環(huán)介導等溫擴增聯(lián)合橫向流動試紙條快速檢測創(chuàng)傷弧菌檢測方法的建立

王耀煥 王瑞娜 周前進 陳炯

（寧波大學生物化學與分子生物學實驗室，寧波 315211）

環(huán)介導等溫擴增聯(lián)合橫向流動試紙條快速檢測創(chuàng)傷弧菌檢測方法的建立

王耀煥 王瑞娜 周前進 陳炯

（寧波大學生物化學與分子生物學實驗室，寧波 315211）

環(huán)介導等溫擴增技術(shù)（LAMP）與橫向流動試紙條（LFD）檢測聯(lián)合應用，建立了一種新的快速、便捷的創(chuàng)傷弧菌檢測方法。針對創(chuàng)傷弧菌的外膜蛋白TolC基因設計6條特異性引物和1條異硫氰酸熒光素（FITC）標記的探針。生物素標記的LAMP擴增產(chǎn)物能夠特異性地與FITC標記的探針雜交，雜交產(chǎn)物經(jīng)LFD檢測。優(yōu)化后的擴增溫度和時間為63℃反應35 min，加上細菌基因組DNA提取步驟，完成檢測僅需要80 min。LAMP-LFD方法可特異性地檢出創(chuàng)傷弧菌，對哈維氏弧菌等9種水產(chǎn)品常見病原菌的檢測均呈陰性；對純細菌培養(yǎng)物的檢測靈敏度為3.7×102CFU/mL或7.4 CFU/反應，是利用外引物建立的常規(guī)PCR檢測的100倍。結(jié)果表明，該方法能夠準確、快速、靈敏地檢出創(chuàng)傷弧菌，可應用于創(chuàng)傷弧菌污染的水產(chǎn)品的檢測。

創(chuàng)傷弧菌 外膜蛋白TolC基因 環(huán)介導等溫擴增技術(shù) 橫向流動試紙條檢測

創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus）為革蘭氏陰性嗜鹽弧菌，普遍存在于江河口和沿海水域環(huán)境，魚類、蝦類，以及貝母類等為主要易感水生動物［1］。該菌是人獸共患病的重要病原，人通常因生食受污染的海產(chǎn)品，或皮膚傷口接觸受污染的海水或海洋動物而感染。感染該菌可導致患者出現(xiàn)原發(fā)性敗血癥、創(chuàng)傷感染、急性胃腸炎和蜂窩織炎等臨床癥狀［2，3］。每年美國與海產(chǎn)品相關(guān)的死亡事件中95%是由于感染了創(chuàng)傷弧菌［4，5］，眾多水產(chǎn)品中，牡蠣是創(chuàng)傷弧菌最重要的傳染源，為防治該病，加利福尼亞州特

地于2003年頒布法令禁止生牡蠣銷售，取得明顯防治效果［6］。在我國，創(chuàng)傷弧菌感染多發(fā)生于沿海地區(qū)，被列為食品污染源八大高危微生物之一［7-9］。因此，建立一種快速、準確而又適用于臨床的檢測方法對于有效診斷創(chuàng)傷弧菌感染，監(jiān)測水產(chǎn)品污染具有重要的實際應用價值。

傳統(tǒng)的創(chuàng)傷弧菌診斷主要通過病原分離與生化鑒定完成，但其存在細菌培養(yǎng)繁瑣，檢測周期長，不易鑒別相近物種或亞型等缺點［10］。隨著分子生物學檢測技術(shù)的發(fā)展，以溶血素基因（Hemolysin）［11］、DNA回旋酶B亞基（gyrB）［12，13］、toxR基因［14］、RNA聚合酶σ亞基因子S（rpoS）［15］等為靶標建立的常規(guī)PCR或?qū)崟r熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)已成功應用于創(chuàng)傷弧菌的實驗室診斷，具有靈敏度高，檢測時間短等優(yōu)點，但該方法必須配備昂貴的儀器設備，需專門的操作人員。

