生物柴油新原料
——微生物油脂

生物柴油新原料
——微生物油脂

賈彬1，2王亞南2何蔚紅2劉德海2謝復(fù)紅2王繼雯2馮菲2黃瑛1
（1.深圳大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，深圳 518061；2.河南省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450003）

生物柴油是替代傳統(tǒng)石化能源的重要途徑，但高昂的原料油成本限制其進(jìn)一步應(yīng)用。微生物油脂具有價(jià)格低廉、供給充足和不占用耕地資源等優(yōu)點(diǎn)，是理想的生物柴油原料油脂。對(duì)微生物油脂組成成分，提取和測(cè)定方法等方面進(jìn)行詳細(xì)介紹，并重點(diǎn)綜述轉(zhuǎn)座標(biāo)簽育種、代謝通路調(diào)控育種、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控育種和發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化等技術(shù)在提高細(xì)胞油脂積累量方面的應(yīng)用進(jìn)展，探討以微生物油脂為新原料制備生物柴油的優(yōu)點(diǎn)及可行性。

微生物油脂 生物柴油 油脂含量測(cè)定 代謝通路調(diào)控

生物柴油指甘油三酯經(jīng)酯交換工藝生成的脂肪酸甲酯或乙酯。隨著能源危機(jī)的加劇和原油價(jià)格的飆升，生物柴油技術(shù)受到越來(lái)越多的關(guān)注與重視。就我國(guó)實(shí)際情況而言，我國(guó)是世界第二大能源消費(fèi)國(guó)，對(duì)外石油依存度已超過(guò)50%，石油供給的相對(duì)不足已成為制約經(jīng)濟(jì)發(fā)展的關(guān)鍵瓶頸，這使生物柴油具有巨大的發(fā)展空間。本文就生物柴油的發(fā)展趨勢(shì)，對(duì)微生物油脂的研究狀況進(jìn)行綜述，探討以微生物油脂為新原料制備生物柴油的優(yōu)點(diǎn)及可行性，為降低生物柴油成本提供對(duì)策。

1 生物柴油概況

與石化柴油相比，生物柴油具有良好的燃料性能、較高的安全性能、清潔尾氣排放性能和發(fā)動(dòng)機(jī)低溫啟動(dòng)性能，且潤(rùn)滑性良好，能延長(zhǎng)發(fā)動(dòng)機(jī)使用壽命，屬于典型的綠色可再生能源，是石化燃料的理想替代品。生物柴油的原料油可分為植物油脂、動(dòng)物油脂、廢棄油脂以及新興的微生物油脂等。各國(guó)在原料油的選擇上區(qū)別較大，歐、美等國(guó)多數(shù)以大豆油、菜籽油、芥末籽油等作為原料油，而東南亞等國(guó)基本使用棕櫚油，日本則一般使用餐飲廢油，我國(guó)主要采用麻風(fēng)樹油、黃連木油等木本油脂和地溝油等廢棄油脂，而以微生物油脂為原料的生物柴油還處于研究階段。據(jù)統(tǒng)計(jì)，現(xiàn)階段生物柴油的原料油成本占總成本的50%-85%［1］，成為決定生物柴油最終價(jià)格的關(guān)鍵因素。

2 生物柴油原料油優(yōu)劣分析

2.1 現(xiàn)有生物柴油油源特點(diǎn)及缺陷

草本油料作物油脂含量較高，種子收獲、貯藏、運(yùn)輸和加工的程序簡(jiǎn)便。但我國(guó)種植量少，不能用于生物柴油生產(chǎn)；木本油料植物可在荒山種植，不

占用耕地資源，還可綠化環(huán)境、改良生態(tài)。但其油脂含量偏低，收獲、存儲(chǔ)成本高，荒山種植進(jìn)一步增加了采摘難度和效率；廢棄油脂成本較低，但其成分復(fù)雜，酸度高，加上我國(guó)廢棄油脂的回收渠道缺乏、監(jiān)督不嚴(yán)，且回流餐桌現(xiàn)象屢禁不止，難以穩(wěn)定、持續(xù)供給生物柴油生產(chǎn)。

