利用發(fā)酵法生產(chǎn)氨基葡萄糖的研究進(jìn)展

利用發(fā)酵法生產(chǎn)氨基葡萄糖的研究進(jìn)展

王升 李丕武 劉佃磊 李以明 林晶晶
（齊魯工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 山東省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250353）

氨基葡萄糖（GlcN）是一種重要的氨基己糖。它由葡萄糖的一個(gè)羥基被氨基取代形成，能夠有效作用于軟骨組織治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，并被視為天然無(wú)害的食品及保健品配料，市場(chǎng)應(yīng)用前景廣闊。目前，生產(chǎn)GlcN的方法主要有酸水解法、酶解法及微生物發(fā)酵法。由于酸水解法及酶解法生產(chǎn)GlcN會(huì)對(duì)環(huán)境造成不利影響及生產(chǎn)效率低等原因，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)GlcN得到了越來(lái)越多研究者的關(guān)注。對(duì)微生物代謝產(chǎn)GlcN的合成途徑、霉菌發(fā)酵產(chǎn)GlcN及工程菌發(fā)酵產(chǎn)GlcN等方面進(jìn)行了概述，并對(duì)微生物發(fā)酵法生產(chǎn)GlcN的研究方向進(jìn)行了展望。

氨基葡萄糖 合成途徑 微生物發(fā)酵

氨基葡萄糖（2-amino-2-deoxy-D-glucose，GlcN）是一種重要的氨基己糖，由葡萄糖的一個(gè)羥基被氨基取代形成，分子式為C6H13O5N，易溶于水及親水性溶劑。GlcN廣泛存在于真菌細(xì)胞壁及蝦蟹的外骨骼中，是甲殼素與殼聚糖的組成成分［1］。在自然界中，細(xì)菌、酵母、真菌、植物及動(dòng)物體內(nèi)也廣泛存在GlcN［2，3］。GlcN也是糖蛋白和蛋白聚糖的主要成分，在人與動(dòng)物的關(guān)節(jié)軟骨組織中起著重要作用［4］，并大量存在于人類(lèi)眼睛晶狀體中［5，6］。早在20個(gè)世紀(jì)60年代，GlcN就已被大量用于骨關(guān)節(jié)炎的治療。研究表明，它能夠有效作用于軟骨組織治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎［7，8］，其次對(duì)白血病癌細(xì)胞具有抑制作用，并有消炎護(hù)肝的功效［9，10］。GlcN在食品保健領(lǐng)域也有著廣泛的應(yīng)用，在一些歐美國(guó)家GlcN被視為天然無(wú)害的食品及保健品配料而得到大量推廣，而目前國(guó)內(nèi)相關(guān)產(chǎn)品較少［7］。目前，生產(chǎn)GlcN的方法主要有3種，即酸水解法、酶解法［11，12］及微生物發(fā)酵法。前兩種方法的生產(chǎn)原料基本上來(lái)源于蝦蟹的外骨骼，即從蝦蟹殼中提取甲殼素與殼聚糖，再經(jīng)酸解或酶解獲得GlcN。高濃度的鹽酸在一定的反應(yīng)條件下能夠?qū)⑽r蟹殼中的甲殼素與殼聚糖降解為GlcN，但由于濃鹽酸的大量使用會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題，將逐步受到國(guó)家相關(guān)政策的限制；酶解法是利用殼聚糖酶對(duì)蝦蟹殼進(jìn)行降解，現(xiàn)在面臨的最大問(wèn)題是生產(chǎn)

效率低下，表現(xiàn)為殼聚糖酶價(jià)格較高、轉(zhuǎn)化時(shí)間較長(zhǎng)及生產(chǎn)成本較高。且來(lái)源于蝦蟹殼的GlcN在臨床應(yīng)用過(guò)程中會(huì)引起過(guò)敏體質(zhì)患者的過(guò)敏反應(yīng)［13］。所以微生物發(fā)酵法生產(chǎn)GlcN得到了越來(lái)越多研究者的關(guān)注。相較于酸水解法與酶解法，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)GlcN具有以下優(yōu)點(diǎn)：消除了地域季節(jié)對(duì)原料來(lái)源的限制，產(chǎn)品無(wú)魚(yú)腥味；生產(chǎn)周期短，強(qiáng)度高；對(duì)環(huán)境污染較??；不產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)［14］。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)微生物發(fā)酵法生產(chǎn)GlcN的研究相對(duì)較少，相關(guān)產(chǎn)業(yè)尚未形成工業(yè)化生產(chǎn)規(guī)模。所以，著重對(duì)微生物代謝產(chǎn)GlcN的合成途徑、霉菌發(fā)酵產(chǎn)GlcN及工程菌發(fā)酵產(chǎn)GlcN等方面進(jìn)行了概述，并對(duì)微生物發(fā)酵法生產(chǎn)GlcN的研究方向進(jìn)行了展望，以期對(duì)相關(guān)研究起到積極的推動(dòng)作用。

