畢赤酵母高密度培養(yǎng)表達(dá)雞α-干擾素的工藝研究

姜正軍劉樹海王茂超程全明黃金，2

（1.山東華辰生物科技有限公司，濰坊 261061；2.浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，杭州 310014）

畢赤酵母高密度培養(yǎng)表達(dá)雞α-干擾素的工藝研究

姜正軍1劉樹海1王茂超1程全明1黃金1，2

（1.山東華辰生物科技有限公司，濰坊 261061；2.浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，杭州 310014）

考察了10 L罐規(guī)模條件下pH、溫度、裝液量以及碳源流加模式對(duì)畢赤酵母高密度培養(yǎng)表達(dá)雞α-干擾素的影響，確定了最優(yōu)的生產(chǎn)工藝：在pH5.5、28℃、40%裝液量條件下，當(dāng)初始碳源耗盡的情況下，進(jìn)行甘油和甲醇混合（流加體積速率比為20∶1）脈沖流加，產(chǎn)物雞α-干擾素抗病毒活性最高，可達(dá)3×106IU/mL。將該工藝在50 L發(fā)酵罐規(guī)模條件下進(jìn)行放大，重復(fù)20批，結(jié)果表明此過(guò)程重復(fù)性較好，且目的蛋白表達(dá)量穩(wěn)定，具有工業(yè)化生產(chǎn)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

畢赤酵母 雞α-干擾素 優(yōu)化 放大

近年來(lái)，雞的烈性病毒性傳染病在我國(guó)部分地區(qū)及世界范圍呈流行趨勢(shì)，如禽流感、法氏囊病、新城疫、馬立克氏病等，已成為公共衛(wèi)生的一大危害。僅2013年國(guó)內(nèi)報(bào)道了135例人感染禽流感病例，造成45例發(fā)病死亡，長(zhǎng)三角地區(qū)因H7N9禽流感疫情撲殺銷毀的禽類據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)達(dá)到數(shù)百萬(wàn)只。同時(shí)，據(jù)報(bào)道目前種種跡象和最新的科學(xué)試驗(yàn)結(jié)果都表明今年秋冬季節(jié)天氣轉(zhuǎn)冷時(shí)H7N9禽流感很可能還將在我國(guó)卷土重來(lái)［1］。屆時(shí)，無(wú)疑對(duì)畜禽業(yè)的發(fā)展又將是一場(chǎng)劫難。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，加之天然干擾素在生產(chǎn)和應(yīng)用中的限制，使得利用基因工程手段介入干擾素的生產(chǎn)成為了生產(chǎn)和研發(fā)的主流。20世紀(jì)70年代起，研究者就開始探索利用基因工程手段進(jìn)行IFN的生產(chǎn)，取得了很大進(jìn)步。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)對(duì)雞干擾素的研究陸續(xù)展開，但多數(shù)側(cè)重于雞II型干擾素（IFN-γ）的研究和開發(fā)，而對(duì)雞I型干擾素（IFN-α）的研究和開發(fā)主要集中在基因克隆及其表達(dá)上［2，3］。因中下游發(fā)酵技術(shù)以及高密度培養(yǎng)理論未能有效銜接上游分子改造，致使利用重組工程菌高密度培養(yǎng)生產(chǎn)干擾素過(guò)程中遇到高密度培養(yǎng)困難、工藝控制復(fù)雜、生產(chǎn)穩(wěn)定性差、生產(chǎn)規(guī)模放大困難等問(wèn)題，已成為制約我國(guó)干擾素生產(chǎn)和應(yīng)用的瓶頸問(wèn)題。

本課題組前期研究利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)成功地進(jìn)行了雞I型干擾素（IFN-α）的表達(dá)，將去掉全閱讀框的信號(hào)肽序列后的雞干擾素成熟蛋白的基因序列整合到酵母表達(dá)載體pPICZa-A上。重組菌獲得外源蛋白（雞IFN-α）純度大于70%，經(jīng)過(guò)65 636倍稀釋發(fā)現(xiàn)能完全抑制100-1 000 TCID50的水皰性口炎病毒的攻擊。同時(shí)其對(duì)VSV和禽流感病毒的轉(zhuǎn)錄、翻譯階段抑制能力尤為明顯［4，5］。本研究在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行畢赤酵母高密度培養(yǎng)表達(dá)雞α-干擾素的工藝優(yōu)化和放大試驗(yàn)，獲得較為成熟的工藝，旨在為雞α-干擾素規(guī)?；a(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 雞α-干擾素重組酵母菌Pichia pastorisIFNα-pPICZαA，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病診斷與免疫重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基 活化培養(yǎng)基：1%酵母粉，2%胰蛋白胨，2%葡萄糖，18.218% D-山梨醇。115℃，20 min滅菌。