按照我國(guó)當(dāng)前運(yùn)輸燃油消耗量估算，以生物柴油完全替代石化燃料需要相應(yīng)種植大豆 27 605×104hm2，占現(xiàn)有耕地面積225.5%；種植油菜7 524×104hm2，占耕地61%；種植麻瘋樹2 666×104hm2，占耕地22%［2］。巨大的種植量和種植面積在我國(guó)難以實(shí)現(xiàn)，尋找高油脂含量的新油源意義重大。

2.2 微生物油脂及其優(yōu)勢(shì)

微生物油脂又稱單細(xì)胞油脂（Single cell oils），是微生物在一定條件下將碳水化合物、碳?xì)浠衔锏忍荚崔D(zhuǎn)化為菌體內(nèi)大量?jī)?chǔ)存的油脂。其主要成分同植物油脂類似，但不飽和程度更高，以它為原料生產(chǎn)的生物柴油品質(zhì)更高［3］。與其它原料油相比微生物油脂具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）原料供給充足。微生物生長(zhǎng)周期僅4-7 d，且環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，甚至可以做到即時(shí)生產(chǎn)；（2）不占用耕地和淡水資源。部分藻類可在江海湖泊生長(zhǎng)，更符合國(guó)家生物柴油發(fā)展政策；（3）可規(guī)?；芾砗蜕a(chǎn)。微生物不受外界環(huán)境影響，能在工廠發(fā)酵罐中大規(guī)模生產(chǎn)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)現(xiàn)代化工業(yè)生產(chǎn)；（4）產(chǎn)品附加值高。大部分微生物在產(chǎn)油的同時(shí)會(huì)積累EPA、DHA和飼料蛋白等高附加值副產(chǎn)品，增加生物柴油產(chǎn)業(yè)鏈，提高產(chǎn)品利潤(rùn)。由此可見，微生物油脂具有廣闊前景，是生物柴油未來(lái)發(fā)展的重要方向。

3 微生物油脂研究進(jìn)展

3.1 產(chǎn)油微生物的種類

微生物大都能合成少量油脂，但只有油脂積累量超過(guò)20%的部分才可被稱為油脂微生物。雖然油脂微生物在藻類、酵母、真菌和細(xì)菌中都存在，但可用于生物柴油生產(chǎn)的僅有一少部分，表1列舉了幾種常見油脂微生物及其油脂含量。表中酵母、真菌類油脂含量最高（50%-70%），藻類油脂含量稍低（30%-60%），細(xì)菌類油脂含量最低（20%-40%）。可見，對(duì)生物柴油來(lái)說(shuō)，酵母、真菌和藻類才具有實(shí)際意義。其中酵母、真菌為異養(yǎng)型微生物，需額外添加碳、氮源才能合成油脂。而藻類為典型自養(yǎng)微生物，生長(zhǎng)需求低，能直接利用光和CO2合成油脂。它們?cè)跓o(wú)論淡水還是海水的開放環(huán)境中都可大量繁殖，更適合生物柴油發(fā)展的需求。

表1 常見油脂微生物及其油脂含量

3.2 微生物油脂成分組成

微生物油脂成分同植物油脂成分基本相同，均為脂肪酸甘油三酯。甘油酯的脂肪酸碳鏈長(zhǎng)度多為偶數(shù)，尤其以棕櫚酸、油酸、亞油酸和硬脂酸等含量較高，但部分微生物多不飽和脂肪酸含量較高，不同來(lái)源微生物油脂脂肪酸組成情況見表2［6，10］。藻類油脂以C16、C18為主，Δ9、Δ12和Δ15形式的不飽和脂肪酸較多。酵母和真菌油脂也以不飽和脂酸為主，C18∶1和C18∶2最多，C16∶1略少，且多含特殊脂，如M. alpina含7%的C20∶3，

