糖心樂對糖尿病心肌病大鼠心肌酶及心肌轉化生長因子β1的影響

趙莉平 安 榮 丁 雯 李彥魁 丁延平

1.陜西中醫(yī)學院醫(yī)學技術系，陜西咸陽712046；2.陜西中醫(yī)學院針灸推拿系，陜西咸陽712046

糖心樂對糖尿病心肌病大鼠心肌酶及心肌轉化生長因子β1的影響

趙莉平1安 榮1丁 雯2李彥魁1丁延平1

1.陜西中醫(yī)學院醫(yī)學技術系，陜西咸陽712046；2.陜西中醫(yī)學院針灸推拿系，陜西咸陽712046

目的探討糖心樂（TXL）對糖尿病心肌病大鼠心肌酶、心肌轉化生長因子β1（TGF-β1）表達的影響。方法SD大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素建立糖尿病模型，8周后形成糖尿病心肌病模型，隨機分為模型對照組、達美康對照組、TXT大、小劑量組，各組大鼠均為12只，另設正常SD大鼠10只作為正常對照組。達美康對照組、TXL大、小劑量組分別給予3 mg/mL達美康混懸液、2 g/mL TXL、1 g/mL TXL灌胃治療，模型對照組給予生理鹽水灌胃。治療4周后處死，取血檢測血糖、肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH），切取心肌組織，免疫組化法檢測TGF-β1表達情況。結果與模型對照組比較，TXL大劑量組血糖明顯降低[（10.54±2.06）mmol/L比（23.16±5.74）mmol/L]，CK、LDH明顯升高[（120.57±18.83）U/mg比（78.26±12.01）U/mg，（5052.06±418.64）U/mg比（3784.15±349.62）U/mg]；TGF-β1陽性染色顆粒的平均光密度（MOD）降低[（0.148±0.006）比（0.262±0.008）]；差異均有高度統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）。結論TXL對糖尿病大鼠有一定的降血糖作用，可減少心肌酶漏出，改善心肌能量代謝，同時降低心肌中TGF-β1的表達，減慢心肌組織纖維化進程，延緩和改善糖尿病心肌病的心肌損傷。

糖心樂；糖尿病心肌?。谎?；心肌酶；心肌轉化生長因子β1

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCMP）是指糖尿病（diabetesmellitus，DM）患者心肌細胞原發(fā)性損傷，引起廣泛的結構異常，最終導致左心室肥厚、心肌收縮和（或）舒張功能障礙的一種疾病狀態(tài)。糖心樂（TXL）遵循中醫(yī)辨證與西醫(yī)辨病相結合的治療原則，在前人臨床研究和經(jīng)驗方的基礎上，以及在中藥藥理機制研究的前提下，組成的中藥復方，它具有多環(huán)節(jié)、多層次、多靶點的整合調節(jié)優(yōu)勢。本研究應用鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）造成持續(xù)高血糖狀態(tài)誘導形成DCMP模型，觀察TXL對糖尿病大鼠血糖、心肌酶和心肌轉化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8周齡清潔級SD大鼠80只，雌雄各40只，體重范圍在170～200 g，該批實驗動物從第四軍醫(yī)大學實驗動物中心處購買，合格證號：SCXK（軍）2012-006。實驗期間要求實驗室定時通風，室溫保持在18～22℃，相對濕度60%～80%，保持自然光照，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲食、飲水。

1.2 藥物

STZ由美國Sigma公司生產(chǎn)，100 mg/支，批號SL12136；所購藥物達美康為陜西東盛（集團）有限公司生產(chǎn)，規(guī)格80 mg/片，批號P2012121214203231。TXL的制備：將絞股藍、人參、生石膏、麥冬、田三七等中藥材用水煎3次，每次30 min，將3次的過濾液統(tǒng)一收集蒸發(fā)為含生藥濃度分別為2 g/mL和1 g/mL的兩種湯劑。

1.3 試劑

葡萄糖（GLU）、肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）測定試劑盒均購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；兔抗鼠TGF-β1多克隆抗體（一抗）、辣根過氧化酶標記的IgG（二抗）、DAB顯色試劑盒均為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品。0.1M磷酸鹽緩沖液（pH 7.2～7.4）：稱取8.5 g NaCl、4.4 g Na2HPO4·2H2O、0.3 g NaH2PO4·2H2O，加蒸餾水至1000 mL。

