響應(yīng)面分析法優(yōu)化乙酸乙酯萃取番茄紅素條件的研究

響應(yīng)面分析法優(yōu)化乙酸乙酯萃取番茄紅素條件的研究

沈海濤 王愛英 祝建波
（石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 石河子大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室，石河子 832003）

采用響應(yīng)面方法對番茄醬提取番茄紅素過程中的乙醇預(yù)處理方法、萃取劑萃取時間等工藝條件進行了優(yōu)化。采用Central Composite Design（CCD）設(shè)計法，對超聲波提取法和微波提取法中的乙醇預(yù)處理、萃取劑萃取時間、超聲波或微波萃取功率、溶劑量4個因素對番茄紅素提取率的影響進行評價。結(jié)果顯示，最佳提取方法為超聲波提取法，無水乙醇∶番茄醬的2.05∶1（V / W）；乙酸乙酯∶番茄醬10.1∶1（V / W）；提取時間為490 s；超聲波提取功率為405 W；提取率為94.42%。微波提取最佳方法為，無水乙醇∶番茄醬的2.11∶1（V / W）；乙酸乙酯∶番茄醬10.1∶1（V / W）；提取時間為372.6 s；微波提取功率為569.5 W；提取率為81.51%。

番茄醬 番茄紅素 微波處理 超聲波處理

番茄紅素是在自然界中發(fā)現(xiàn)的最重要的保健和藥用植物色素之一。它是植物在光合作用過程中合成的一類色素，廣泛存在于成熟的番茄、西瓜、粉紅色的葡萄柚、番石榴、木瓜等水果中［1，2］。

番茄紅素的分子結(jié)構(gòu)由11個共軛碳碳雙鍵長鏈組成，所以具有不同的幾何異構(gòu)體；在自然界中番茄紅素反式異構(gòu)體占據(jù)主導(dǎo)，而順式異構(gòu)體具有更強的生物活性［3，4］。在體外和體內(nèi)研究表明，番茄紅素具有降低多種慢性疾病發(fā)生的作用，包括某些癌癥、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病等［3］。正是由于番茄紅素諸多的保健功能，近年來國內(nèi)外市場對番茄紅素商業(yè)制品的需求也呈顯著上升趨勢，番茄紅素提取工藝也取得了長足的發(fā)展。目前，番茄紅素提取主要依賴于利用常規(guī)有機溶劑提取番茄紅素和

超臨界流體CO2萃?。⊿CFE）［5，6］。SCFE萃取方法具有一定優(yōu)勢，但設(shè)備和能源消耗非常高。超聲波和微波提取法，可縮短番茄紅素提取時間，提高提取效率［7-13］，并具有設(shè)備投入少和能源消耗少等特點［9］。

目前，番茄紅素的提取工藝研究主要以番茄皮為原料。雖然以番茄醬為原料普遍被認為是不經(jīng)濟的，但以番茄醬為原料的優(yōu)勢就是可以彌補季節(jié)性番茄或番茄皮原料的不足，以實現(xiàn)全年生產(chǎn)。然而，番茄醬含有大量的水和果膠，萃取劑難以滲入內(nèi)部，從而影響萃取效率。乙醇具有小分子脂溶性的特點性質(zhì)，易于穿過細胞膜，可代替番茄細胞中的水分，從而降低了番茄醬的水含量，提高番茄紅素的提取效率。

番茄紅素特殊的物理化學(xué)特性也是研究番茄紅素提取工藝需要考慮的重要因素。番茄紅素在水中的溶解度有限，選擇適當(dāng)?shù)娜軇┮殉蔀槟壳把芯康闹攸c［14，15］。萃取劑的選擇有兩個重要因素，即提取效率高，不會對人體健康產(chǎn)生危害，產(chǎn)生的廢渣易于處理。但是，大多數(shù)萃取效率高的溶劑為石油醚、氯仿等一系列有毒試劑［16］，會帶來食品安全風(fēng)險。乙酸乙酯是一種無毒的有機溶劑，廣泛應(yīng)用于食品醫(yī)藥等領(lǐng)域，而且里用乙酸乙酯萃取后的廢棄物可以用座肥料。番茄紅素易溶于乙酸乙酯，在乙酸乙酯中非常穩(wěn)定不易被氧化。有研究顯示用一種極微量的最不穩(wěn)定的異構(gòu)化番茄油樹脂13z番茄紅素溶解在乙酸乙酯中放置1周，通過回流技術(shù)仍能獲得番茄油樹脂。所以利用乙酸乙酯作為番茄紅素萃取劑不僅避免了食品安全的風(fēng)險，而且有機會獲得更高的番茄紅素提取效率［17］。