E. coronata則含13%的C20∶1和6%的C22∶1。細(xì)菌油脂含量較低，油脂成分結(jié)構(gòu)也相對(duì)簡(jiǎn)單，以飽和脂肪酸為主，但極少數(shù)細(xì)菌油脂積累度可高達(dá)70%以上，但總體上講，細(xì)菌油脂不適合生物柴油生產(chǎn)。

表2 油脂微生物的脂肪酸組成

3.3 微生物油脂的提取及含量測(cè)定

3.3.1 提取方法 油脂提取方法可能隨目標(biāo)提取物不同而存在較大差異，但其效率卻是影響油脂價(jià)格和品質(zhì)的關(guān)鍵因素。微生物油脂提取一般只涉及細(xì)胞破碎和油脂分離兩個(gè)過(guò)程，但由于藻類水分含量高需增加脫水步驟，因而曬干、噴霧干燥、冷凍干燥和滾筒干燥等方法常被作為藻類油脂提取的預(yù)處理步驟。

細(xì)胞破碎的方法有基于機(jī)械剪切力的超聲、高壓、珠磨床和粉碎機(jī)破碎等，也有基于物理/化學(xué)法的反復(fù)凍融、有機(jī)溶劑處理、滲透壓休克和生物酶處理等方法。根據(jù)原料材質(zhì)，選擇合理的細(xì)胞破碎方法非常重要。Lee等［12］比較了高壓、微波、超聲等5種破碎方法對(duì)微藻油脂提取率的影響發(fā)現(xiàn)，在同等條件微波法提取效率最高，油脂提取量達(dá)到28.6%。而Mendes-Pinto［13］等在提取微藻蝦青素時(shí)則發(fā)現(xiàn)高壓和勻漿器破碎的效率最高，是酸、堿、酶處理等方法的2-3倍。

油脂分離過(guò)程中常用的方法有有機(jī)溶劑萃取和超臨界萃取等。在有機(jī)溶劑萃取法中，可供選擇的溶劑種類很多，但萃取溶劑不同會(huì)導(dǎo)致油脂成分發(fā)生改變，如用乙醇替代正己烷能顯著增加羥基苯乙烯甾醇酯、生育酚等高附加值油脂的含量［14］。Moreau［15］則認(rèn)為隨著溶劑極性增加油脂回收量也增加，并且高溫也有利于提高溶劑的萃取效率；CO2超臨界法萃?。⊿CCO2）是新近發(fā)展的一種高效油脂分離方法，該方法操作溫和、對(duì)有效成分破壞少、無(wú)溶劑殘留。Halim等［16］詳細(xì)評(píng)估了有機(jī)溶劑萃取和SCCO2在微藻油脂提取效率、脂肪酸組成、萃取動(dòng)力學(xué)等方面的差異，得到SCCO2法提取油脂效率高，非常適用于生物柴油油脂提取的結(jié)論。該方法能直接原位提取藻類油脂，效率是正己烷萃取法的5.6倍。

3.3.2 測(cè)定方法 傳統(tǒng)油脂定量必須在細(xì)胞油脂提取結(jié)束后，經(jīng)計(jì)算得到。該方法雖然準(zhǔn)確但步驟多、耗時(shí)長(zhǎng)、細(xì)胞消耗量大，無(wú)法滿足快速定量的要求。Izard等［17］通過(guò)硫酸-磷酸-香草醛顯色反應(yīng)的方法，快速定量細(xì)胞油脂含量（包括極性脂和中性脂）。由于該方法無(wú)需油脂提取步驟，且細(xì)胞用量只有0.5 mL，極大縮短了油脂含量測(cè)定時(shí)間。Wang等［18］利用該方法篩選經(jīng)粒子束照射的酵母突變體，成功篩選到兩株高產(chǎn)油脂酵母。