環(huán)介導等溫擴增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是由日本學者Notomi發(fā)明的一種新式恒溫核酸擴增技術(shù)［16］，相對于PCR相關(guān)檢測技術(shù)，具有檢測時間更短，儀器依賴性小等優(yōu)點，具有應用于現(xiàn)場疫源地檢測的巨大潛力。LAMP反應產(chǎn)物可通過瓊脂糖凝膠的方法進行判定，但該方法存在操作過程易污染，易出現(xiàn)假陽性的缺點。LAMP與橫向流試紙（Lateral flow dipstick，LFD）技術(shù)聯(lián)用（LAMP-LFD），使FITC標記的探針與生物素標記的LAMP擴增產(chǎn)物進行特異性雜交，不僅可避免非特異性擴增引起的假陽性，大幅提高檢測靈敏度，還能避免因瓊脂糖凝膠電泳等檢測手段引起的體系污染問題［17，18］。該方法亦無需特殊設備，不需與EB等有毒試劑接觸，操作更加便捷和安全。

本研究根據(jù)創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白TolC基因的保守性區(qū)域設計特異性引物和探針，優(yōu)化反應條件，建立LAMP-LFD技術(shù)，旨在將該方法應用于水產(chǎn)品中創(chuàng)傷弧菌的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificusATCC 27562）、哈維氏弧菌（Vibrio harveyiATCC 33866）、河流弧菌（Vibrio fluvialisATCC 33809）購自中科院水生生物研究所；副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticusATCC 33847）由浙江省疾控中心惠贈；輪蟲弧菌（Vibrio rotiferianusDSM 17186T）由寧波大學海洋學院張德民教授惠贈；溶藻弧菌（Vibrio alginolyticusATCC 17749）、鰻弧菌香魚分離株（Vibrio anguillarumayu-H080701）［19］、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophilaAh0201）由本實驗室保存；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureusATCC 6538）、單增李斯特菌（Listeria monocytogenesATCC 19115）購自廣東省微生物菌種保藏中心。

1.2 方法

1.2.1 細菌培養(yǎng)和基因組DNA提取 試驗中使用的弧菌劃線接種于TCBS固體培養(yǎng)基上，28℃過夜培養(yǎng)后，挑取單菌落于堿性蛋白胨水中震蕩培養(yǎng)至所需濃度；嗜水氣單胞菌、金黃色葡萄球菌，以及單增李斯特菌劃線接種于BHI固體培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)后，挑取單菌落于LB或BHI培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)至所需濃度。

細菌基因組DNA的提取采用水煮法完成，主要步驟為：取1 mL細菌的液體培養(yǎng)懸液于1.5 mL離心管中，12 000 r/min離心2 min，棄上清；使用100 μL細菌裂解液（Tris-HCl 0.1 mol/L，蛋白酶K 0.2 μg/μL，Triton X-100 2.0%）充分懸浮細菌，沸水浴10 min，立即冰浴7 min；重復上一步操作1次；12 000 r/min離心2 min，取上清用作LAMP和PCR擴增的模板，-30℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設計 根據(jù)NCBI上公布的創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白TolC基因（登錄號：DQ296643），設計用于LAMP擴增的外引物TolC-F3、TolC-B3，內(nèi)引物TolC-FIP、TolC-BIP，以及環(huán)引物TolC-LF、TolCLB等6條特異性引物，同時合成TolC-HP探針1條，用于LFD的雜交試驗（表1，圖1）。在內(nèi)引物TolC-FIP的5'端標記生物素，在TolC-HP的5'端標記異硫氰酸熒光素。以上引物和探針由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。其中，外引物TolC-F3、TolC-B3同時用作PCR擴增的特異性引物，擴增的預期片段大小約為308 bp。

1.2.3 LAMP擴增條件的確立 選用創(chuàng)傷弧菌基因組DNA的2個濃度（經(jīng)平板計數(shù)法測定，較高模板

濃度相當于3.7×107CFU/mL，較低模板濃度相當于3.7×104CFU/mL）作為模板優(yōu)化擴增條件。LAMP反應體系為25 μL，包括Tris-HCl 20 mmol/L（pH 8.8），MgSO46.5 mmol/L，KCl 10 mmol/L，（NH4）2SO410 mmol/L，Triton X-100 0.1%，甜菜堿 1.6 mol/L，dNTPs 1.4 mmol/L，外引物TolC-F3和TolC-B3各0.2 μmol/L，內(nèi)引物TolC-FIP和TolC-BIP各1.6 μmol/L，環(huán)引物TolC-LF和TolC-LB各0.4 μmol/L，Bst DNA聚合酶（New England BioLabs，美國）8 U，創(chuàng)傷弧菌基因組DNA模板 2 μL。陰性對照不加任何模板DNA。反應混合物在一定溫度下溫育后，經(jīng)80℃熱激5 min終止反應，利用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物。分別以上述較高濃度和較低濃度的基因組DNA為模板，選擇10、20、35、50和65 min作為擴增反應時間65℃恒溫下進行擴增，根據(jù)擴增效果確定最佳反應時間；分別在61、62、63、64 和65℃下進行溫育至篩選的最佳反應時間，根據(jù)擴增效果確定適宜的反應溫度。