在本研究中通過響應(yīng)面分析法優(yōu)化微波處理和超聲處理法提取番茄紅素工藝中，乙醇預(yù)處理量、乙酸乙酯與番茄醬物料比、微波和超聲波工作功率和微波和超聲波處理時間等一系列參數(shù)的優(yōu)化，初步確立最佳提取條件，為下一步規(guī)模化生產(chǎn)奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

番茄醬，購自中基番茄制品有限公司；分析純乙酸乙酯，南京化學(xué)試劑有限公司；95%乙醇，無水乙醇、甲苯和甲醇（均為分析純），天津富宇精細化工有限公司；實驗用水均為雙蒸水；蘇丹紅I：純度97. 5%，購自Dr. Ehrenstorfer公司。

NN-5280型微波爐（松下公司），722型分光光度計（上海分析儀器廠），BS2000S型電子天平（德國賽多利斯），JY92-II超聲波細胞破碎儀（寧波新芝生物科技有限公司），101A-2型電熱恒溫干燥箱（上海實驗儀器總廠）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 精確稱取0.0256 g蘇丹紅I色素（純番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品極不穩(wěn)定，而蘇丹紅I色素穩(wěn)定，其乙醇溶液與番茄紅素抽提液的最大吸收波長近似，故用蘇丹紅Ⅰ代替純番茄紅素制作標(biāo)準(zhǔn)曲線）［18］，用少量無水乙醇，定量移入50 mL容量瓶，并用無水乙醇定容至刻度，搖勻。準(zhǔn)確吸取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液0.126、0.152、0.178、1.104、1.130 mL分別注入一組50 mL容量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度搖勻后即相當(dāng)于0.15、1.10、1.15、2.10、2.15 μg/mL番茄紅素的標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后，在番茄紅素抽提液的最大吸收波長下（485 nm），測定其吸光度值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程如下：y=0.165 1x-0.03 4，R2=0.996 8。

1.2.2 番茄紅素含量的測定 稱取0.1-0.2 g試樣，精確至0.000 2 g，于小燒杯中，用甲醇洗雜，甲苯定容至50 mL，采用分光光度計測定樣品在485 nm處的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算番茄紅素的含量，公式如下：

X=（5×N）/W

其中，X為試樣中番茄紅素的含量（mg/100 g），N：色素提取液中番茄紅素的濃度（mg/L），W：試樣質(zhì)量（g）。

1.2.3 番茄紅素提取率測定 向一定試樣中加入有機溶劑，提取，過濾，測其體積并精密量取2 mL 至小燒杯中，待溶劑揮干后用甲醇洗雜，并用甲苯定容至50 mL，測其吸光度值，計算提取液中番茄紅素的總量，按公式計算提取率。

提取率（%）=（Mn /M）×100%其中，Mn：提取液中番茄紅素總量（mg），M：原

料中番茄紅素總量（mg），番茄醬中番茄紅素總含量M為每克番茄醬含番茄紅素10.61 mg。

1.2.4 單因素試驗 使用響應(yīng)面法（RSM）之前進行預(yù)試驗，選擇相關(guān)變量的酚類抗氧化劑的恢復(fù)以及獨立因素的試驗范圍?；诳偟姆鸭t素含量的平均值，3個層次（上、中、下3個水平），每個設(shè)計變量（樣品預(yù)處理，微波輔助提取，超聲輔助提取，物料比和超聲輔助提取時間），每個處理重復(fù)3次，每個處理番茄醬樣品5 g。

1.2.4.1 樣品的預(yù)處理 分別加入無水乙醇：番茄醬（W/V）物料比1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5和不加無水乙醇6個處理，處理時間為均30 s，處理后樣本4℃存儲。利用料液比1∶1（W/V）乙酸乙酯，功率為620 W微波萃取法萃取處理樣本，萃取時間10 min，0.45 μm微孔真空過濾去除提取物，用722PC分光光度計485 nm下測定濃度。

1.2.4.2 微波提取功率 利用料液比為1∶2（W/V）無水乙醇預(yù)處理番茄醬，料液比1∶1（W/V）乙酸乙酯，松下nn-5280微波爐分別在500 W、560 W、620 W、680 W、740 W和800 W 六個不同功率下萃取，萃取時間10 min，0.45 μm微孔真空過濾去除提取物，分光光度計485 nm下測定濃度。