為了實(shí)時(shí)測(cè)定菌體油脂含量，Kimura等［19］開發(fā)了基于尼羅紅（Nile red）染色的熒光檢測(cè)法。他們將細(xì)胞用尼羅紅染色5 min，在發(fā)射光400 nm-700 nm，激發(fā)光488 nm的條件下測(cè)定熒光強(qiáng)度，換算油脂含量。該方法速度快、靈敏度高、對(duì)細(xì)胞無(wú)害，可進(jìn)行活體細(xì)胞測(cè)定。Chen等［20］在此基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，加入DMSO輔助尼羅紅染色，熒光測(cè)定條件改為530 nm/575 nm，并與96孔板篩選結(jié)合，發(fā)展出高通量油脂測(cè)定方法，成功應(yīng)用于工程油脂微藻的快速篩選。Montero等［21］則結(jié)合尼羅紅染色熒光和流式細(xì)胞分選快速測(cè)定微藻油脂含量，進(jìn)一步提高油脂測(cè)定效率，并實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞的實(shí)時(shí)篩選。與尼羅紅類似的染料油紅（Oil red O）也逐漸應(yīng)用于微生物油脂含量測(cè)定［22］。

染色熒光法在液態(tài)培養(yǎng)的油脂含量測(cè)定中非常有效，但無(wú)法在固態(tài)培養(yǎng)測(cè)定中應(yīng)用。為此，Peng等［23］建立了基于近紅外光譜分析的刻度模

型法對(duì)固態(tài)培養(yǎng)的微生物油脂含量進(jìn)行測(cè)定，該方法測(cè)定結(jié)果的平均標(biāo)準(zhǔn)誤差低于0.58%，成功對(duì)Microsphaeropsissp、Nigrosporasp等5種固體發(fā)酵的真菌油脂含量進(jìn)行測(cè)定。

4 提高微生物油脂含量的策略

4.1 高含量油脂微生物育種技術(shù)

4.1.1 傳統(tǒng)誘變育種 傳統(tǒng)物理、化學(xué)誘變技術(shù)曾在工業(yè)微生物育種中發(fā)揮重要作用，迄今仍在微生物育種廣泛使用。常見物理誘變有紫外線、X-射線等，化學(xué)誘變劑有堿基類似物、5-氟尿嘧啶、烷化劑和氯化鋰等，利用該技術(shù)提高微生物油脂含量的報(bào)道較多，鑒于篇幅限制不再此過(guò)多討論。

4.1.2 轉(zhuǎn)座標(biāo)簽育種 利用轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入基因組，尋找與油脂合成相關(guān)基因的育種工作已取得一定進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)了與油脂合成相關(guān)的系列基因。Kamisaka等［24］通過(guò)轉(zhuǎn)座子突變?cè)卺劸平湍钢邪l(fā)現(xiàn)5個(gè)能提高菌體含量的基因，其中ΔSnf2使油脂含量提高3.8倍。宋安東等［25］利用轉(zhuǎn)該技術(shù)選育出油脂含量提高20.6%的發(fā)酵型絲孢酵母突變株。

4.1.3 代謝通路調(diào)控育種 微生物油脂代謝是一個(gè)多酶參與的復(fù)雜過(guò)程，從油脂的合成、碳鏈的延伸、脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)運(yùn)、存儲(chǔ)到最終氧化轉(zhuǎn)化為能量涉及了糖酵解、三羧酸循環(huán)、β-氧化等多個(gè)細(xì)胞生理生化過(guò)程，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、過(guò)氧化物酶體等多個(gè)細(xì)胞器都參與其中，共同構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。研究者針對(duì)代謝網(wǎng)絡(luò)特點(diǎn)，利用基因工程和代謝工程手段對(duì)其進(jìn)行調(diào)整和結(jié)構(gòu)優(yōu)化，以期提高柴油酵母的油脂含量。

