NF-κB 信號通路在魚類先天性免疫中的作用

NF-κB 信號通路在魚類先天性免疫中的作用

楊冰貞 張民 王克堅
（廈門大學 近海海洋環(huán)境科學國家重點實驗室，廈門 361102）

NF-κB（nuclear factor κB）是一種廣泛存在的核轉錄因子。經不同刺激信號激活后，參與多種免疫反應相關基因的表達調控，對魚類先天性免疫調節(jié)起著十分重要的作用。對魚類NF-κB的結構、功能及其信號傳導途徑進行概述，并對NF-κB信號通路在魚類先天性免疫調節(jié)中的作用進行綜述。

NF-κB信號通路 魚類 先天性免疫

核轉錄因子NF-κB是廣泛存在于真核細胞內的重要調節(jié)蛋白，是免疫系統(tǒng)機制的活化劑［1］，在Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）識別病原相關分子模式后，通過依賴MyD88或TRIF信號傳導通路，轉錄因子NF-κB被誘導激活，從而啟動固有免疫和適應性免疫而抵御病原的入侵。許多研究表明，它可以被細胞因子（如TNF、IL-1）、細菌、病毒、免疫刺激劑等多種刺激物及紫外線所激活。

魚類兼具先天性與獲得性免疫，但獲得性免疫應答效率低且發(fā)生相對滯后，因此先天性免疫在魚類免疫防御反應中起著重要的作用。對魚類先天性免疫調控機制研究逐漸成為熱點。魚類NF-κB調控研究尚處于初級階段，其信號通路中的免疫相關基因及具體的調控機制研究尚不深入。免疫系統(tǒng)識別抗原并通過NF-κB傳遞信息，使得這個可誘導轉錄因子受到越來越廣泛的關注。

1 NF-κB家族

NF-κB是一種從昆蟲到人類，進化上保守的核轉錄因子［2］。在許多物種中都發(fā)現了NF-κB活化的信號通路和NF-κB介導的免疫功能。哺乳動物中已經鑒定了NF-κB家族5個成員：RelA、RelB、c-Rel、p105/p50（NF-κB1）和p100/p52（NF-κB2）［3］。非洲爪蟾也已報道有NF-κB1、p65、RelB和c-rel基因的存在［4-7］。在哺乳動物中已經證明NF-κB對免疫和炎癥反應起調節(jié)作用［8］。而果蠅的Dorsal，Dif和Relish在調節(jié)不同類型的抗菌肽基因的表達方面也起著關鍵的作用［9］。近年來，魚類免疫防御相關轉錄因子NF-κB的研究越來越受關注。已從鱖魚（Siniperca chuatsi），河豚（Takifugu rubripes），淡水青鳉魚（Oryzias latipes），牙鲆（Paralichthys olivaceus）以及金眼門齒鯛（Stenotomus chrysops）等魚類中被分離出NF-κB家族成員。斑馬魚（Danio

rerio）中鑒別出p65，p100/p52，RelB，c-Rel和p50五個家族成員。且斑馬魚NF-κB/IκB蛋白序列分析表明與哺乳動物具有高度相似性，體現了NF-κB家族在進化上的保守性［10］。

NF-κB家族蛋白N端都含一個高度保守RHD結構域（Rel-homology domain），與蛋白的二聚化、DNA結合以及與抑制蛋白IκB相作用等功能有關。RelA、RelB和c-Rel則在C端有轉錄激活域（Transactivation domain，TAD）， 而 NF-κB1和 NF-κB2沒有［11］。鱖魚p65/IκBα序列比對發(fā)現它們與其他脊椎動物具有相似的結構域和功能位點，蛋白模型分析也發(fā)現與人類的相應蛋白有相同的折疊結構［12］。NF-κB通過二聚化形成同源或異源二聚體來對不同刺激進行特異性應答，可誘導的形式是異源二聚體。其中p50/p65異源二聚體具有最普遍的NF-κB結合活性［13］。

2 魚類中受NF-κB調控的靶基因

NF-κB調控著病原應答網絡中許多位點上誘導物和效應物的表達。許多基因的啟動子序列或增強子序列上都能識別到NF-κB響應的位點（κB結合位點）（表1），表明NF-κB是一種多效性的轉錄因子。這些基因包括免疫和炎癥密切相關的細胞因子、急性相響應蛋白、細胞黏附蛋白［14，15］和誘導性一氧化氮合酶等效應分子。近年來在魚類研究中發(fā)現抗菌肽hepcidin和β-defensin也受到NF-κB的調控影響。且研究發(fā)現，NF-κB的誘導激活能夠增強免疫應答。從表1所列的κB位點發(fā)現在不同物種和基因中NF-κB結合位點有所差別，這種差別導致了與NF-κB結合時有不同的親和力，從而特異性調控基因表達。