1.2.4.3 微波提取時間 利用料液比為1∶2（W/V）無水乙醇預(yù)處理番茄醬，料液比1∶1（W/V）乙酸乙酯，松下NN-5280微波爐620 W分別處理2、4、6、8、10和12 min，0.45 μm微孔真空過濾去除提取物，分光光度計485 nm下測定濃度。

1.2.4.4 超聲波提取功率 利用料液比為1∶2（W/V）無水乙醇預(yù)處理番茄醬，料液比1∶1（W/V）番茄醬：乙酸乙酯，jy92-ii超聲波儀分別在100 W、200 W、300 W、400 W和500 W五個不同功率下萃取，萃取時間10 min，0.45 μm微孔真空過濾去除提取物，分光光度計485 nm下測定濃度。

1.2.4.5 溶劑樣品比 利用料液比為1∶2（W/V）無水乙醇預(yù)處理番茄醬，番茄醬：乙酸乙酯的料液比分別為1∶5、1∶10、1∶20、1∶30和1∶40（W/V），jy92-ii超聲波儀300 W萃取，萃取時間10 min，0.45 μm微孔真空過濾去除提取物，分光光度計485 nm下測定濃度。

1.2.4.6 超聲波提取時間 利用料液比為1∶2（W/V）無水乙醇預(yù)處理番茄醬，料液比1∶1（W/V）番茄醬∶乙酸乙酯，jy92-ii超聲波儀300 W萃取，萃取時間分別為2 min 、4 min 、6 min、8 min 和10 min，0.45 μm微孔真空過濾去除提取物，分光光度計485 nm下測定濃度。

1.2.4.7 響應(yīng)面法優(yōu)化法 響應(yīng)面法（RSM）分析使用軟件Design- Expert 8.05 利用5水平四因素中心組合設(shè)計（CCRD）檢驗分析利用乙醇預(yù)處理樣品后，以乙酸乙酯為溶劑，通過微波和超聲波兩種不同方法從番茄醬中提取番茄紅素的優(yōu)化組合。

2 結(jié)果

2.1 單因素試驗

由圖1和圖5所示，無水乙醇和番茄醬料液比由0至5倍（W/V）時，乙酸乙酯和番茄醬料液比由5至40倍（W/V）時，提取效率先極具上升至一定水平時緩慢下降。說明乙醇脫水預(yù)處理對于提高番茄紅素萃取效率是非常有效的。無水乙醇∶番茄醬為1∶2比較合適。乙酸乙酯∶番茄醬為1∶10具較好的提取效率。

如圖2和圖4所示，微波功率和超聲功率對番茄醬番茄紅素提取的影響。在微波功率560 W、超聲波功率為400 W提取番茄紅素時效率最高。高功率可能會因溫度過高導(dǎo)致大量番茄紅素的損失。如圖中所示，當(dāng)處理功率高于這兩個功率時提取效率隨功率的增加而降低。

圖3和圖6給顯示微波法及超聲波法提取時間對提取效率的影響。微波萃取番茄紅素的產(chǎn)量最高值出現(xiàn)在處理時間為6 min左右，提取率為75%，處理時間至8 min時開始急劇下降。超聲提取時間為8 min，提取率為80%。在提取過程中，兩種方法提取效率當(dāng)達到最高值后，提取率隨著提取時間的增加而降低，提取番茄紅素的效率也會降低。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化分析

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，超聲波和微波兩種不同的提取方法分別利用CCRD的中心組合設(shè)計原理，選取提取時間、固液比、乙醇體積分數(shù)和提取功率4個因素，分別以X1、X2、X3 和X4表示。每個自變量的低中高水平分別以-2、-1、0、1、2 進行編碼，以番茄紅素為響應(yīng)值（Y），設(shè)計4因素五水平

表如表1。微波輔助提取和超聲波輔助提取番茄紅素CCRD試驗結(jié)果（表2）。

圖1 乙醇預(yù)處理對提取效率影響

圖2 不同功率微波對提取效率影響

圖3 微波處理時間對提取效率影響

圖4 不同功率超聲波對提取效率影響

圖5 溶劑量對提取效率影響

圖6 超聲波處理時間對提取效率影響

表1 四因素五水平表

30個試驗點分為析因點和零點，試驗號1-24是析因試驗，試驗號25-30是中心試驗。其中析因

點為自變量取值在X1，X2，X3 所構(gòu)成的三維頂點，零點為區(qū)域的中心點，零點試驗重復(fù)6次，用以估計試驗誤差。

表2 CCRD設(shè)計方案

2.3 超聲波法提取番茄紅素方法優(yōu)化

根據(jù)各因素經(jīng)回歸擬合后，得番茄紅素含量對選取提取時間、固液比、乙醇體積分數(shù)和提取功率的二次多項回歸方程為：

R1=93.87683+0.96604X1+1.79379X2+1.62571X3+ 2.70146X4-1.33781X1X2+0.065562X1X3-1.43869X1X4+ 0.028063X2X3+0.11206X2X4- 0.56531X3X4-2.34851X12-3.21689X22-4.80139X32-3.04001X42