1 GlcN生物合成途徑

圖1 氨基葡萄糖生物合成途徑

在生物體內(nèi)GlcN通過(guò)氨基己糖途徑（圖1）合成，此途徑起始于糖酵解產(chǎn)生的Fru6P。Fru6P在磷酸氨基葡萄糖合成酶，也稱(chēng)為谷氨酰胺磷酸果糖氨基轉(zhuǎn)移酶（Glutamine fructose-6P amidotransferase，GAT）作用下轉(zhuǎn)化為GlcN6P［15］。對(duì)于細(xì)菌與真菌，磷酸氨基葡萄糖合成酶為重要的限速酶分別由glmS與gfa1編碼。磷酸氨基葡萄糖合成酶位于氨基糖生物合成的起始位置，控制著氨基糖生物合成途徑，所以有必要對(duì)磷酸氨基葡萄糖合成酶進(jìn)行深入研究［15，16］。對(duì)大腸桿菌（Escherichia coli）與假絲酵母（Candida albicans）的研究表明，磷酸氨基葡萄糖合成酶是L-谷氨酰胺依賴(lài)性氨基轉(zhuǎn)移酶（L-glutamine-dependent amidotransferases，GATs）家族的一員。GATs催化L-谷氨酰胺上的氨基氮轉(zhuǎn)移到相應(yīng)受體上［15］。對(duì)融合酶進(jìn)行的生物化學(xué)以及X-射線晶體衍射分析進(jìn)一步揭示了GATs的生物化學(xué)特性及物理特性［15］。磷酸氨基葡萄糖合成酶催化過(guò)

程中，通過(guò)酶上的微小通道將L-谷氨酰胺上的氨基轉(zhuǎn)移至Fru6P［17］，且獲得的催化過(guò)程中結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)，為闡明磷酸氨基葡萄糖合成酶的催化過(guò)程奠定了理論基礎(chǔ)［17］。GlcN6P可在磷酸氨基葡萄糖脫氨酶催化下轉(zhuǎn)化為Fru6P，此步是生物體利用氨基糖作為碳源的最重要途徑，即當(dāng)胞內(nèi)的GlcN6P含量過(guò)高時(shí)，會(huì)有過(guò)量Fru6P生成進(jìn)入糖酵解途徑［18］。磷酸氨基葡萄糖合成酶催化的反應(yīng)是將Fru6P轉(zhuǎn)化為GlcN6P，L-谷氨酰胺作為氨基氮的供體，而磷酸氨基葡萄糖脫氨酶與磷酸氨基葡萄糖合成酶的催化反應(yīng)方向相反，它催化GlcN6P轉(zhuǎn)化為Fru6P與氨基［19］。磷酸氨基葡萄糖脫氨酶序列的分析表明磷酸氨基葡萄糖脫氨酶是3個(gè)簇組成的超家族蛋白，具有一定的多樣性與復(fù)雜性［20］。而相關(guān)研究報(bào)道了對(duì)來(lái)源于枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的磷酸氨基葡萄糖脫氨酶進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)及動(dòng)力學(xué)分析的研究，則揭示了磷酸氨基葡萄糖脫氨酶的物理化學(xué)性質(zhì)［21］。GATs催化生成的GlcN6P在下游兩種酶的作用下生成GlcNAc1P后，1-磷酸乙酰尿苷轉(zhuǎn)移酶催化GlcNAc1P生成UDP-GlcNAc。UDP-GlcNAc可形成細(xì)菌細(xì)胞壁的肽聚糖，革蘭氏陰性菌的脂多糖以及真菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)［15］。對(duì)于細(xì)菌與真菌，GlcN生物合成途徑的不同之處在于上述兩種酶的差異。細(xì)菌中為避免生成的GlcN6P轉(zhuǎn)化為Fru6P以及GlcN6P自身對(duì)細(xì)胞的毒害作用，在磷酸氨基葡萄糖變位酶［22］的作用下GlcN6P被轉(zhuǎn)化為GlcN1P。GlcN1P又在磷酸氨基葡萄糖?；D(zhuǎn)移酶催化下生成GlcNAc1P。GlcNAc1P對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害作用，則消除了對(duì)細(xì)胞的不利影響［23］。因此，磷酸氨基葡萄糖變位酶是細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)合成UDP-GlcNAc的關(guān)鍵酶［24，25］。研究表明，磷酸氨基葡萄糖變位酶的編碼基因發(fā)生突變將影響細(xì)菌細(xì)胞的正常生長(zhǎng)，形態(tài)學(xué)特征以及對(duì)青霉素的敏感性［25］。目前，對(duì)來(lái)源于大腸桿菌、綠膿假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等的磷酸氨基葡萄糖變位酶進(jìn)行的研究進(jìn)一步表明，將磷酸氨基葡萄糖變位酶編碼基因敲除后，細(xì)胞毒性會(huì)降低，對(duì)抗生素的相容性增加。而在真菌細(xì)胞內(nèi)，GlcN6P依次在6-磷酸氨基葡萄糖乙酰轉(zhuǎn)移酶與磷酸乙酰氨基葡萄糖變位酶催化下最終也轉(zhuǎn)化為GlcNAc1P［26］。據(jù)研究報(bào)道，在細(xì)胞膜上還存在控制磷酸化GlcN及乙?；疓lcN進(jìn)出細(xì)胞的載體蛋白，若能夠通過(guò)基因工程手段，控制此載體蛋白的運(yùn)載功能，則對(duì)于提高發(fā)酵法生產(chǎn)的GlcN在胞外的累積量至關(guān)重要［15］。GlcN的代謝過(guò)程是多種酶參與的催化過(guò)程。如何有效控制代謝過(guò)程中的酶，是微生物代謝工程研究的重要內(nèi)容，所以利用多基因表達(dá)的控制策略進(jìn)行微生物代謝產(chǎn)GlcN的研究將對(duì)發(fā)酵法生產(chǎn)GlcN起到積極的推動(dòng)作用［27］。在構(gòu)建高產(chǎn)GlcN工程菌過(guò)程中，對(duì)關(guān)鍵酶基因進(jìn)行過(guò)量表達(dá)或?qū)σ种苹蜻M(jìn)行失活處理，將有可能提高目的產(chǎn)物的量。