表 1 啟動子區(qū)含NF-κB結合序列的免疫相關基因

在目前報道的魚類研究中，受到NF-κB調控的靶基因主要包括以下幾個方面：

（1）細胞因子、促炎癥因子。NF-κB通路是先天免疫系統(tǒng)中細胞信號通路激活的核心［16］。在先天性免疫應答中，宿主首先釋放細胞因子和其他調節(jié)因子防御病原體的入侵。魚類NF-κB通過對IL-6、IL1β［17］、IL-12［18］和TNFα等基因的表達調節(jié)，在免疫應答中發(fā)揮功能。（2）急性反應蛋白。如血清淀粉樣蛋白A（Serum amyloid A，SAA）［19］、Mx1［20，21］、C9、抗菌肽hepcidin，防御素β-defensin等。NF-κB對急性蛋白表達的調節(jié)是應激的一種重要變化，具有廣泛的免疫防御意義。（3）細胞表面受體：Toll樣受體如TLR5等［22，23］。

特定基因的轉錄調節(jié)往往是需要多個轉錄因子協(xié)同作用的。NF-κB并不是調節(jié)靶基因的唯一轉錄因子，它還能與其他的轉錄因子如活化蛋白-1（AP-1）共同起著調節(jié)作用［24］。許多轉錄因子啟動子序列中也發(fā)現了NF-κB結合位點，由此NF-κB可活化其他轉錄因子進一步調節(jié)基因的表達。

3 NF-κB信號轉導通路

3.1 NF-κB的激活機制

已發(fā)現NF-κB信號通路存在于各物種中，且非常保守［25］。其激活機制主要依賴于IκB蛋白磷酸化所誘導的泛素化蛋白的水解作用。胞質中NF-κB與IκB蛋白相結合而處于非活性狀態(tài)。當胞外刺激通過細胞膜上的模式識別受體激活蛋白激酶，引起IκB發(fā)生磷酸化而與NF-κB解離。游離IκB在泛素化蛋白的作用下被降解，NF-κB二聚體因其NLS的暴露被迅速介導進入細胞核，與免疫調節(jié)基因的特異序列結合介導各種細胞因子和共刺激因子的表達。

3.2 NF-κB的抑制蛋白IκB

IκB家族蛋白包括IκBα，IκBβ，κBγ，IκBε和

Bcl-3。IκB蛋白的特征是含有5-7個錨定蛋白重復結構ANKs。這些錨定蛋白重復序列和NF-κB的Rel同源結構域相互作用，覆蓋了NF-κB上的核定位序列（Nuclear localization sequence，NLS）， 使NF-κB滯留于細胞質中。其中對IκBα的研究最多，認為其在抑制NF-κB中起主要作用。

與高等脊椎動物和果蠅相比，對魚類IκBα蛋白的研究報道為數甚少［26-28］。盡管在一些魚類中已鑒定出了IκBα樣基因序列，但是也僅限于對虹鱒（Oncorhynchus mykiss）、斑馬魚、牙鲆和鱖魚的研究，且大多止于轉錄水平的研究，少有功能研究［10，27-29］。在免疫信號通路中，NF-κB的轉錄活性往往受到嚴格調控，因為過度的激活會對宿主造成損傷，因而需要負調節(jié)方式來保證信號傳導的平衡。而細胞核和細胞質中蛋白IκB的調節(jié)是阻止NF-κB激活的機制之一［30］。已報道斑馬魚NF-κB能與哺乳動物IκBα發(fā)生結合作用，且在LPS的刺激下，顯性抑制蛋白IκB的過表達阻斷了NF-κB活性。Zhang等［31］研究表明在舌鰨（Cynoglossus semilaevis）中存在受IκBα負反饋調節(jié)的NF-κB-IκBα途徑。而Wang等［28］則采用免疫共沉淀法研究了鱖魚p65與IκBα的結合作用，同時發(fā)現IκBα基因上游調控區(qū)包含NF-κB結合位點 。這表明NF-κB可使IκBα基因表達上調，新合成的IκBα又抑制了NF-κB活性。從而，IκBα通過一個自身的負反饋調節(jié)機制保證了NF-κB活性的關閉，以維持細胞的穩(wěn)定性。

