六氯苯與雌二醇共存時內(nèi)分泌干擾活性拮抗效應及其機制研究

張盼月　張光明　郎朗

摘要：以典型天然雌激素雌二醇為代表，以人體乳腺癌細胞MCF-7增殖為手段，檢驗了六氯苯與雌二醇共同作用時的內(nèi)分泌干擾活性及其機理.結(jié)果發(fā)現(xiàn)六氯苯具有強烈的內(nèi)分泌干擾活性，但與雌二醇混合后，呈現(xiàn)明顯的拮抗效應，內(nèi)分泌干擾活性被顯著抑制.機理分析表明六氯苯、雌二醇、二者混合物都可以干擾雌激素受體和胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）信號通路、激活轉(zhuǎn)錄因子、誘導細胞增殖.路徑分析表明，六氯苯與雌二醇的拮抗作用與雌激素受體通路無關，主要原因是雌二醇降低了六氯苯對ERK的活化程度、降低了p-ERK蛋白的表達、從而干擾了絲裂原活化蛋白激酶信號轉(zhuǎn)導.轉(zhuǎn)錄因子分析表明，雌二醇弱化六氯苯內(nèi)分泌干擾活性的主要原因是降低了c-Myc蛋白表達.上述發(fā)現(xiàn)為六氯苯的控制提供了理論依據(jù).

關鍵詞：雌二醇；六氯苯；雌激素活性；拮抗；ERK信號通路；機理

中圖分類號：X703.1 文獻標識碼：A

內(nèi)分泌干擾物（EDCs）具有生物內(nèi)分泌干擾活性、可破壞免疫系統(tǒng)、引起多種器官和神經(jīng)損傷，是目前國際研究熱點[1].我國多地檢出多種EDCs，其典型代表是六氯苯（HCB）[2].環(huán)境中的六氯苯進入生物體后，必然與天然雌激素共同發(fā)揮作用.而這方面的研究未見報導.

研究發(fā)現(xiàn)，有的物質(zhì)混合時出現(xiàn)明顯的協(xié)同作用，如Dieldrin，Toxaphene，Endosulfan和Chlordane任何兩種混合，雌激素反應強度可增加160～1 600倍[3].雙酚A、異黃酮、壬基酚在低濃度下也出現(xiàn)明顯協(xié)同[4-5].與此同時，也有報道發(fā)現(xiàn)狄氏劑和毒殺酚混合后雌激素效應無協(xié)同作用[6]；而鎘與E2之間甚至出現(xiàn)了拮抗作用[7].上述現(xiàn)象表明不同EDC的混合效應不同、作用機制不同，需要逐一研究.本文選擇天然雌激的代表雌二醇（E2），研究它與六氯苯共同作用時的內(nèi)分泌干擾活性及其作用機制.

1材料與方法

人體乳腺癌細胞MCF7來自哈爾濱工業(yè)大學生物系，屬ATCC細胞系.酶與蛋白標樣購自美國Sigma公司.化學試劑購自美國Ameresco公司.根據(jù)六氯苯的毒性檢測結(jié)果和生物體內(nèi)E2濃度，單獨投加六氯苯濃度為10-8 mol/L，單獨投加E2的濃度為10-12mol/L，混合物的濃度為二者各取一半.所用主要設備包括GeneAmp PCR System 9700（Applied Biosystems公司），DYY6B電泳儀（北京市六一儀器廠），蛋白質(zhì)電泳及Western雜交轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（BioRad），LSM Meta510 激光共聚焦儀（Zeiss公司）和IGO 150二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo公司）.

雌激素活性檢測采用經(jīng)典EScreen法，細胞增殖效應（PE）為實驗組的吸光度平均值與溶劑對照組吸光度平均值的比值[2].

采用WESTERN BLOT法測定乳腺癌MCF7細胞內(nèi)雌激素受體α蛋白，以及絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號轉(zhuǎn)導通路相關蛋白.該方法可檢測到低至10pg的EDC干擾效應[8].以βTublin蛋白作為內(nèi)參照，對目的蛋白表達量進行校正[9].采用RTPCR法測定EDCs干擾效應相關的轉(zhuǎn)錄因子，具體步驟為：細胞培養(yǎng)、RNA抽提、分離、沉淀、洗脫、再溶解、定量、逆轉(zhuǎn)錄、聚合酶鏈式反應、電泳鑒定[2].