表1 根據(jù)創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白TolC基因序列設計的LAMP-LFD擴增引物序列和探針

圖1 創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白TolC基因的LAMP-LFD引物序列和探針設計示意圖

1.2.4 利用橫向流動試紙條（LFD）檢測 檢測所用試紙條購自Milennia Biotec GmbH（Milenia GenLine HybriDetect by Milenia Biotec GmbH，Germany，http：//www.milenia-biotec.de/），可通過其檢測線上標記的生物素抗體與生物素標記的LAMP擴增產(chǎn)物特異性結(jié)合完成檢測。利用優(yōu)化后的LAMP反應體系，使用經(jīng)生物素標記的內(nèi)引物TolC-FIP-biotin進行LAMP擴增反應；反應結(jié)束時不經(jīng)過終止反應，而將20 pmol的FITC標記的DNA探針TolC-HP加入到反應液中，63℃雜交5 min；取5 μL雜交液加入到100 μL buffer中混勻；將LFD試紙條浸入buffer溶液中3-5 min，肉眼判斷結(jié)果。

1.2.5 LAMP-LFD的特異性試驗 選擇水產(chǎn)品中的常見病原菌用于LAMP-LFD的特異性試驗，除創(chuàng)傷弧菌外，還包括哈維氏弧菌、河流弧菌、副溶血弧菌、輪蟲弧菌、溶藻弧菌、鰻弧菌、嗜水氣單胞菌、金黃色葡萄球菌及單增李斯特菌等9種。分別利用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳和LFD檢測擴增結(jié)果。

1.2.6 LAMP-LFD的靈敏度測定 將創(chuàng)傷弧菌的原始菌液（相當于3.7×109CFU/mL）進行連續(xù)10倍濃度梯度稀釋，按水煮法提取基因組DNA，并以此為模板，利用優(yōu)化的LAMP反應體系進行擴增。分

別利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳和LFD檢測擴增結(jié)果。同時，在相同模板濃度下，以外引物TolC-F3和TolC-B3為特異性引物，進行PCR擴增。PCR反應體系為25 μL，包括：10×PCR buffer 2.5 μL，TaqDNA 聚合酶（5 U/μL）（TaKaRa，日本）0.15 μL，dNTPs（2.5 mmol/μL）2 μL，TolC-F3（10 pmol/μL）1 μL，TolC-B3（10 pmol/μL）1 μL，基因組DNA模板 2 μL。PCR反應程序：94℃ 3 min；94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 30 s，30個循環(huán)；72℃ 10 min。擴增產(chǎn)物利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.7 LAMP-LFD的重復性試驗 重新挑取創(chuàng)傷弧菌的單菌落，培養(yǎng)后獲取新鮮創(chuàng)傷弧菌原始菌液，經(jīng)平板計數(shù)后，連續(xù)10倍濃度梯度稀釋至LAMPLFD檢測的最低濃度，平行制備3個樣品，按水煮法提取基因組DNA，并以此為模板，利用優(yōu)化的LAMP反應體系進行擴增，驗證該方法的可重復性。

2 結(jié)果

2.1 LAMP擴增條件的確立

以較高濃度基因組DNA（3.7×107CFU/mL）為模板65℃恒溫擴增時，反應10 min即可檢測到明顯擴增；反應20 min，擴增產(chǎn)物濃度幾乎達到最高值，延長反應時間，擴增產(chǎn)物濃度不再出現(xiàn)明顯提高（圖2-A）。以較低濃度基因組DNA（3.7×104CFU/mL）為模板65℃恒溫擴增時，反應10 min未能檢測到明顯擴增；反應20 min，可檢測到明顯擴增；反應35 min，擴增產(chǎn)物濃度幾乎達到最高值，延長反應時間，擴增產(chǎn)物濃度不再出現(xiàn)明顯提高（圖2-B）。為保證樣品檢測時，在較低模板濃度下仍盡可能地檢出病原，選擇LAMP擴增的最佳反應時間為35 min。