直接增加油脂合成量是首選調(diào)控策略。乙酰CoA羧化酶（ACC）、酯酰CoA：二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶（DGAT）和磷酸酯：二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶（PDAT）直接參與油脂合成并為關(guān)鍵限速酶，通過(guò)增加它們的表達(dá)量來(lái)提高油脂含量的方法非常有效。ACC是脂肪酸從頭合成途徑中第一個(gè)限速酶，Davis等［26］將大腸桿菌BL21中4個(gè)ACC基因全部過(guò)表達(dá)，直接導(dǎo)致菌體油脂含量提高6倍，Klaus［27］將擬南芥ACC基因在馬鈴薯中表達(dá)使其油脂含量提高5倍；DGAT和PDAT都是甘油三酯合成途徑最后一步的催化酶，負(fù)責(zé)催化二酰甘油到三酰甘油的轉(zhuǎn)化，前者對(duì)?；鵆oA依賴，后者不依賴。迄今為止，至少發(fā)現(xiàn)兩個(gè)DGAT1家族（DGAT1和DGAT2），兩者不僅在序列同源性上有較大差別，很可能具有不同的生理學(xué)功能。Bouvier等［28］將擬南芥DGAT兩個(gè)基因分別導(dǎo)入酵母和煙草發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化株中DGAT活性提高200-600倍，相應(yīng)油脂含量分別提高9倍和7倍。DGA1是酵母中最早鑒定的DGAT，屬于DGAT2家族，負(fù)責(zé)催化釀酒酵母中87%的二酰甘油轉(zhuǎn)化為三酰甘油。研究者還在Y. lipolytica中發(fā)現(xiàn)了屬于DGAT1家族的DGA2，用POX啟動(dòng)子調(diào)控單獨(dú)過(guò)表達(dá)它能使細(xì)胞油脂含量提高63%。LOR1是目前唯一發(fā)現(xiàn)的酵母PDAT，該酶同時(shí)具有磷脂酶和酰基轉(zhuǎn)移酶的活性，在酵母對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的TAG合成中起主要作用，該酶缺失導(dǎo)致TAG含量下降40%，目前尚未有藻類DGAT和PDAT的報(bào)道［29］。

減少細(xì)胞油脂自身消耗量是另一種常見策略。脂肪酸β-氧化是胞內(nèi)氧化消耗油脂的主要代謝途徑，抑制該途徑可減少油脂自身消耗量。酯酰CoA氧化酶（AOX）是該途徑關(guān)鍵酶，該酶家族保守性差，在不同種屬間區(qū)別較大，在C. tropicalis中發(fā)現(xiàn)3個(gè)，C. maltose中2個(gè)，在S. cerevisiae中只有一個(gè)，在Y. lipolytica中則發(fā)現(xiàn)6個(gè)。研究表明，部分抑制β-氧化可增加細(xì)胞油脂含量，但完全缺失AOX則會(huì)影響細(xì)胞能量供給導(dǎo)致細(xì)胞難以正常生長(zhǎng)［30］。

改變中間代謝產(chǎn)物流向，減少分支路徑競(jìng)爭(zhēng)也能有效增加細(xì)胞油脂含量。甘油醛3磷酸（G3P）是甘油三酯基本骨架，它和磷酸二羥丙酮（DHAP）同為糖酵解中間產(chǎn)物且二者能相互轉(zhuǎn)化，Beopoulos等［31］將負(fù)責(zé)從G3P到DHAP轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶GUT2敲除，改變代謝網(wǎng)絡(luò)中碳流向，生成了更多甘油-3-磷酸，使酵母油脂含量提高了3倍，在此基礎(chǔ)上他們繼續(xù)敲除β-氧化途徑的AOX進(jìn)一步使油脂含量提高了4倍。類似地，Thierry等［32］把負(fù)責(zé)G3P穿梭作用的Gpd1基因過(guò)表達(dá)，增加了甘油-3-磷酸的積累量，進(jìn)一步缺失AOX后使細(xì)胞油脂含量提高34%；另一方面，胞內(nèi)磷脂合成與甘油酯合成相互競(jìng)爭(zhēng)，它們均以磷脂酸為底物，減少磷脂合成量能增加細(xì)胞甘油酯含量［30］。