R2=0.9691

模型的可靠性可從方差分析及相關(guān)系數(shù)來分析。由方差分析（表3）可知，模型在P＜0. 01 時水平顯著，表明試驗設(shè)計可靠。相關(guān)系數(shù)（R2）越接近1，說明模型的預(yù)測值與試驗值的相關(guān)性越好。本研究的R2=0.9691說明模型能夠較好地描述試驗結(jié)果。

從表3可知，一次項中X2、X4；平方項中X2*X2、X4*X4為顯著性影響因素。在各影響因素中，番茄醬與萃取劑乙酸乙酯固液比（X2）和超聲波提取功率（X4）的影響因素最大。在總的作用因素中，1次項和平方項的影響較大，而交互項影響相對較小。X2和X4的變化比另外兩個變量對超聲波萃取法提取效率影響更大。利用超聲波法提取番茄紅素，

提取效率達到最大值后隨提取時間的增加提取效率會逐漸降低如圖7和圖12。根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化分析結(jié)果顯示，超聲波提取番茄紅素最優(yōu)方法為萃取時間490 s，固液比1∶10.1，番茄醬與乙醇固液比1∶2.05和超聲波功率405 W。參照這個條件進行試驗，提取效率達94.32%，與利用公式計算所得預(yù)測結(jié)果94.42%相近，得出相應(yīng)的曲面圖見圖7-12。

表3 超聲波提取法回歸系數(shù)取值及分布結(jié)果

圖7 提取功率與乙醇預(yù)處理用量對番茄紅素提取效率影響曲面圖

圖8 提取功率與乙酸乙酯萃取量對番茄紅素提取效率影響曲面圖

2.4 微波法提取番茄紅素方法優(yōu)化

根據(jù)各因素經(jīng)回歸擬合后，得各變量的二次多項回歸方程為：

Y（%）=81.37367+0.42683X1+0.38517X2+ 0.62183X3+0.36800X4-0.20525X1X2-0.059250X1X3-0.080750X1X4-0.2 3587X2X3+0.21487X2X4-0.44338X3X4-0.9727X12-0.85908X22-0.97158X32-1.78258X42

R2=0.9215

公式中相關(guān)系數(shù)（R2）值為0.9215說明預(yù)測

值與實驗值的相關(guān)性較好，模型能夠很好地描述實驗結(jié)果。一次項中X1、X3和X4；平方項中X1*X1、X3*X3和X4*X4為顯著性影響因素。在各影響因素中，番茄醬與乙醇固液比（X2），萃取時間（X3）和提取功率（X4）的影響因素最大。在各個作用因素中，1次項和平方項的影響較大，而交互項影響相對較?。ū?）。利用微波提取法X2、X3和X4對提取效率影響較大。

圖9 提取時間與乙醇預(yù)處理體積對番茄紅素提取效率影響曲面圖

圖10 乙酸乙酯用量與乙醇預(yù)處理體積對番茄紅素提取效率影響曲面圖

圖11 提取功率與提取時間對番茄紅素提取效率影響曲面圖

圖12 乙酸乙酯用量與提取時間對番茄紅素提取效率影響曲面圖

根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化分析結(jié)果顯示微波提取番茄紅素最優(yōu)方法為萃取時間372.6 s，固液比1∶10.1，番茄醬與乙醇固液比1∶2.11和微波功率569.5 W。參照這個條件與利用公式（2）計算所得預(yù)測結(jié)果81.51，得出相應(yīng)的曲面圖見圖13-18。

3 討論

目前，國內(nèi)外利用超聲波和微波處理提取番茄紅素的方法進行了大量研究。但是，番茄紅素的提取方法多以番茄皮和新鮮番茄為原料，單獨分析以乙醇預(yù)處理、乙酸乙酯萃取、超聲波或微波法等因素做單一分析。結(jié)合這幾種方法對其工藝的研究相對較少。本研究利用響應(yīng)面分析法綜合分析優(yōu)化乙醇原料進行脫水預(yù)處理、以乙酸乙酯使用量、聲波或微波法的處理功率及時間等因素，建立一套高效的從番茄醬中提取番茄紅素工藝。