種子培養(yǎng)基：1%酵母粉，2%胰蛋白胨，1%甘油，1.34% YNB和4×10-7生物素（滅菌后過(guò)濾添加），用磷酸緩沖液調(diào)節(jié)初始pH6.0，121℃，20 min滅菌。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基：1%酵母粉，2%胰蛋白胨，0.5%甲醇、1.34% YNB和4×10-7生物素（滅菌后過(guò)濾添加），用磷酸緩沖液調(diào)節(jié)初始pH6.0，121℃，20 min滅菌。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 將從平板單菌落挑2環(huán)接入活化培養(yǎng)基（100 mL/500 mL搖瓶）中，在30℃，220 r/min下培養(yǎng)24 h后，以10 %（V/V）接種量接入裝有2.5 L種子培養(yǎng)基的5 L種子罐中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30℃，pH6.0，轉(zhuǎn)速300 r/min，通風(fēng)量為1.0 vvm，培養(yǎng)至OD650= 40以上時(shí)，以10%（V/V）接種量壓入10 L發(fā)酵罐中，初始轉(zhuǎn)速為300 r/min，初始裝液量60%，溫度30℃，pH6.0；對(duì)于50 L規(guī)模發(fā)酵放大試驗(yàn)，以10 L罐為二級(jí)種子罐（其培養(yǎng)條件同5 L種子罐），初始發(fā)酵條件與10 L規(guī)模試驗(yàn)相同，過(guò)程調(diào)控轉(zhuǎn)速和通氣量保持溶解氧濃度大于10%；發(fā)酵過(guò)程脈沖流加甲醇、甘油或葡萄糖，通過(guò)測(cè)定和監(jiān)控使甲醇、甘油或葡萄糖濃度控制在0.1%-0.5%。

1.2.2 分析方法

1.2.2.1 菌體生長(zhǎng) 采用比濁法，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定。將發(fā)酵液樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋，測(cè)定其在650 nm下的光密度OD650；測(cè)定細(xì)胞干重時(shí)，將從發(fā)酵罐中所采具有不同OD650值的樣品，離心洗滌2次，80℃下烘干至恒重，得到表達(dá)雞α-干擾素重組畢赤酵母的細(xì)胞干重與OD650之間的關(guān)系為：Y（DCW）= 0.417 OD650。

1.2.2.2 抗病毒活性測(cè)定 測(cè)定用細(xì)胞和病毒由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)贈(zèng)送，細(xì)胞為雞胚成纖維細(xì)胞（CEF），病毒為水泡性口炎病毒（VSV）。測(cè)定方法參照參考文獻(xiàn)［6］的抗病毒活性測(cè)定方法。

1.2.2.3 甘油濃度測(cè)定 采用HPLC法，Agilent 1100 液相色譜儀，C18反向柱，5 μm，4.6 mm× 250 mm；流動(dòng)相：70%乙腈，30%水；流速：0.6 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：5 μL；檢測(cè)器：示差折光檢測(cè)器。

1.2.2.4 甲醇濃度測(cè)定 參照文獻(xiàn)方法［7］用氣相色譜儀測(cè)定。

1.2.2.5 葡萄糖濃度測(cè)定 利用SBA-40生物傳感儀測(cè)定（山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院）。

2 結(jié)果

2.1 pH對(duì)畢赤酵母高密度培養(yǎng)表達(dá)雞α-干擾素的影響

在10 L罐發(fā)酵水平，維持不同的pH條件下，考察其對(duì)干擾素表達(dá)及菌體合成的影響。結(jié)果（圖1）顯示，維持pH5.5條件下，發(fā)酵42 h，細(xì)胞干重達(dá)到25.5 g/L，產(chǎn)物雞α-干擾素IFN-α抗病毒活性達(dá)

到2×106IU/mL。雖在pH6.0條件下獲得的細(xì)胞干重與pH5.5相比更高，但產(chǎn)物抗病毒活性相對(duì)較低，所以選擇維持pH5.5進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 pH對(duì)畢赤酵母高密度培養(yǎng)表達(dá)雞α-干擾素的影響

2.2 溫度對(duì)畢赤酵母高密度培養(yǎng)表達(dá)雞α-干擾素的影響

通過(guò)考察不同溫度條件下對(duì)菌體合成和產(chǎn)物雞α-干擾素抗病毒活性的影響發(fā)現(xiàn)，維持全過(guò)程溫度28℃時(shí)，產(chǎn)物雞α-干擾素抗病毒活性最高，可達(dá)到2×106IU/mL（圖2）。