增強(qiáng)油脂合成相關(guān)途徑酶促進(jìn)細(xì)胞油脂含量。雖然有些酶并未直接參與油脂代謝，但是它們與油

脂代謝相關(guān)，部分增加它們的表達(dá)量也可提高細(xì)胞油脂含量。油脂合成基本原料乙酰輔酶A是由檸檬酸裂解生成，Rangasamy等［33］證明增加ATP：檸檬酸裂解酶（ACL）表達(dá)量使油脂含量提高16%；另一方面，甘油酯合成是一個(gè)化學(xué)耗能過(guò)程，NADPH在合成途徑中充當(dāng)還原劑，增加細(xì)胞NADPH供應(yīng)量同樣能提高細(xì)胞油脂含量，而NADPH則由蘋果酸脫氫酶（ME）催化蘋果酸分解產(chǎn)生。Zhang等［34］分別將Mucor circinelloides和Mortierella alpine的ME基因在M. circinelloides中過(guò)表達(dá)，使油脂含量相應(yīng)增加2.5倍和2.4倍。

4.1.4 其他 隨著研究深入，人們發(fā)現(xiàn)從轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)油脂合成的優(yōu)勢(shì)逐漸突出，利用轉(zhuǎn)錄因子（TFs）調(diào)節(jié)油脂合成途徑關(guān)鍵酶水平和豐度的研究正在開展。已經(jīng)在動(dòng)植物中發(fā)現(xiàn)大量與油脂合成相關(guān)的TFs，如SREBP、SebHLH和GmDof4等，但在微生物卻比較少。Courchesne等［30］認(rèn)為細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)成金字塔形結(jié)構(gòu)，高等級(jí)TFs相對(duì)保守且能調(diào)控低等級(jí)TFs，低等級(jí)TFs數(shù)量多卻不保守導(dǎo)致研究難度大，而與油脂合成相關(guān)的TFs恰為低等級(jí)TFs。目前，只有S. cerevisiaeSNF2轉(zhuǎn)錄因子研究相對(duì)清楚，它負(fù)責(zé)調(diào)控磷脂合成，受纖維醇、膽堿抑制，如上文所述，直接缺失SNF2可使油脂含量提高3.8倍［24］。可見，TFs調(diào)控策略在提高油脂含量上極有潛力，但當(dāng)前研究仍處于尋找和發(fā)現(xiàn)TFs的階段。越來(lái)越多研究證明單一代謝途徑調(diào)節(jié)取得的效果有限，在細(xì)胞水平上開展多策略綜合應(yīng)用才能有效提高油脂積累研究也被逐漸重視。2007年由歐盟第七框架計(jì)劃支持建立了“脂酵母”計(jì)劃，該計(jì)劃希望以油脂酵母Y. lipolytica為出發(fā)菌，利用海洋解烷烴類細(xì)菌特有降解轉(zhuǎn)化酶開發(fā)出脂類通用型發(fā)酵平臺(tái)，用以生產(chǎn)各種功能脂。

4.2 發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化

雖然基因工程、代謝工程在提高油脂含量方面發(fā)揮了重要作用，但對(duì)遺傳背景不清楚的菌來(lái)說(shuō)，利用發(fā)酵過(guò)程控制提高油脂含量無(wú)疑是最簡(jiǎn)單、有效的途徑。介于篇幅限制，有關(guān)發(fā)酵溫度、pH、通氣量等基本參數(shù)的控制優(yōu)化不在此討論。

4.2.1 限制因子控制 油脂合成已被證明是細(xì)胞在碳源充裕而其他方面受限制時(shí)的一種能量積累方式。常見限制性因子有氮源受限、硫源受限和磷源受限等。其中氮源受限最易實(shí)現(xiàn)，簡(jiǎn)單改變培養(yǎng)基C/N比即可實(shí)現(xiàn)油脂發(fā)酵生產(chǎn)的控制。Papanikolaou等［35］發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基C/N從83.5增加到133.5后，Cunninghamella echinulata油脂含量隨之從36%增至47%。李永紅等［36］在R. toruloides同樣發(fā)現(xiàn)其油脂含量隨之C/N增加而提高，C/N為420時(shí)油脂含量達(dá)到最高值76%；硫限制對(duì)油脂含量積累同樣有促進(jìn)作用。Wu等［37］研究了R. toruloides在硫限制時(shí)的油脂狀況發(fā)現(xiàn)，C/S比為46750時(shí)，細(xì)胞油脂含量達(dá)58.3%，且硫限制時(shí)，細(xì)胞油脂含量保持穩(wěn)定不再隨C/N而變化。磷限制也有類似結(jié)果，降低培養(yǎng)基磷含量可顯著增加R. toruloides油脂含量［36］。