1.4 儀器

FA1004N型電子天平、LKD-2188型超薄切片機、BS-800全自動生化分析儀。

1.5 方法

1.5.1 實驗動物造模及分組隨機選取SD大鼠共10只，雌5只，雄5只，將此10只大鼠作為正常對照組，剩余70只大鼠禁食（不禁水）12 h后，用濃度為0.55% STZ以55 mg/kg劑量一次性腹腔注射，0.55%STZ用0.1mol/L枸櫞酸鹽緩沖液（pH 4.4）配制而成。正常對照組腹腔內注射等體積枸櫞酸鹽緩沖液[1]。1周后測血糖，血糖大于13.8 mmol/L則為DM造模成功者[2]，剔除13只血糖小于13.8 mmol/L的大鼠，DM造模成功大鼠共57只。另外隨機選取DM大鼠48只，雌雄各為24只，分為模型對照組、達美康對照組、TXL大劑量組和小劑量組，每組雌雄大鼠各6只，用常規(guī)飼料飼養(yǎng)，8周后形成DMCP模型大鼠[3]。

1.5.2 給藥方法DCMP大鼠模型形成后，TXL大劑量組用高濃度（2 g/mL）湯劑以高劑量（14 g/kg·d）灌胃；TXL小劑量組用低濃度（1 g/mL）湯劑以低劑量[7 g/（kg·d）]灌胃；達美康組用混懸液（濃度為3mg/mL）灌胃[劑量為20mg/（kg·d）]；每日1次，用藥連續(xù)治療4周。正常對照組和模型對照組同時均用生理鹽水灌胃[劑量為6.5 g/（kg·d）]。

1.6 指標檢測

1.6.1 血糖測定分別于造模1、8周（治療前）及12周（治療后）禁食12 h，大鼠內眥靜脈取血后采用葡萄糖氧化酶法測定血糖。

1.6.2 心肌CK、LDH測定12周末麻醉處死動物，迅速打開胸腔取左心室的前壁心肌組織0.1 g，用4℃生理鹽水稀釋制成勻漿液，濃度為10%，快速離心留取上清液，用CK、LDH測定試劑盒檢測其含量。

1.6.3 心肌TGF-β1測定取大鼠左心室前壁心肌組織剩余部分，用10%福爾馬林液保存固定12 h后，常規(guī)石蠟包埋，用組織切片機以厚度4μm切片，貼附于涂有多聚賴氨酸的玻片備用。采用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶（SP）法，按試劑盒說明進行操作。選用磷酸鹽緩沖液替代一抗作為實驗陰性對照，光鏡下（400×）觀察，心肌細胞內、外觀察到棕黃色物質定為TGF-β1染色陽性。圖像分析采用Image-Pro Plus軟件，每份標本的測量要求隨機選取5個視野，測量各組TGF-β1陽性染色顆粒的平均光密度值（mean optical density，MOD）。MOD越大，表示TGF-β1表達越強。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用LSD-t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 動物情況

整個實驗過程中，共有5只大鼠死亡：其中模型對照組2只雄性和1只雌性死亡，TXL大劑量組1只雄性死亡，小劑量組1只雄性死亡，其他各組均未出現(xiàn)大鼠死亡。其原因可能是由于血糖過高所導致出現(xiàn)糖尿病酮癥酸中毒、感染和其他并發(fā)癥所致大鼠死亡。

2.2 TXL對DCMP大鼠血糖含量的影響

造模1、8、12周時，與正常對照組比較，模型對照組、達美康對照組、TXL大劑量組、TXL小劑量組血糖含量升高明顯，差異均有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01），說明各組大鼠一直處于高血糖狀態(tài)。造模12周（治療4周）時，與模型對照組比較，達美康對照組、TXL大劑量組和TXL小劑量組血糖含量也降低，差異均有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01），說明達美康及TXL大、小劑量對糖尿病鼠均有降糖作用。與達美康對照組比較，TXL大劑量組血糖升高不明顯，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），說明大劑量組降糖作用與達美康對照組相當，TXL小劑量組血糖升高明顯，差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01），說明小劑量組降糖作用不及達美康對照組和TXL大劑量組。見表1。

表1 各組大鼠空腹血糖比較（mmol/L，±s）

表1 各組大鼠空腹血糖比較（mmol/L，±s）

注：與同期正常對照組比較，★P＜0.01；與同期模型對照組比較，▲P＜0.01；與同期達美康對照組比較，■P＜0.01；TXL：糖心樂

組別只數(shù)造模1周造模8周造模12周正常對照組模型對照組達美康對照組TXL小劑量組TXL大劑量組10 9 12 11 11 5.58±1.02 18.64±3.95★18.60±3.01★18.26±2.63★18.89±3.86★5.92±1.37 20.16±3.82★20.24±2.89★20.91±3.51★19.75±4.11★6.69±1.27 23.16±5.74★10.54±2.06★▲16.34±2.92★▲■11.70±2.45★▲