3.3 Toll樣受體介導的NF-κB激活

Toll-NF-κB途徑是機體免疫反應調節(jié)的關鍵信號通路。Toll樣受體是位于細胞表面的模式識別受體，其介導激活的轉錄因子NF-κB信號途徑可特異性對各種病原體作出應答。不同病原體激活NF-κB信號通路往往涉及不同的支架蛋白和信號蛋白。許多脊椎動物有不止一種TLR的報道［32］，目前在魚類中已經發(fā)現了19種TLR［33］。其中魚類特有的TLR基因（如TLR21、TLR22和TLR23）是在進化過程中保留下來的重要基因，具有重要研究價值。在哺乳動物中，膜結合的TLR5識別細菌的鞭毛蛋白成分，并通過MyD88途徑激活鞭毛介導的NF-κB。然而，與哺乳類僅存在單一受體系統(tǒng)不同，虹鱒的細菌鞭毛識別可通過膜型和可溶型TLR5兩種受體。體外試驗表明，TLR5S基因能夠識別鞭毛并且能輔助增強人TLR5所介導的NF-κB活性［34］。溝鯰（Ictalurus punctatus）中只發(fā)現了TLR3和TLR5的部分序列，研究顯示純系溝鯰和雜交品系溝鯰［Back-cross hybrid Catfish、F1 male（blue×channel）× female channel catfish］在感染愛德華氏菌（Edwardsiella ictaluri）后都具有上調表達［35，36］，暗示了它們參與細菌導致的急性感染反應。文昌魚（Branchiostoma belcheri）TLR3能特異性識別病毒復制的中間產物dsRNA，進而激活NF-κB和干擾素IFNβ前體?？筎LR3單克隆抗體對成纖維細胞IFNβ的產生起到抑制作用［37］。

哺乳動物TLRs下游信號涉及接頭蛋白（MyD88、SARM、MAL、TRAM和TRIF），NF-κB的 激 活，INK及IFN信號通路［38］。2004年在斑馬魚基因組中發(fā)現了MyD88，MAL，SARM和TICAM接頭蛋白［39］，但沒有發(fā)現TRAM蛋白，表明魚類TLRs下游可能存在有別于哺乳動物的信號通路。

MyD88能夠被除TLR3之外的所有TLR成員募集，并觸發(fā)NF-κB信號通路和絲裂素活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）［40，41］。研究表明，斑馬魚TLRs能夠通過募集MyD88接頭蛋白活化NF-κB通路以及MAPK通路使細胞釋放TNFα等促炎因子［42］。遲鈍愛德華菌刺激試驗發(fā)現牙鲆腎臟中出現膿腫，且膿腫周圍大量表達MyD88基因［43］，表明遲鈍愛德華菌對牙鲆的炎癥誘發(fā)是一條MyD88依賴信號通路。Skjaeveland等［44］將大西洋鮭（Salmo salar）MyD88導入哺乳動物細胞后，經CpGODN刺激能激活NF-κB的表達。

TRIF只能被TLR3和TLR4募集，并且活化NF-κB信號通路和轉錄因子IRF3。魚類TRIF介導TLR3和TLR22的信號傳導，激活NF-κB進而產生IFN，但有研究發(fā)現魚類TRIF不激活IRF3［45，46］。但在紅鰭東方鲀研究中，TLR22能夠激活TRIF依賴型信號通路而磷酸化轉錄因子IRF3，使其活化入核誘導I型干擾素的釋放［47］。斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）的研究中也表明該通路的激活［48］。此外斑馬魚TRIF與RIP1相互作用，活化NF-κB，而不能通過TRAF6［49］。由此發(fā)現魚類TRIF在這一功能上

與哺乳動物有所不同。

TIRAP/Mal和TICAM/TRAM則分別作為MyD88和TRIF的輔助接頭蛋白。TIRAP/Ma輔助MyD88募集到細胞表面TLR2以及TLR4上［50］。而TICAM2/ TRAM則輔助TRIF募集到內質網TLR4上［51］。

4 魚類NF-κB先天性免疫應答

昆蟲先天性免疫應答主要通過激活Toll和Imd兩條信號途徑，經由NF-κB調控抗菌活性物質的表達。已有研究表明，NF-κB信號通路通過調控免疫相關基因的表達在魚類先天性免疫中發(fā)揮著重要的作用。例如，錐漿蟲的感染下，鯉魚（Cyprinus carpio）NF-κB能夠誘導炎癥因子TNFα和IL1β表達而產生應答反應［52］。創(chuàng)傷弧菌刺激96 h，口服抗菌肽epinecidin-1重組蛋白的鯰魚（Silurus asotus）和斑馬魚增強了TLR4，IL1β 及NF-κB等基因的表達，從而增強了抗菌能力，使感染死亡率下降［53］。在另一些研究中發(fā)現，熱滅活的大腸桿菌、PGN、LAT也可以激活NF-κB。這說明了NF-κB對多種細菌的刺激產生了免疫應答。目前NF-κB抗菌免疫的研究較少，且集中于對炎癥因子的表達調控。但如前文提及，在魚類的許多抗菌分子啟動子區(qū)上都已發(fā)現NF-κB結合位點，從而進一步提示了NF-κB一方面誘導抗菌物質的合成，直接殺傷病原微生物；另一方面誘導炎癥因子等引發(fā)免疫反應有效抵抗病原微生物的入侵。