4.2.2 發(fā)酵底物控制 萄糖、甘油是油脂發(fā)酵生產(chǎn)常用底物，但大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)仍可能存在成本較高的問(wèn)題，為減少微生物油脂生產(chǎn)成本，研究者研究廉價(jià)底物的油脂生產(chǎn)工藝。因此，利用木質(zhì)纖維素水解物作為發(fā)酵底物的報(bào)道非常多。油脂微生物代謝底物譜廣，不但能利用水解產(chǎn)物中的葡萄糖等六碳糖，而且能有效轉(zhuǎn)化木糖等五碳糖，對(duì)解決纖維素全糖利用問(wèn)題有積極促進(jìn)作用。除木質(zhì)纖維素水解物外，幾丁質(zhì)水解物也是一種非常有潛力的油脂發(fā)酵底物。R. glutinis、R. opacus和C. curvatus等已被證實(shí)能以該水解產(chǎn)物為唯一碳源進(jìn)行生長(zhǎng)，且油脂積累量能達(dá)到28%以上［38］。為進(jìn)一步增加發(fā)酵底物范圍，Zhao等［39］將菊粉酶基因轉(zhuǎn)入Y. lipolytic中，獲得了能直接利用菊芋生產(chǎn)油脂的工程菌，菌體油脂含量可達(dá)50%以上，部分解決原料來(lái)源問(wèn)題，同時(shí)也可有效解除灘涂、鹽堿地荒置問(wèn)題。

4.2.3 發(fā)酵模式優(yōu)化 當(dāng)前，微生物油脂生產(chǎn)主要以液態(tài)發(fā)酵為主，其中分批補(bǔ)料培養(yǎng)模式可方便控制限制因子濃度，獲得了廣泛應(yīng)用。在C. curvatus發(fā)酵粗甘油生產(chǎn)油脂的研究中，批式培養(yǎng)時(shí)生物量?jī)H能達(dá)到6 g/L，而分批補(bǔ)料培養(yǎng)則能達(dá)到30 g/L以上，油脂含量可達(dá)52%［40］。此外，為縮短發(fā)酵時(shí)間，減少原料消耗，林金濤［41］等提出了兩階段的培養(yǎng)模式，該模式將菌體的生長(zhǎng)階段和產(chǎn)油階段分開，能節(jié)省氮源及其他輔料的消耗，提高油脂產(chǎn)量。也有少數(shù)固體發(fā)酵產(chǎn)油脂的報(bào)道，但總體水平不高，

Peng等［23］固體發(fā)酵后油脂產(chǎn)量為80 mg/gds，油脂占干發(fā)酵物的10.2%。

近年來(lái)，混合培養(yǎng)法逐漸成為一種新油脂發(fā)酵模式。Cheirsilp等［42］將黏紅酵母與小球藻混合培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)菌體生長(zhǎng)速度和油脂產(chǎn)量均有明顯提高，菌體培養(yǎng)時(shí)間縮至5 d，菌體量達(dá)（4.63±0.15）g/L，油脂產(chǎn)量達(dá)（2.88±0.16）g/L。他們認(rèn)為，混合培養(yǎng)時(shí)藻類作為O2供體提高了酵母生長(zhǎng)速度，而酵母作為CO2供體促進(jìn)藻類生長(zhǎng)，二者共同使菌體量和油脂含量有明顯提高。國(guó)內(nèi)北京化工大學(xué)譚天偉等［43］也采用類似方法取得了良好效果，油脂產(chǎn)量達(dá)216 mg/L，分別是純培養(yǎng)黏紅酵母的5.42倍，螺旋藻的7.64倍。

5 結(jié)語(yǔ)