為確定最適反應溫度，以較低濃度基因組DNA（3.7×104CFU/mL）為模板，分別使用61、62、63、64和65℃ 5個不同溫度進行恒溫擴增35 min。5個反應溫度下均檢測到明顯的特異性擴增，而不添加任何DNA模板的反應管中未檢測到擴增，反應溫度為63℃時，特異性擴增中出現(xiàn)的梯形條帶最為清晰（圖3），因此選定63℃為最適反應溫度。最終確定63℃反應35 min為最適反應條件。

2.2 LAMP-LFD檢測與特異性試驗結(jié)果

按優(yōu)化的LAMP反應體系，換用生物素標記的內(nèi)引物TolC-FIP-biotin進行LAMP擴增反應。反應產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)，以創(chuàng)傷弧菌基因組DNA為模板的反應管可出現(xiàn)特征性的梯形條帶，其他9株病原菌的反應管中未見明顯擴增（圖4-A）。反應產(chǎn)物經(jīng)LFD檢測發(fā)現(xiàn)，以創(chuàng)傷弧菌基因組DNA為模板的反應產(chǎn)物可使試紙條的檢測線位置出現(xiàn)明顯的陽性條帶，其他9株病原菌的反應產(chǎn)物在試紙條的檢測線位置未出現(xiàn)條帶（圖4-B）。

圖2 LAMP反應時間的確立

圖3 LAMP反應溫度的確立

圖4 LAMP（A）和LAMP-LFD（B）特異性分析

2.3 LAMP-LFD的靈敏度測定

創(chuàng)傷弧菌原始菌液（相當于3.7×109CFU/mL）進行連續(xù)的10倍濃度梯度稀釋后，分別采用水煮方法提取其基因組DNA。以不同濃度的基因組DNA為模板進行的LAMP-LFD結(jié)果顯示，反應產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測的最低模板濃度為原始濃度的10-7倍，即3.7×102CFU/mL或7.4 CFU/反應（圖5-A）；反應產(chǎn)物經(jīng)試紙條（LFD）檢測的最低模板濃度與電泳檢測結(jié)果一致，即3.7×102CFU/mL或7.4 CFU/反應（圖5-B）。而以同批次的基因組DNA為模板進行PCR擴增，可檢測的最低模板濃度為原始濃度的10-5，即3.7×104CFU/mL或740 CFU/反應（圖5-C）。因此，LAMP-LFD方法的靈敏度是利用外引物TolC-F3、TolC-B3建立的常規(guī)PCR方法的100倍。

2.4 LAMP-LFD的重復性分析

獲取3個新鮮的創(chuàng)傷弧菌原始菌液樣品，經(jīng)平板計數(shù)后，連續(xù)的10倍梯度稀釋至最低檢測濃度（約為3.7×102CFU/mL），利用水煮方法提取基因組DNA，以此為模板進行LAMP-LFD擴增，反應產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳和LFD檢測均可獲得明顯的陽性結(jié)果（圖6），說明該方法可重復，穩(wěn)定性好。

圖5 LAMP（A）、LAMP-LFD（B）和PCR（C）檢測的靈敏度比較

3 討論

創(chuàng)傷弧菌屬于沿海海洋環(huán)境中的自然菌群之一，海水、海洋沉積物和各種水產(chǎn)品中均可分離獲得，尤以牡蠣感染率最高，由于該病原可感染人，導致患者出現(xiàn)嚴重的原發(fā)性敗血癥和壞死性創(chuàng)傷感染，因此建立快速、準確的檢測技術(shù)，有效檢測海產(chǎn)品中創(chuàng)傷弧菌的污染具有重要的公共衛(wèi)生學意義。本研究選擇創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白TolC基因作為檢測靶標，成功建立了LAMP-LFD技術(shù)。從提取細菌基因組DNA到結(jié)果判讀，整個檢測過程僅需80 min，包括擴增反應35 min，擴增產(chǎn)物LFD顯色10 min。