每次試驗均進行三組平行試驗，每組平行實驗設定6個平行樣，共18個樣品，最終實驗數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS13.0方差分析進行處理.

2 結(jié)果與討論

2.1六氯苯與雌二醇混合后內(nèi)分泌干擾活性研究

首先考察E2與六氯苯的混合對其內(nèi)分泌干擾活性的影響，結(jié)果見圖1.圖1表明六氯苯明顯促進MCF7細胞增殖效應，E2在48 h時的細胞增殖效應最強，96 h時二者均失去增殖效應.二者混合后產(chǎn)生明顯的拮抗效應，在24 h時甚至比溶劑對照組弱.這一現(xiàn)象十分重要，意味著天然雌激素對六氯苯的內(nèi)分泌干擾活性存在強烈的抑制，可以有效消除其內(nèi)分泌干擾活性，對于保護生物體內(nèi)分泌系統(tǒng)穩(wěn)定具有重要作用.本文的結(jié)果來源于單一濃度實驗，這一拮抗現(xiàn)象并非決定性的結(jié)論，不同實驗條件下二者的混合效應需要進一步的實驗驗證.

2.2內(nèi)分泌干擾活性路徑分析

接下來研究E2，六氯苯、兩者混合物的內(nèi)分泌干擾活性路徑.EDCs干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)活動的路徑有多種.其中最常見的是與生物體內(nèi)的雌激素受體（ER）結(jié)合，阻止天然雌激素作用，被稱為經(jīng)典路徑；此外，EDCs還可以通過非經(jīng)典路徑如MAPK通路發(fā)揮作用.本文同時考察了二者.

2.2.2非經(jīng)典路徑分析

圖2表明經(jīng)典路徑不是E2抑制六氯苯的路徑，拮抗效應可能通過MAPK信號通路起作用.MAPK信號通路中最重要的一條是外界因子激活細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）[10]，活化的ERK磷酸化多種核轉(zhuǎn)錄因子，進而參與調(diào)控雌激素活性，調(diào)節(jié)增殖相關蛋白的合成與表達.ERK的激活情況如圖3所示，E2使ERK蛋白表達量升高，六氯苯使ERK蛋白的表達量降低，混合物作用時效果與六氯苯單獨作用時接近，遠低于E2的單獨作用.

被激活的ERK蛋白轉(zhuǎn)變成pERK蛋白，如圖4所示.六氯苯能夠強烈地誘導pERK蛋白的表達，混合物對pERK蛋白表達的誘導能力與雌二醇單獨作用時強度相當、遠低于六氯苯的單獨作用.因此，推測雌二醇弱化六氯苯內(nèi)分泌干擾活性的途徑主要是通過干擾ERK的活化，降低了pERK蛋白的表達.

2.3.3cJun基因

試驗發(fā)現(xiàn)，E2，六氯苯，混合物均能使cJun基因表達量下降8%～13%，差異缺乏顯著性.說明E2與六氯苯的拮抗作用與cJun基因表達無密切關系.

3 結(jié)論

本文研究了典型環(huán)境內(nèi)分泌干擾物六氯苯與天然雌激素雌二醇共存時對人體乳腺癌細胞MCF7的增殖效應.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，六氯苯與雌二醇均有較強的內(nèi)分泌干擾活性、可誘導MCF7細胞增殖；二者共存時呈現(xiàn)明顯的拮抗作用，這對減輕六氯苯的內(nèi)分泌干擾活性具有重要意義.由于本文是單一濃度實驗，該結(jié)論尚需進一步梯度實驗確認.機理研究表明，雌二醇可通過雌激素受體通路及MAPK通路發(fā)揮作用、增加DNA分裂期細胞比例.六氯苯也可以通過上述路徑發(fā)揮作用、同時增加DNA分裂期及間歇期的細胞比例、促進細胞增殖.二者混合后，拮抗效應主要是通過MAPK信號通路實現(xiàn)，降低pERK蛋白的表達、進而減弱cFos基因表達.

參考文獻

[1]WITORSCH R J. Endocrine disruptors： can biological effects and environmental risks be predicted？ [J]. Regul Toxicol Pharmacol， 2002， 36（1）： 118-130.