高原料成本而引起的高價(jià)格生物柴是影響整個(gè)產(chǎn)業(yè)普及和應(yīng)用的關(guān)鍵因素。微生物油脂生產(chǎn)周期短、供給充足的優(yōu)點(diǎn)使各國(guó)在油源選擇的問(wèn)題上逐步趨向一致，開發(fā)高油脂含量微生物資源、增加微生物的油脂產(chǎn)量、降低微生物產(chǎn)油成本等研究已成為當(dāng)前共識(shí)。

歐美等國(guó)在高油量微生物資源開發(fā)研究中走在前列。以微藻為例，美國(guó)可再生能源實(shí)驗(yàn)室自1978年起就開展了海洋高產(chǎn)油脂藻類的大規(guī)模篩選研究，已從3 000多種產(chǎn)油藻類中篩選出近300種油脂含量超過(guò)50%的硅藻和綠藻。我國(guó)在這方面的研究還有待加強(qiáng)，油脂微生物資源的獲取環(huán)境也需從土壤過(guò)度到深海、高山、冰川、極地等特殊環(huán)境。

基于代謝工程、基因工程等技術(shù)，人類已有了不少提高微生物油脂產(chǎn)量的調(diào)控策略，并進(jìn)一步獲得了一系列產(chǎn)脂肪酸、脂肪醇和脂肪酸乙酯的工程菌株。但多數(shù)調(diào)控策略的手段單一，導(dǎo)致其通用性差，在一個(gè)材料中有效而另一材料中無(wú)效的例子隨處可見。如增加ACC表達(dá)量，可顯著提高馬鈴薯的油脂含量，但對(duì)藻類卻收效甚微［44］。而且現(xiàn)階段產(chǎn)油微生物種類較多，各自遺傳背景差異較大，也進(jìn)一步增加了研究難度。因此，選擇合適的宿主做模式，在適當(dāng)改造的基礎(chǔ)上綜合各種調(diào)控策略，系統(tǒng)研究油脂合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和氧化等步驟，將逐步受到重視和認(rèn)可，并將成為今后研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)室已從深海中篩選出一批產(chǎn)油酵母，并對(duì)其中一株Y. lipolytica的產(chǎn)油模式和發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行了研究，由于該菌遺傳背景相對(duì)清晰，本實(shí)驗(yàn)室試圖將它改造成為酵母類油脂調(diào)控研究的參照物之一，相關(guān)的遺傳改造工作正在進(jìn)行。

綜上所述，微生物油脂技術(shù)作為生物質(zhì)能源研究中的重要內(nèi)容，已逐步在生物柴油研究和應(yīng)用中發(fā)揮關(guān)鍵作用，取得了很大進(jìn)展。有理由相信，隨著微生物油脂生產(chǎn)工業(yè)化、自動(dòng)化和規(guī)?；潭鹊奶岣?，微生物油脂將會(huì)越來(lái)越廉價(jià)，并最終解決生物柴油價(jià)格高的難題。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

New Biodiesel Raw Material— Microbial Lipid

Jia Bin1，2Wang Yanan2He Weihong2Liu Dehai2Xie Fuhong2Wang Jiwen2Feng Fei2Huang Ying1
（1. College of Life Science，Shenzhen University，Shenzhen 518061；2. Henan Key laboratory of microbe engineering，Zhengzhou 450003）

Biodiesel is an important approaches for substitution of fossil energy, however, high raw material cost restricts its further application. Microbial lipid is ideal biodiesel raw material because of its quality of sufficient supply, cheapness and none farmland consuming. In this paper, we summarized resent progress in microbial lipid extraction and determination, detailed reviewed the applications of transposon tagging, metabolic pathway control, transcription factor control and fermentation optimization in cellular lipid accumulation, discussed the possibility and advantages of biodiesel production using microbial lipid.

Microbial lipid Biodiesel Lipid determination Metabolism pathway control

2013-06-03

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31100582）

作者介紹：賈彬，男，博士，副研究員，研究方向：生物質(zhì)能源；E-mail：Jiasanlin@gmail.com