根據(jù)單因素試驗結(jié)果顯示：乙醇、乙酸乙酯、微波提取功率、超聲波提取功率、微波提取時間和超聲波提取時間的變化趨勢相似，提取效率先升高然后下降。乙醇的加入使番茄醬中的細胞脫水，有利于進一步有機溶劑萃取番茄紅素。由于在增加提取過程中乙醇的加入量增加過導(dǎo)致番茄紅素的損失也隨之增大，當(dāng)損失率超過提取率時，提取效率開

始下降［19］。番茄醬：乙酸乙酯固液比為1∶10后提取效率基本達到平衡，1∶10說明這個比例為最優(yōu)比例。微波和超聲波處理在一定范圍內(nèi)能有效提高提取效率，微波提取功率和超聲波提取功率的功率增加時會產(chǎn)生相應(yīng)的熱量，功率越大熱量產(chǎn)生的越多，番茄紅素在加熱過程中分解量會增加，當(dāng)提取量少于分解量時提取效率開始降低。微波提取法會加速目標(biāo)化合物從基質(zhì)的吸附和解吸的提取過程，但其缺點是加熱不均勻［11］。番茄紅素在長時間超聲波作用下可能發(fā)生分解變性［20］。但在相同時間內(nèi)，超聲波提取法提取效率遠高于微波提取法，可能超聲破碎細胞效率比微波更徹底。

表4 微波提取法回歸系數(shù)取值及分布結(jié)果

圖13 提取功率與乙酸乙酯用量對番茄紅素提取效率影響曲面圖

圖14 乙醇預(yù)處理體積與乙酸乙酯用量對番茄紅素提取效率影響曲面圖

圖15 提取功率與提取時間對番茄紅素提取效率影響曲面圖

圖16 乙醇預(yù)處理體積與提取時間對番茄紅素提取效率影響曲面圖

圖17 乙酸乙酯用量與提取時間對番茄紅素提取效率影響曲面圖

4 結(jié)論

圖18 提取功率與乙醇預(yù)處理體積對番茄紅素提取效率影響曲面圖

超聲波法提取效率明顯高于微波提取法。利用乙醇脫水的番茄醬，在相同條件下微波提取法和超聲波提取法均比張連富［21］試驗方法提取效率高5%。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Research on the Method of Extraction of Lycopeneprepared by Optimizated Ethanol Using Response Surface Analysis

Shen Haitao Wang Aiying Zhu Jianbo
（College of Life Sciences of Shihezi University；Key Agriculture Biotechnology of Shihezi University，Shihezi 832003）

To research the methond of extraction of lycopene repared by optimizated ethanol using response analysis. The effects of ethanol pretreatment, extracting solvent, microwave assisted extraction and ultrasonic assisted extraction, were evaluated by using a central composite rotatable design. Using the dehydration processing tomato sauce can obviously improve the extraction efficiency of Lycopene. Then, the central composite design and response surface analysis were used to determine the optimal levels of the main factors. The optimal extracting conditions and lycopene yields of ultrasound assisted extraction technology were described as follows：the extraction time, 490 s；the ratio of solvent to tomato sauce, 10.1：1（V/W）；the ratio of anhydrous ethanol to tomato sauce, 2.05：1（V/W）；extraction power, 405 W；lycopene yields, 94.42%. The optimal extracting conditions and lycopene yields of microwave assisted extraction technology were described as follows：the extraction time, 372.6 s；the ratio of solvent to tomato sauce, 10.1：1（V/W）；the ratio of ethanol to tomato sauce, 2.11：1（V/W）；extraction power, 569.5 W；lycopene yields, 81.51%. Results showed that pretreated by ethanol, power, extracting time and extracting solvent were the main affecting factors.

Tomato sauce Lycopene Microwave treatment Ultrasonic treatment

2013-09-06

轉(zhuǎn)基因動植物新品種國家重大專項（2011zx08011-002），石河子大學(xué)科學(xué)技術(shù)研究發(fā)展計劃（2012ZRKXYQ-YD15）

沈海濤，男，碩士，助理研究員，研究方向：植物基因工程；E-mail：ghost521@126.com

祝建波，研究員，研究方向：植物基因工程；E-mail：274831213@qq.com