[2]郎朗. E2與飲用水中典型環(huán)境雌激素共存時內(nèi)分泌干擾活性研究[D]. 哈爾濱：哈爾濱工業(yè)大學市政環(huán)境工程學院，2011.

[3]YI J， KWON H， CHO J， et al. Estrogen and hypoxia regulate estrogen receptor alpha in a synergistic manner[J]. Biochem Biophys Res Commun，2009， 378（4）： 842-846.

[4]RAJAPAKSE J， SILVA E， KORTENKAMP A. Combining xenoestrogens at levels below individual no-observed-effect concentration dramatically enhances steroid hormone action[J]. Environmental Health Perspective，2002， 110（9）： 917-921.

[5]RAMAMOORTHY A， VYHLIDAL C， WANG F， et al. Estrogenic activity of a dieldrin/ toxaphene mixture in the mouse uterus， MCF7 human breast cancer cells，and yeast-based estrogen receptor assays： no apparent synergism[J]. Endocrinol，1997， 138： 1520-1527.

[6]張盼月，張光明，朗朗.雌二醇強化壬基酚雄性毒性機理研究[J].湖南大學學報：自然科學版，2012，39（11）：78-81.

[7]張光明，張盼月，朗朗.雌二醇與鎘雌激素活性拮抗效應及其機制研究[J].湖南大學學報：自然科學版，2013，40（3）：83-86.

[8]RADICE S， CHIESARA E， FUCILE S. Different effects of PCB101， PCB118， PCB138 and PCB153 alone or mixed in MCF7 breast cancer cells [J]. Food Chem Toxicol， 2008， 46： 2561-2567.

[9]劉志恒.現(xiàn)代微生物學[M].北京：科學出版社，2002：487-509.

[10]SADLER J， PUGAZHENDHI D， DARBRE P. Use of global gene expression patterns in mechanistic studies of oestrogen action in MCF7 human breast cancer cells [J]. J Steroid Biochem Mol Biol， 2009， 114（1/2）： 21-32.

[11]SHIH Y W， SHIEH J M， WU P F. α-Tomatine inactivates PI3K/Akt and ERK signaling pathways in human lung adenocarcinoma A549 cells： Effect on metastasis [J]. Food Chem Toxicol， 2009， 47： 1985-1995.

[12]ANDREI L， GARTEL D， KSENYA S. Mechanisms of cmycmediated transcriptional repression of growth arrest genes[J]. Exp Cell Res， 2003， 283： 17-21.

[13]ALISON J B， CATRIONA M M， ELIZABETH M. A comparison of fecal occultblood tests for colorectalcancer screening[J]. Endocr Relat Cancer， 2005， 12： 47-53.

參考文獻

[1]WITORSCH R J. Endocrine disruptors： can biological effects and environmental risks be predicted？ [J]. Regul Toxicol Pharmacol， 2002， 36（1）： 118-130.

[2]郎朗. E2與飲用水中典型環(huán)境雌激素共存時內(nèi)分泌干擾活性研究[D]. 哈爾濱：哈爾濱工業(yè)大學市政環(huán)境工程學院，2011.

[3]YI J， KWON H， CHO J， et al. Estrogen and hypoxia regulate estrogen receptor alpha in a synergistic manner[J]. Biochem Biophys Res Commun，2009， 378（4）： 842-846.

[4]RAJAPAKSE J， SILVA E， KORTENKAMP A. Combining xenoestrogens at levels below individual no-observed-effect concentration dramatically enhances steroid hormone action[J]. Environmental Health Perspective，2002， 110（9）： 917-921.

[5]RAMAMOORTHY A， VYHLIDAL C， WANG F， et al. Estrogenic activity of a dieldrin/ toxaphene mixture in the mouse uterus， MCF7 human breast cancer cells，and yeast-based estrogen receptor assays： no apparent synergism[J]. Endocrinol，1997， 138： 1520-1527.

[6]張盼月，張光明，朗朗.雌二醇強化壬基酚雄性毒性機理研究[J].湖南大學學報：自然科學版，2012，39（11）：78-81.

[7]張光明，張盼月，朗朗.雌二醇與鎘雌激素活性拮抗效應及其機制研究[J].湖南大學學報：自然科學版，2013，40（3）：83-86.

