傷的轉(zhuǎn)化中，采用不超過2.0 mm大小的幼胚誘導(dǎo)愈傷組織，經(jīng)過10-12周不斷繼代擴(kuò)繁得到干燥松散、有結(jié)構(gòu)、生長旺盛的愈傷組織進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。Aswath等［12］在洋蔥的遺傳轉(zhuǎn)化中，就采用6周大的愈傷分割成表面積為3 mm2的小塊進(jìn)行轉(zhuǎn)化。本試驗(yàn)研究表明韭菜胚根尖誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)40 d后，愈傷組織直徑達(dá)到5 mm，將其切為2 mm大小的轉(zhuǎn)化效果最佳。

3.2 乙酰丁香酮對轉(zhuǎn)化的影響

乙酰丁香酮是基因轉(zhuǎn)化中提高轉(zhuǎn)化頻率及基因

穩(wěn)定遺傳和表達(dá)的重要試劑。在眾多研究中，AS的濃度一般為50-00 μmol/L，濃度過高反而會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率或?qū)ν庵搀w產(chǎn)生毒害作用［13］。Joubert等［14］研究了AS對洋蔥轉(zhuǎn)化的影響，當(dāng)AS濃度為100 μmol/L時(shí)對轉(zhuǎn)化的促進(jìn)效果最高；而對洋蔥幼胚進(jìn)行轉(zhuǎn)化，AS濃度為250 μmol/L，組織GUS表達(dá)率為60%，濃度過高時(shí)表達(dá)率反而下降。邸宏等［15］對玉米幼胚的轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行優(yōu)化，得到AS的適宜濃度為200 μmol/L。但是趙軍良等［16］在酚類物質(zhì)對大白菜遺傳轉(zhuǎn)化的研究中表明，其中AS轉(zhuǎn)化的影響效果最佳且轉(zhuǎn)化率提高明顯，本試驗(yàn)的研究也表明了這一點(diǎn)。本試驗(yàn)在誘導(dǎo)和共培養(yǎng)基中同時(shí)加入100 或200 μmol/L時(shí)顯著性不差異，考慮AS的傷害作用和成本問題，AS的最佳濃度為100 μmol/L，與Joubert等的研究基本一致。

3.3 菌液濃度和侵染時(shí)間對轉(zhuǎn)化的影響

菌液濃度和侵染時(shí)間是影響遺傳轉(zhuǎn)化效率的重要因素。在蔥蒜類蔬菜的遺傳轉(zhuǎn)化中大多采用的菌液OD600為0.6左右，譚偉等［17］研究表明，當(dāng)菌液OD600為0.6時(shí)，大蔥愈傷組織的轉(zhuǎn)化率均值最大。Eady等［15］在韭菜和大蒜轉(zhuǎn)化時(shí)，OD500下的菌液濃度為0.5-1.0時(shí)效果最佳。對于侵染時(shí)間，通常為5-20 min。劉海燕等［19］對洋蔥表皮進(jìn)行轉(zhuǎn)化研究表明，菌液濃度OD600為0.6，侵染20 min時(shí)轉(zhuǎn)化率最高；孫傳波等［20］在玉米莖尖的轉(zhuǎn)化中表明，當(dāng)菌液OD600為0.5時(shí)，浸泡7 min后抗性芽的生成率最高。同時(shí)，張明洲等［21］等在高粱轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化中也表明，最佳的侵染時(shí)間和濃度為OD600為0.5侵染10 min，與本試驗(yàn)結(jié)果相一致。

3.4 共培養(yǎng)時(shí)間對轉(zhuǎn)化影響

農(nóng)桿菌共培養(yǎng)是農(nóng)桿菌進(jìn)入受體細(xì)胞并與其共生的過程，使細(xì)菌中的T-DNA轉(zhuǎn)入到受體細(xì)胞利于農(nóng)桿菌侵染受體。附著在外植體表面的農(nóng)桿菌并不能立刻轉(zhuǎn)化，而需要在組織停留一定時(shí)間。王沛雅等［22］的研究表明，當(dāng)農(nóng)桿菌與楊樹葉盤共培養(yǎng)4 d后，分化率可達(dá)80%并可獲得較多生長健壯的抗性再生芽。Kondo等［23］研究了共培養(yǎng)1-6 d對大蔥愈傷轉(zhuǎn)化的影響表明最佳時(shí)間為3 d。此外，王宏偉等［24］進(jìn)一步研究了共培養(yǎng)時(shí)間與溫度間的關(guān)系，溫度為25℃時(shí)共培養(yǎng)3 d，GUS 表達(dá)率最高；而溫度為22℃時(shí)共培養(yǎng)5 d，GUS 表達(dá)率也較高。本試驗(yàn)是在共培養(yǎng)溫度25℃前提下，得到的最佳的共培養(yǎng)時(shí)間為3 d，與王宏偉的研究結(jié)果一致，而對于共培養(yǎng)溫度和時(shí)間的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

韭菜愈傷組織培養(yǎng)時(shí)間40 d后，GUS基因瞬時(shí)表達(dá)率達(dá)到93%，且最適宜于不定芽的分化。侵染韭菜外植體的農(nóng)桿菌重懸液和共培養(yǎng)基中添加AS能大大提高GUS表達(dá)率和再生率，同時(shí)AS濃度為100 μmol/L時(shí)，愈傷的GUS表達(dá)率達(dá)到91%，植株再生率為7.9%，AS濃度增加時(shí)其值也不會(huì)增加。當(dāng)菌液OD600值為0.6侵染10 min后共培養(yǎng)3 d，外植體受傷程度小，農(nóng)桿菌生長較少且容易抑制，GUS表達(dá)率及再生率最高，為最佳的轉(zhuǎn)化。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Research on the Factors Related to Agrobacterium-mediated Genetic Transformation of the Chinese Chive

Chang Jing1Gao Xingying1Li Xiaodong2Hou Leiping1Li Meilan1
（1. College of Horticulture，Shanxi Agriculture University，Taigu 030801；2. Fangxing Modern Agriculture Co. Ltd, Changzhi 046600）

Using “Hanzhong Dongjiu” variety and the Agrobacterium EHA105 containing pCAMBIA3301 plasmid as the material, it studied the factors which could influence transformation efficiency of Chinese chive. The results showed that transient expression rate of GUS gene reached 93% with the callus cultured for 40 d as the explant and the adventitious buds differentiated well. When 100 μmol/L acetosyringone was added to the miedium, GUS expression rate of the callus reached 91% and the plant regeneration rate was 7.9%, but did not increase with increasing of the AS concentration. Compared with other combinations, the calli were soaked in Agrobacterium（OD600≈0.6）for 10 min, the injury degree of explants was slight and the GUS expression rate and regeneration rate were the highest. When the calli were co-cultured for 3 days after infection, the bacterium grew less than other period, GUS expression rate and the regeneration rate were 91.1% and 7.2% respectively. Through the experiment, the best conditions of genetic transformation factors for chinese chive were obtained.

Chinese chive Agrobacterium GUS staining Genetic transformation

2013-09-06

山西省農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項(xiàng)目（20090311022，0110311015-1），山西省人事廳人才引進(jìn)項(xiàng)目

常婧，女，碩士研究生，研究方向：蔬菜育種及生物技術(shù)；E-mail：412567956@qq.com

李梅蘭，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：蔬菜育種及生物技術(shù)；E-mail：limeilan_2@hotmail.com