2.3 TXL對DCMP大鼠心肌酶含量的影響

治療4周后，與正常對照組比較，模型對照組、達美康對照組、TXL大劑量組、TXL小劑量組大鼠心肌CK、LDH含量均明顯下降，差異均有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型對照組比較，達美康對照組和TXL大劑量組心肌CK、LDH含量升高，差異均有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01），TXL小劑量組心肌中LDH含量上升，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），CK含量無明顯變化（P＞0.05）；與達美康對照組比較，TXL大劑量組心肌組織中CK、LDH降低，但差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），TXL小劑量組心肌CK、LDH均降低，差異均有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01），說明TXL大劑量組升高心肌酶作用與達美康對照組相當，而TXL小劑量組升高心肌酶作用不及達美康和TXL大劑量組。見表2。

表2 各組大鼠心肌酶含量比較（U/mg，±s）

表2 各組大鼠心肌酶含量比較（U/mg，±s）

注：與正常對照組比較，★P＜0.01；與模型對照組比較，△P＜0.05，▲P＜0.01；與達美康對照組比較，□P＜0.01；TXL：糖心樂；CK：肌酸激酶；LDH：乳酸脫氫酶

組別只數(shù)CK LDH正常對照組模型對照組達美康對照組TXL小劑量組TXL大劑量組10 9 12 11 11 164.17±14.18 78.26±12.01★127.42±19.03★▲89.74±17.55★□120.57±18.83★▲6435.91±451.06 3784.15±349.62★5177.08±422.59★▲4375.22±398.35★△□5052.06±418.64★▲

2.4 TXL對DCMP大鼠TGF-β1表達的影響

治療4周后，與正常對照組比較，模型對照組、達美康對照組及TXL大、小劑量組TGF-β1表達升高，差異均有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型對照組比較，達美康對照組和TXL大劑量組TGF-β1表達均降低，差異均有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01），TXL小劑量組TGF-β1表達有所降低，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與達美康對照組比較，TXL大劑量組TGF-β1表達升高，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），而TXL小劑量組TGF-β1表達升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明TXL大劑量組降低TGF-β1表達的作用與達美康對照組相當，而TXL小劑量組降低TGF-β1表達的作用不及達美康對照組和TXL大劑量組。見表3。

表3 各組大鼠心肌轉化生長因子β1表達的比較（±s）

表3 各組大鼠心肌轉化生長因子β1表達的比較（±s）

注：與正常對照組比較，★P＜0.01；與模型對照組比較，▲P＜0.01；與達美康對照組比較，□P＜0.05；TXL：糖心樂；MOD：平均積分光密度

組別只數(shù)MOD正常對照組模型對照組達美康對照組TXL小劑量組TXL大劑量組10 9 12 11 11 0.060±0.011 0.262±0.008★0.131±0.010★▲0.228±0.007★□0.148±0.006★▲

3 討論

本實驗首先采用腹腔注射STZ損傷大鼠胰腺誘導糖尿病模型，給藥途徑選擇腹腔注射法，損傷小，一次性注射后即可出現(xiàn)穩(wěn)定高血糖狀態(tài)，方法簡單，選擇大鼠作為造模動物，是因為大鼠胰腺B細胞對STZ作用，敏感性較強且穩(wěn)定[4]，造模1周后即能出現(xiàn)高血糖狀態(tài)，8周后進展形成為DCMP大鼠模型[3]。實驗中經(jīng)動態(tài)檢測血糖顯示造模各組大鼠一直處于糖尿病的高血糖狀態(tài)，持續(xù)的高血糖，造成葡萄糖毒性影響心肌細胞線粒體功能，影響心肌組織的能量供應，使心肌細胞凋亡增加，最終導致心肌的收縮舒張功能障礙，形成DCMP。

多種酶參與到心肌組織能量的供應過程中，LDH可催化乳酸使其氧化為丙酮酸，因此能更有效地給心肌組織提供三磷酸腺苷（ATP）；CK可催化肌酸和ATP，使其生成磷酸肌酸，更有利于能量儲備及利用。由于DCMP長期的高血糖引起的心肌細胞損傷，可引起心肌細胞內CK和LDH的外漏，導致心肌組織中二者消耗增加[5]，細胞能量代謝降低，能量供應和儲備不足，致使心肌細胞左心室出現(xiàn)代償性重塑和肥厚，具體則表現(xiàn)為收縮和舒張充盈功能的改變[6]。