圖2 磷酸氨基葡萄糖合酶、磷酸氨基葡萄糖脫胺酶 及磷酸氨基葡萄糖變位酶的催化反應(yīng)

2 霉菌發(fā)酵產(chǎn)GlcN

用于GlcN發(fā)酵研究的霉菌包括根霉、毛霉及曲霉。霉菌是真菌的一個(gè)大類(lèi)，霉菌細(xì)胞壁中的幾丁質(zhì)含量相對(duì)較高，因而霉菌成為GlcN研究的重要菌種。據(jù)相關(guān)報(bào)道，野生型的毛霉（Monascus pilosus）發(fā)酵產(chǎn)GlcN的量只有264 mg/L［1］。但由于運(yùn)用野生型菌株進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)具有穩(wěn)定性好，發(fā)酵條件易控制等優(yōu)勢(shì)，使得霉菌發(fā)酵產(chǎn)GlcN的研究得到重視。研究表明曲霉（Aspergillussp.BCRC31742）、毛霉（Monascus pilosusBCRC31527）及根霉（Rhizopus oligosorusBCRC 31996）產(chǎn)GlcN的能力逐步遞減，對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化后Aspergillussp.BCRC31742產(chǎn)GlcN的量可達(dá)到3.43 g/L［1］。所以Aspergillussp.BCRC31742被廣泛用作發(fā)酵產(chǎn)GlcN的原始菌株。在霉菌發(fā)酵過(guò)程中，由于菌絲球會(huì)使發(fā)酵液黏度增大，攪拌速度與溶氧率就變得至關(guān)重要，因其直接影響氧的傳遞及發(fā)酵產(chǎn)物的量［28，29］。Zhang等［28］以Aspergillussp.BCRC31742為發(fā)酵菌株，研究了溶氧對(duì)GlcN產(chǎn)量的影響。通過(guò)對(duì)不同溶氧條件下產(chǎn)