圖2 溫度對(duì)畢赤酵母高密度培養(yǎng)表達(dá)雞α-干擾素的影響

2.3 裝液量對(duì)畢赤酵母高密度培養(yǎng)表達(dá)雞α-干擾素的影響

鑒于裝液量對(duì)于工程菌發(fā)酵的重要性（影響營(yíng)養(yǎng)物及氧氣的傳遞性能），考察了10 L發(fā)酵罐中不同裝液量（80%、70%、60%、50%和40%）對(duì)菌體合成及雞α-干擾素表達(dá)的影響。結(jié)果（圖3）表明，隨著裝液量的增加菌體合成量大致呈下降趨勢(shì)。而在裝液量為50%條件下，在獲得較大菌體量的同時(shí)，產(chǎn)物獲得了最高的抗病毒活性（3×106IU/mL）。在40%裝液量條件下的發(fā)酵液經(jīng)鏡檢發(fā)現(xiàn)大量細(xì)胞碎片的存在，推測(cè)原因可能是在相同攪拌功率條件下，隨著裝液量的減少，P/V（單位體積功率系數(shù)）將增大，從而對(duì)菌體細(xì)胞產(chǎn)生較大的剪切力，造成細(xì)胞破碎。

圖3 裝液量對(duì)畢赤酵母高密度培養(yǎng)表達(dá)雞α-干擾素的影響

2.4 碳源流加模式對(duì)畢赤酵母高密度培養(yǎng)表達(dá)雞α-干擾素的影響

考察不同流加模式對(duì)畢赤酵母高密度培養(yǎng)表達(dá)雞α-干擾素的影響，結(jié)果（表1）顯示，以模式1，即甘油和甲醇混合（流加體積速率比為20∶1）脈沖流加，在獲得最大菌體量的同時(shí)，獲得雞α-干擾素最大的抗病毒活性為5.1×106IU/mL。

表1 碳源流加模式對(duì)畢赤酵母高密度培養(yǎng)表達(dá)雞α-干擾素的影響

2.5 規(guī)模放大試驗(yàn)

將10 L自控發(fā)酵罐的補(bǔ)料批次發(fā)酵過(guò)程（圖4）顯示，在50 L規(guī)模進(jìn)行放大，重復(fù)20批。結(jié)果顯示，與10 L罐上的各項(xiàng)表觀參數(shù)相比，50 L罐發(fā)酵過(guò)程各項(xiàng)目標(biāo)參數(shù)與10 L沒有較大的變化，結(jié)果重現(xiàn)性較好，生產(chǎn)過(guò)程各項(xiàng)參數(shù)較為穩(wěn)定（表2），且目的蛋白表達(dá)量穩(wěn)定（圖5），具有工業(yè)化生產(chǎn)的實(shí)際價(jià)值。

圖4 10 L自控發(fā)酵罐的補(bǔ)料批次發(fā)酵過(guò)程圖

表2 50 L發(fā)酵規(guī)模畢赤酵母高密度培養(yǎng)表達(dá)雞α-干擾素過(guò)程穩(wěn)定性

圖5 50 L發(fā)酵罐中不同批次重組雞α-干擾素的表達(dá)

3 討論

目前利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行雞I型干擾素（IFN-α）表達(dá)的報(bào)道已經(jīng)屢見不鮮，且其表達(dá)產(chǎn)物IFN-α對(duì)VSV和禽流感病毒的轉(zhuǎn)錄、翻譯階段具有確切的抑制作用［4，5］。溫度對(duì)畢赤酵母高密度流加培養(yǎng)表達(dá)外源蛋白表達(dá)過(guò)程有極大的影響，過(guò)高的溫度會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞代謝活性低（表現(xiàn)為過(guò)低的AOX活性），而過(guò)低的溫度同樣會(huì)帶來(lái)大量毒性物質(zhì)甲醛和過(guò)氧化氫積累［8，9］。在通常條件下，畢赤酵母利用甲醇表達(dá)外源蛋白過(guò)程中，甲醇同時(shí)充當(dāng)誘導(dǎo)劑、碳源和能源的角色，直接導(dǎo)致能量再生速度不足限制目標(biāo)蛋白的高效可持續(xù)表達(dá)；另一方面，甲醇代謝途徑過(guò)重的能量再生運(yùn)轉(zhuǎn)負(fù)擔(dān)還會(huì)誘發(fā)中間毒性代謝產(chǎn)物（如甲醛）的生成積累，造成細(xì)胞過(guò)早衰亡［10］。