實驗結果表明TXL對糖尿病大鼠有一定的降血糖作用，中藥復方TXL制劑由人參、生石膏、麥冬、絞股藍、田三七等[7]制成，該組方用藥體現(xiàn)了中醫(yī)辨證論治的長處，并且兼顧益氣、清熱、養(yǎng)陰、活血化瘀等觀念?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，人參可從多種途徑發(fā)揮降糖作用，人參中含有人參總苷、人參多糖和人參多肽，這些物質均具有降血糖作用，血糖含量減低，使心肌中的糖原沉積量隨之減少，最終達到對抗由高血糖狀態(tài)所導致的心肌細胞損害。三七中含有的三七皂苷C1，可促使糖尿病小鼠肝糖原合成量增加，連續(xù)給藥情況下，降糖效果隨之增強[8]。麥冬中所含有的有效成分麥冬多糖也具有明顯降血糖功效，它可以對抗因腎上腺素含量降低而引起的動物血糖升高[9]。絞股藍中的四氧嘧啶對糖尿病小鼠也有明顯的降血糖效果[10]。實驗中TXL大劑量組大鼠的CK和LDH含量明顯升高，其原因可能是由于TXL可減輕心肌細胞膜的損傷，穩(wěn)定心肌細胞膜，有效減少CK與LDH等酶的漏出，糾正心肌細胞能量代謝障礙，增加心肌收縮和舒張能量的供應儲備，保護心肌細胞，改善心臟的功能。

TGF-β1是一種多功能的細胞因子，對細胞的生長、分化和免疫功能都有重要作用，主要調節(jié)細胞外基質的形成。TGF-β1表達增加可使許多細胞，如成纖維細胞等細胞合成膠原蛋白、蛋白多糖、纖維連接蛋白等含量增加，加速相應膠原基因的表達[11]，同時它還能通過抑制蛋白酶合成、增加蛋白酶原激活抑制物來減少降解細胞外基質，在組織纖維化的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要作用。研究表明，TGF-β1在DM時表達增強，能刺激心臟成纖維細胞中的Ⅰ型和Ⅲ型膠原基因表達增加，下調膠原酶活性，從而達到減少膠原降解的作用[12-15]。

綜上所述，本實驗結果表明TXL可降低TGF-β1在DCMP大鼠心肌中的表達，表明TXL可減輕心肌組織纖維化，有助于延緩DCMP進程，可能是由于血糖降低本身，對TGF-β1的直接抑制作用，或是由于糖基化終末產(chǎn)物減緩刺激腎素-血管緊張素系統(tǒng)在DCMP中的活性，其機制有待進一步研究。

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Effects of Tangxinle on m yocardial enzyme and transform ing grow th factor-β1in ratsw ith diabetic cardiom yopathy

ZHAO Liping1AN Rong1DINGWen2LIYankui1DING Yanping1
1.Department of Medical Technology,Shaanxi University of Chinese Medicine,Shaanxi Province,Xianyang 712046 China;2.Department of Acupuncture and Manipulation,Shaanxi University of Chinese Medicine,Shaanxi Province, Xianyang 712046,China

Ob jective To explore the effects of Tangxinle(TXL)onmyocardial enzyme and transforming growth factor-β1(TGF-β1)in experimental ratswith diabetic cardiomyopathy.Methods Diabetesmodelwasestablished with streptozotocin by intraperitoneal injection in Sprague-Dawley rats,after 8 weeks diabetes cardiomyopathy model was formed,then diabetic cardiomyopathy ratswere random ly divided into four groups:model control group,the Diamicron control group, TXL high-dose group,TXL small-dose group,12 rats in each group,10 normal rats were as the normal control group. Diamicron control group,TXL high-dose group,TXL small-dose group were given 3 mg/mL of Diamicron suspension, 2 g/mL TXL,1 g/mL TXL lavage treatment respectively,themodel control group was given normal saline lavage.Rats of five groupswere killed after 4 weeks treatment.Blood glucose,creatine kinase(CK)and lactic dehydrogenase(LDH) were detected,and the expression of TGF-β1in five groups were detected by immunohistochemistry method.Results Compared with model control group,TXL high-dose group fasting blood glucose decreased obviously[(10.54±2.06) mmol/L vs(23.16±5.74)mmol/L];CK and LDH increased remarkably[(120.57±18.83)U/mg vs(78.26±12.01)U/mg; (5052.06±418.64)U/mg vs(3784.15±349.62)U/mg];the average absorbance value of staining positive particles TGF-β1inmyocardial cell reduced[(0.148±0.006)vs(0.262±0.008)],the differenceswere statistically significant(all P＜0.01). Conclusion TXL has a certain hypoglycemic effect on diabetic rats,it can reduce the myocardial enzyme leakage to improve the metabolic disorder of energy,meanwhile it can reduce the expression of TGF-β1to slow down fibrous degeneration inmyocardial tissue and delay development of diabetic cardiomyopathy.

Tangxinle;Diabetic cardiomyopathy;Blood glucose;Myocardial enzyme;TGF-β1

R542.2

A

1673-7210（2014）08（a）-0016-04

2014-05-19本文編輯：任念）

陜西省教育廳科學研究計劃項目（編號11JK0718）。

趙莉平（1979.1-），女，碩士研究生；研究方向：檢驗診斷。