GlcN的動(dòng)力學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)通過(guò)二級(jí)溶氧控制，可有效提高GlcN的產(chǎn)量。不但溶氧能夠影響發(fā)酵產(chǎn)物的水平，發(fā)酵時(shí)菌絲體形態(tài)及刺激因子也會(huì)對(duì)發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)生較大影響。相關(guān)研究通過(guò)對(duì)Aspergillussp.BCRC31742菌株進(jìn)行產(chǎn)GlcN深層發(fā)酵，控制霉菌菌絲球的大小與刺激因子的種類(lèi)提高了GlcN的產(chǎn)量，在菌絲球直徑為2.15 mm，50 mL裝液量（250 mL發(fā)酵搖瓶），30℃，200 r/min.，pH7.0 條件下發(fā)酵5天，最高生物量達(dá)到33.82 g/L，GlcN的濃度達(dá)到7.05 g/L［30］。并發(fā)現(xiàn)甲醇相對(duì)于谷氨酸、放線菌酮及乙醇對(duì)GlcN的產(chǎn)量具有明顯的提升作用，當(dāng)甲醇的添加量為1.5%（V/V）時(shí)，GlcN的最大濃度達(dá)到7.48 g/L［30］。在提取工藝方面，利用霉菌發(fā)酵產(chǎn)GlcN的提取過(guò)程是對(duì)霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的含有大量幾丁質(zhì)的菌絲體進(jìn)行酸堿降解，獲得游離的GlcN，所以此過(guò)程的關(guān)鍵是控制好酸水解過(guò)程［31］（圖3）。但在菌絲體處理過(guò)程中，涉及到酸與堿的使用，酸與堿的過(guò)量使用會(huì)對(duì)環(huán)境造成不利影響。使用幾丁質(zhì)酶代替酸堿處理成為越來(lái)越迫切的需要。表1列出了近些年霉菌發(fā)酵產(chǎn)GlcN研究的部分成果。Aspergillussp.BCRC31742作為重要的產(chǎn)GlcN菌株，隨著研究的深入，有望成為高產(chǎn)GlcN的優(yōu)良工業(yè)菌株。

圖3 霉菌發(fā)酵產(chǎn)GlcN的菌絲體處理流程

表1 霉菌發(fā)酵產(chǎn)GlcN的研究

3 大腸桿菌高產(chǎn)GlcN工程菌的構(gòu)建及發(fā)酵

就目前發(fā)酵法生產(chǎn)GlcN的研究狀況來(lái)看，工程菌發(fā)酵在產(chǎn)量上相對(duì)于野生菌具有明顯優(yōu)勢(shì)。研究者已對(duì)大腸桿菌進(jìn)行了構(gòu)建工程菌研究，并對(duì)大腸桿菌中氨基糖代謝途徑、代謝過(guò)程中涉及的酶及對(duì)應(yīng)的編碼基因進(jìn)行了深入研究［26］（圖4）。

圖4 大腸桿菌中GlcN的代謝途徑

通過(guò)對(duì)大腸桿菌氨基己糖代謝途徑進(jìn)行修飾，即對(duì)酶的編碼基因進(jìn)行過(guò)量表達(dá)、失活或敲除處理，構(gòu)建高產(chǎn)GlcN的工程菌，可以有效提高GlcN的產(chǎn)量。由于GlcN6P強(qiáng)烈抑制glmS的活性，且若在胞內(nèi)大量積累則對(duì)細(xì)胞有毒害作用，而GlcNAc的性質(zhì)較穩(wěn)定，對(duì)代謝過(guò)程無(wú)抑制作用，在酸性條件下可水解為GlcN，所以在胞內(nèi)過(guò)量表達(dá)GNA1，使GlcNAc大量積累，再對(duì)GlcNAc進(jìn)行酸水解處理，即可獲得GlcN。Deng等［26］通過(guò)過(guò)量表達(dá)glmS及對(duì)分解代謝基因nagB進(jìn)行失活處理將GlcN的產(chǎn)量提高到17 g/L，并研究了釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的GNA1在大腸桿菌中的過(guò)量表達(dá)，使GlcNAc產(chǎn)量達(dá)到110 g/L以上。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)GlcN與 GlcNAc從胞外向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)依靠的是甘露糖磷酸轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（IIMan，mannose transporter），由manXYZ操縱子編碼。manXYZ操縱子由 X、Y和Z 三個(gè)基因構(gòu)成，其中manX的缺失對(duì)甘露糖特異性磷酸轉(zhuǎn)移復(fù)合酶活性影響較大。如果將manX從基因組中敲除可阻斷GlcN與 GlcNAc從胞外向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，提高GlcN與 GlcNAc在胞外的積累量［15，26］。國(guó)內(nèi)江南大學(xué)的陳欣等［14］將glmS與GNA1導(dǎo)入大腸桿菌過(guò)量表達(dá)，獲得了一株高產(chǎn)GlcN及GlcNAc工程菌，并運(yùn)用Red同源重組技術(shù)敲除nagE與manX，研究其對(duì)發(fā)酵產(chǎn)GlcN的影響。nagE與manX雙基因敲除菌株培養(yǎng)10 h后，GlcN 產(chǎn)量達(dá)到最大值 4.82 g/L，GlcNAc 產(chǎn)量達(dá)到最大值 118.78 g/L。這表明nagE與manX基因的敲除可顯著降低 GlcN與GlcNAc 向胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)，提高GlcN與GlcNAc在胞外的量積量［14］。在提取工藝方面，利用工程菌發(fā)酵生產(chǎn)GlcN的提取方法與霉菌發(fā)酵的提取方法的區(qū)別在于工程菌發(fā)酵產(chǎn)生的GlcN與GlcNAc存在于發(fā)酵液中。利用離子交換法從發(fā)酵液中提取GlcN被認(rèn)為是較理想的方法［36，37］。表2概括