Wang等［28，54］發(fā)現在ISKNV病毒或鯉春病毒血癥病毒感染下，NF-κB抑制劑IκBα mRNA表達量顯著下降，表明NF-κB/IκB信號通路參與了病毒感染過程。且傳染性胰臟壞死病毒（IPNV）感染斑馬魚胚胎細胞時，TNFα、Mx、IL1β及mmp等免疫相關基因與轉錄因子NF-κB表達量均發(fā)生上調，而利用NF-κB特異性抑制劑阻斷NF-κB激活通路后，免疫相關基因轉錄水平被抑制下調，感染期間，TNFα依賴的NF-κB信號通路參與細胞因子和金屬蛋白酶基因轉錄調節(jié)［55］。del Castillo等［56］在紅鰭東方鲀中鑒別出了兩個dsRNA依賴的PKR亞基（蛋白激酶R），在病毒感染過程中表達均上調，揭示其具有抗病毒功能。而PKR的上調由IFN-γ激活引起，通過熒光素酶試驗也表明PKR能夠激活NF-κB而發(fā)揮抗病毒作用。

在抵抗RNA病毒感染的先天免疫中，主要的兩類PRRs分別是TLRs、RLRs。TLR依賴的信號通路主要通過激活了NF-κB轉錄因子，從而誘導抗病毒干擾素的產生。而RLR介導的抗病毒免疫信號中，重要接頭MAVS/IPS-1也能激活轉錄因子NF-κB，最終誘導干擾素的產生。I型干擾素的產生是抗病毒免疫反應中最重要一個方面。大西洋鮭中發(fā)現的與哺乳動物IFNβ相似的IFNα1 和IFNα2，經啟動子序列分析表明病毒對干擾素激活依賴于IRF-3和NF-κB，且NF-κB特異性抑制劑PDTC對Poly I∶C誘導的IFNα啟動子活性的抑制達90%［57，58］。以上的研究發(fā)現，NF-κB主要通過調控干擾素反應系統(tǒng)或直接誘導抗病毒活性相關蛋白的表達而發(fā)揮抗病毒感染作用。因而目前魚類中NF-κB的激活更多認為是對宿主抵抗病毒病原體的一種保護性反應。但研究發(fā)現IPNV感染誘導NF-κB的激活，最終導致宿主細胞死亡［59］。且哺乳動物研究中發(fā)現病毒能夠直接激活NF-κB而抑制凋亡，通過提高宿主細胞的存活能力以延長病毒復制、繁衍后代的時間?？梢姡琋F-κB與病毒之間可能存在復雜和緊密關系，因而有必要進一步研究魚類NF-κB信號通路對宿主細胞或病毒所發(fā)揮的作用。

5 結語

綜上所述，TLR-NF-κB信號通路保守，在魚類先天性免疫應答中同樣也能發(fā)揮重要的調控作用。作為經典信號轉導通路，NF-κB在哺乳動物中調控作用研究的比較清楚。目前雖已在魚類許多免疫基因啟動子序列中識別出NF-κB的結合位點，但對魚類NF-κB調控作用及機制的研究仍較少。因而，深入研究NF-κB調控網絡，闡明其在魚類中的信號轉導，將有利于進一步闡明魚類對病原刺激的免疫應答機制，可以為深入了解魚類的先天性免疫機制奠定重要的基礎，實現有目的地調控NF-κB信號通路，將為有效增強魚類抗病能力提供重要的理論指導。

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（責任編輯 狄艷紅）

Role of NF-κB Signal Pathway in the Innate Immune System of Fish

Yang Bingzhen Zhang Min Wang Kejian
（State Key Laboratory of Marine Environmental Science，Xiamen University，Xiamen 361102）

NF-κB（Nuclear factor κB）as an ubiquitously expressed nuclear transcription factor, involves in regulating the expression of immune-related genes after activation by a variety of stimuli and thus plays a very important role in the innate immune system of fish. It reviewed the structure, function and the signal pathway of fish NF-κB. Furthermore, we reviewed the role of NF-κB signal pathway in the innate immune system in fish.

NF-κB signal pathway Fish Innate immune system

2013-09-04

國家自然科學基金項目（41276102），教育部“長江學者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃”創(chuàng)新團隊（IRT0941）

楊冰貞，女，碩士研究生，研究方向：海洋分子生物學與免疫毒理學；E-mail：bingzhenyang2009@126.com

王克堅，男，博士，教授，研究方向：海洋分子生物學與免疫毒理學；E-mail：wkjian@xmu.edu.cn