一般來(lái)說(shuō)，重組畢赤酵母進(jìn)行干擾素表達(dá)多采用補(bǔ)料-分批發(fā)酵形式進(jìn)行，以指數(shù)形式補(bǔ)料使細(xì)胞以恒定速率生長(zhǎng)，易于實(shí)現(xiàn)菌體生長(zhǎng)的高密度，從而對(duì)重組蛋白的表達(dá)十分有利。此過(guò)程分為兩個(gè)階段：高密度流加培養(yǎng)和蛋白誘導(dǎo)表達(dá)階段。對(duì)于高密度流加培養(yǎng)過(guò)程報(bào)道主要集中在基于比生長(zhǎng)速率的最優(yōu)甲醇流加控制以及甲醇濃度的控制方面。而高生長(zhǎng)速率條件下，溶解氧通常是一個(gè)限制性因素，通過(guò)富氧提供、提高罐壓、保持培養(yǎng)液中甲醇低濃度等手段來(lái)維持和改善細(xì)胞呼吸代謝往往成為現(xiàn)有生產(chǎn)過(guò)程控制的主要方式。但提供富氧和提升罐壓，往往會(huì)造成細(xì)胞毒性和呼吸代謝受到抑制等問(wèn)題。由于甲醇充當(dāng)碳源、能源和誘導(dǎo)劑的三重角色，致使維持培養(yǎng)液中甲醇低濃度對(duì)能量/呼吸代謝也是無(wú)益的（外源蛋白的形成和生產(chǎn)過(guò)程中需要消耗大量的能量，能量的供給和儲(chǔ)存與外源蛋白表達(dá)的同化合成途徑嚴(yán)重地互相依存），同時(shí)甲醇濃度過(guò)低誘導(dǎo)強(qiáng)度不夠，蛋白表達(dá)效率將受到影響［11-13］。

本研究從pH、溫度、裝液量以及碳源流加模式等方面對(duì)畢赤酵母高密度培養(yǎng)表達(dá)雞α-干擾素的生產(chǎn)工藝進(jìn)行了摸索，并進(jìn)行了發(fā)酵規(guī)模的放大試驗(yàn)，以期獲得適用于工業(yè)化生產(chǎn)的工藝條件。而基于高密度環(huán)境條件下的能量/呼吸代謝的響應(yīng)機(jī)理正在研究之中。

4 結(jié)論

本研究首先在10 L罐規(guī)模條件下考察了pH、溫度、裝液量以及碳源流加模式對(duì)畢赤酵母高密度培養(yǎng)表達(dá)雞α-干擾素的影響，確定了最優(yōu)的生產(chǎn)工藝：在pH5.5、28℃、40%裝液量條件下，當(dāng)初始碳源耗盡的情況下，進(jìn)行甘油和甲醇混合（流加體積速率比為20∶1）脈沖流加，產(chǎn)物雞α-干擾素抗病毒活性最高，可達(dá)3×106IU/mL。在50 L發(fā)酵罐規(guī)模條件下，將該工藝進(jìn)行放大，重復(fù)20批，結(jié)果表明此過(guò)程重復(fù)性較好，且目的蛋白表達(dá)量穩(wěn)定，具有工業(yè)化生產(chǎn)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

The Improvement of Chicken Alpha Interferon Expression by a Recombinant Pichia pastoris with Cultural Condition Optimization

Jiang Zhengjun1Liu Shuhai1Wang Maochao1Cheng Quanming1Huang Jin1，2
（1. Shandong Huachen Bio-tech Co.，Ltd，Weifang 261061；2. College of Pharmaceutical Science，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014）

To achieve excellent performance of Pichia pastoris for chicken alpha interferon expression, pH value, temperature, culture volume and carbon source feeding pattern were optimized. The maximum anti-virus activity（3×106IU/mL）was harvested in the conditions of pH5.5, 28℃, and 40% culture volume in 10 L fermentor, as well as the glycerol-methanol（20∶1, V/V）co-feeding pattern was conducted when carbon source exhausted. This process was successfully scaled up to 50 L fermentor and the fermentation performance was also steady, which could be taken advantage of for its industrial application.

Pichia pastoris Chicken alpha interferon Optimization Up-scale

2013-12-03

山東省2011年科技發(fā)展計(jì)劃資助項(xiàng)目（2011GGH22109）

姜正軍，男，碩士，高級(jí)工程師，研究方向：蛋白類藥物；E-mail：sinostar5555@gmail.com

黃金，博士，副教授，研究方向：蛋白類藥物研發(fā)；E-mail：huangjin979@zjut.edu.cn