了近幾年國(guó)內(nèi)外工程菌發(fā)酵產(chǎn)GlcN的研究狀況，相信隨著研究的深入，GlcN的產(chǎn)量還將得到大幅提高。

表2 工程菌發(fā)酵產(chǎn)GlcN的研究*

4 展望

目前，發(fā)酵法產(chǎn)GlcN的研究集中在霉菌發(fā)酵與重組大腸桿菌研究上，已對(duì)Aspergillussp.BCRC31742菌株發(fā)酵產(chǎn)GlcN進(jìn)行了深入的研究，并且國(guó)內(nèi)外已構(gòu)建成功了幾株高產(chǎn)GlcN的大腸桿菌工程菌。筆者認(rèn)為今后的研究重點(diǎn)主要有以下幾個(gè)方面，第一，有效利用現(xiàn)有的Aspergillussp.BCRC31742菌株進(jìn)行微生物代謝工程研究，如利用基因工程技術(shù)對(duì)菌種代謝過(guò)程進(jìn)行控制，將釀酒酵母中的GFA1整合到Aspergillussp.BCRC31742的基因組中，從而有效提高GlcN的產(chǎn)量。第二，對(duì)Aspergillussp.BCRC31742菌株進(jìn)行誘變研究，以HNO2-UV與UV-5BU復(fù)合處理，篩選出優(yōu)良的適合工業(yè)生產(chǎn)的GlcN產(chǎn)生菌。第三，現(xiàn)有的大腸桿菌工程菌在GlcN的產(chǎn)量上表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢(shì)，有必要加大對(duì)大腸桿菌基因工程菌的研究，如在原有高產(chǎn)GlcN工程菌內(nèi)過(guò)量表達(dá)磷酸葡萄糖異構(gòu)酶，催化糖酵解途徑中的Glc6P大量轉(zhuǎn)化為Fru6P，使過(guò)量的Fru6P流入GlcN合成途徑，進(jìn)一步提高GlcN的產(chǎn)量。但大腸桿菌不是公認(rèn)的安全生產(chǎn)菌種，且易受噬菌體感染。所以，枯草芽孢桿菌工程菌與釀酒酵母工程菌將成為GlcN研究的重要方向。第四，重視GlcN發(fā)酵的下游提取工藝研究，提高GlcN的得率與純度。相信隨著市場(chǎng)對(duì)GlcN需求量不斷增加，人們環(huán)保意識(shí)逐步增強(qiáng)，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)GlcN的研究將受到越來(lái)越多的關(guān)注。隨著研究的深入，微生物發(fā)酵法將會(huì)成為最有前景的GlcN工業(yè)化生產(chǎn)方法。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Review on Research Progresses in the Fermentation Methods to Produce Glucosamine

Wang Sheng Li Piwu Liu Dianlei Li Yiming Lin Jingjing
（Shandong Provincial Key Laboratory of Microbial Engineering，School of Food and Bioengineering, Qilu University of Technology Ji’nan 250353）

Glucosamine（GlcN）is an important hexosamine. It is formed by one hydroxyl group of glucose substituted by amino and has an effective role in the treatment of rheumatoid arthritis in the cartilage tissue. Besides, it is regarded as the natural harmless ingredients for food and health products. Currently, the methods for the production of GlcN include acid hydrolysis, enzymatic hydrolysis and microbial fermentation. For acid hydrolysis and enzymatic hydrolysis to product GlcN can lead to some adverse effects, such as environmental pollution, microbial fermentation is getting more attention from researchers. This overview focused on the biosynthetic pathway of microbial metabolism, microbial production of GlcN, and the direction of research for GlcN fermentation.

Glucosamine Biosynthetic pathway Microbial fermentation

國(guó)家“863計(jì)劃”項(xiàng)目（2012AA021504）

王升，男，碩士研究生，研究方向：發(fā)酵工程；E-mail：wangshengshow@sina.com

李丕武，男，副教授，研究方向：發(fā)酵工程；E-mail：piwuli@126.com