基于分子生物學的檢測手段中，常規(guī)PCR技

術(shù)最早應用于創(chuàng)傷弧菌檢測［11］；依賴于TaqMan 探針的RT-qPCR技術(shù)亦應用于創(chuàng)傷弧菌的實驗室診斷［14，15］。這些技術(shù)均需以較為昂貴的儀器設備為依托，尤其RT-qPCR技術(shù)對儀器設備、試劑，甚至操作環(huán)境要求較高，必須由專業(yè)人員操作，難以在多數(shù)基層檢測機構(gòu)或現(xiàn)場疫源地推廣。LAMP檢測技術(shù)具有設備依賴性小、特異性和靈敏度高等優(yōu)點，已廣泛應用于水產(chǎn)疾病檢測［20-23］。在此基礎(chǔ)上發(fā)展起來的LAMP-LFD技術(shù)，可有效避免因LAMP非特異性擴增引起的假陽性問題，使得檢測結(jié)果更加準確可信，已得到越來越多科技工作者的青睞［17，18，24，25］。本研究建立的LAMP-LFD技術(shù)可檢出的創(chuàng)傷弧菌最低濃度為3.7×102CFU/mL，即7.4 CFU/反應，檢測靈敏度是利用外引物TolC-F3、TolC-B3建立的常規(guī)PCR方法的100倍。Han等［26］以創(chuàng)傷弧菌的溶血素vvhA基因作為檢測靶標，建立了可特異性檢測創(chuàng)傷弧菌的LAMP方法，靈敏度達到了20 CFU/mL；Hossain等［27］針對groEL基因建立了可同時檢測創(chuàng)傷弧菌和霍亂弧菌的雙重PCR技術(shù)，針對創(chuàng)傷弧菌的檢測靈敏度達到了50 CFU/反應。本研究利用LFD法的檢測靈敏度與瓊脂糖凝膠電泳分析的結(jié)果一致，但LAMP-LFD法可在擴增反應結(jié)果后的10 min內(nèi)完成結(jié)果判斷，簡化了檢測流程，而且能夠避免因電泳檢測引起的體系污染問題。特異性試驗表明，該方法能特異性地檢測創(chuàng)傷弧菌，而對哈維氏弧菌等其他常見水產(chǎn)病原菌的檢測呈陰性。

圖6 LAMP（A）和LAMP-LFD（B）的重復性試驗

4 結(jié)論

以創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白TolC基因為靶標建立的LAMP-LFD技術(shù)，能夠快速、準確地檢測創(chuàng)傷弧菌，檢測靈敏度達到7.4 CFU/反應，儀器需求簡單，可滿足基層檢測機構(gòu)和現(xiàn)場疫源地檢測的需要。

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（責任編輯 狄艷紅）

Rapid Detection of Vibrio vulnificus by Loop-mediated Isothermal Amplification Combined with Lateral Flow Dipstick Assay

Wang Yaohuan Wang Ruina Zhou Qianjin Chen Jiong
（Laboratory of Biochemistry and Molecular Biology，Ningbo University，Ningbo 315211）

A novel and rapid loop-mediated isothermal amplification（LAMP）combined with chromatographic lateral flow dipstick（LFD）assay was developed to detect Vibrio vulnificus. A set of six primers and a fluorescein isothiocyanate（FITC）-labeled probe that recognized V. vulnificus outer membrane protein TolC gene were designed. Biotinylated LAMP amplicons were hybridized exclusively with the FITC-labeled probe and detected by LFD assay. The assay was optimized and could detect V. vulnificus by incubation at 63℃ for only 35 min, and the whole detection procedure from extraction of bacterial genomic DNA to the visualization of the amplicons by LFD last 80 min. V. vulnificus could be accurately detected by LAMP-LFD, and no amplification could be observed when another 9 bacterial genomic DNA were used. The sensitivity for V. vulnificus detection in pure culture was 3.7×102CFU/mL or equivalent to 7.4 CFU per reaction, which is 100 times higher than that of PCR assay. The results indicate that LAMP-LFD is an accurate, rapid and sensitive tool for V. vulnificus detection and can be used for detection of V. vulnificus in contaminated aquatic foods.

Vibrio vulnificus Outer membrane protein TolC gene Loop-mediated isothermal amplification Lateral flow dipstick assay detection

2013-10-23

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（“863”計劃）（2012AA020101，2012AA092001），寧波大學學科項目（xk11341）

王耀煥，男，研究方向：生物技術(shù)；E-mail：wangyaohuan5949@163.com

周前進，男，博士，講師，研究方向：動物疫病診斷技術(shù)；E-mail：mumu2325@163.com