[8]RADICE S， CHIESARA E， FUCILE S. Different effects of PCB101， PCB118， PCB138 and PCB153 alone or mixed in MCF7 breast cancer cells [J]. Food Chem Toxicol， 2008， 46： 2561-2567.

[9]劉志恒.現(xiàn)代微生物學[M].北京：科學出版社，2002：487-509.

[10]SADLER J， PUGAZHENDHI D， DARBRE P. Use of global gene expression patterns in mechanistic studies of oestrogen action in MCF7 human breast cancer cells [J]. J Steroid Biochem Mol Biol， 2009， 114（1/2）： 21-32.

[11]SHIH Y W， SHIEH J M， WU P F. α-Tomatine inactivates PI3K/Akt and ERK signaling pathways in human lung adenocarcinoma A549 cells： Effect on metastasis [J]. Food Chem Toxicol， 2009， 47： 1985-1995.

[12]ANDREI L， GARTEL D， KSENYA S. Mechanisms of cmycmediated transcriptional repression of growth arrest genes[J]. Exp Cell Res， 2003， 283： 17-21.

[13]ALISON J B， CATRIONA M M， ELIZABETH M. A comparison of fecal occultblood tests for colorectalcancer screening[J]. Endocr Relat Cancer， 2005， 12： 47-53.

參考文獻

[1]WITORSCH R J. Endocrine disruptors： can biological effects and environmental risks be predicted？ [J]. Regul Toxicol Pharmacol， 2002， 36（1）： 118-130.

[2]郎朗. E2與飲用水中典型環(huán)境雌激素共存時內(nèi)分泌干擾活性研究[D]. 哈爾濱：哈爾濱工業(yè)大學市政環(huán)境工程學院，2011.

[3]YI J， KWON H， CHO J， et al. Estrogen and hypoxia regulate estrogen receptor alpha in a synergistic manner[J]. Biochem Biophys Res Commun，2009， 378（4）： 842-846.

[4]RAJAPAKSE J， SILVA E， KORTENKAMP A. Combining xenoestrogens at levels below individual no-observed-effect concentration dramatically enhances steroid hormone action[J]. Environmental Health Perspective，2002， 110（9）： 917-921.

[5]RAMAMOORTHY A， VYHLIDAL C， WANG F， et al. Estrogenic activity of a dieldrin/ toxaphene mixture in the mouse uterus， MCF7 human breast cancer cells，and yeast-based estrogen receptor assays： no apparent synergism[J]. Endocrinol，1997， 138： 1520-1527.

[6]張盼月，張光明，朗朗.雌二醇強化壬基酚雄性毒性機理研究[J].湖南大學學報：自然科學版，2012，39（11）：78-81.

[7]張光明，張盼月，朗朗.雌二醇與鎘雌激素活性拮抗效應及其機制研究[J].湖南大學學報：自然科學版，2013，40（3）：83-86.

[8]RADICE S， CHIESARA E， FUCILE S. Different effects of PCB101， PCB118， PCB138 and PCB153 alone or mixed in MCF7 breast cancer cells [J]. Food Chem Toxicol， 2008， 46： 2561-2567.

[9]劉志恒.現(xiàn)代微生物學[M].北京：科學出版社，2002：487-509.

[10]SADLER J， PUGAZHENDHI D， DARBRE P. Use of global gene expression patterns in mechanistic studies of oestrogen action in MCF7 human breast cancer cells [J]. J Steroid Biochem Mol Biol， 2009， 114（1/2）： 21-32.

[11]SHIH Y W， SHIEH J M， WU P F. α-Tomatine inactivates PI3K/Akt and ERK signaling pathways in human lung adenocarcinoma A549 cells： Effect on metastasis [J]. Food Chem Toxicol， 2009， 47： 1985-1995.

[12]ANDREI L， GARTEL D， KSENYA S. Mechanisms of cmycmediated transcriptional repression of growth arrest genes[J]. Exp Cell Res， 2003， 283： 17-21.

[13]ALISON J B， CATRIONA M M， ELIZABETH M. A comparison of fecal occultblood tests for colorectalcancer screening[J]. Endocr Relat Cancer， 2005， 12： 47-53.