解聚復腎寧對糖尿病大鼠腎臟PKC和TGF-β1的影響

陳益山，曹文富（.重慶市石柱縣中醫(yī)院，重慶 石柱 40900；.重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，重慶 40006）

解聚復腎寧對糖尿病大鼠腎臟PKC和TGF-β1的影響

陳益山1，曹文富2
（1.重慶市石柱縣中醫(yī)院，重慶 石柱 409100；2.重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，重慶 400016）

目的：觀察中藥復方解聚復腎寧（JJFSN）對糖尿?。―M）大鼠腎臟PKC和TGF-β1的影響及腎保護作用。方法：建立STZ誘導的糖尿病SD大鼠模型，將成模糖尿病大鼠隨機分成模型組、解聚復腎寧組、厄貝沙坦組、厄貝沙坦加解聚復腎寧組，同時設正常對照組。各組大鼠采用相應的干預措施處理12周。常規(guī)方法檢測各組大鼠腎指數(shù)、血糖、尿素氮、血肌酐、尿白蛋白排泄率（UAER），免疫組化法檢測腎PKC表達，Western blot檢測腎組織TGF-β1的表達。結(jié)果：模型組大鼠腎皮質(zhì)PKC和TGF-β1表達顯著升高，血糖、UAER、尿素氮、血肌酐、腎指數(shù)顯著增高。解聚復腎寧組、厄貝沙坦組和厄貝沙坦加解聚復腎寧組上述指標顯著低于模型組（P＜0.05），厄貝沙坦加解聚復腎寧組各項指標改善明顯優(yōu)于模型組、解聚復腎寧組和厄貝沙坦組（P＜0.05）但未達到正常對照組水平。結(jié)論：解聚復腎寧對DN大鼠腎臟形態(tài)和功能有明顯保護作用，其機制可能與減少腎組織中PKC和TGF-β1的表達有關。

解聚復腎寧；糖尿?。淮笫竽Ｐ?；蛋白激酶C；轉(zhuǎn)化生長因子

近年來隨著糖尿病發(fā)病率上升，DN（糖尿病腎?。┮殉蔀槭澜绶秶鷥?nèi)引起終末期腎臟疾病的首要原因［1］。DN由于其較高的發(fā)病率及病死率［2］，一直為國內(nèi)外研究的熱點。我們觀察了解聚復腎寧對DN大鼠腎組織PKC和TGF-β1表達的影響及腎臟保護作用，總結(jié)如下。

1 材料與方法

藥物和試劑：解聚復腎寧由黃芪、生地黃、黃連、黃芩、丹參、葛根等10余味中藥組成，原藥購自重慶桐君閣藥房，經(jīng)重慶醫(yī)科大學中醫(yī)學院中藥研究室鑒定并制備成濃縮煎劑，含生藥2g/mL。厄貝沙坦為杭州賽諾菲安萬特民生制藥有限公司產(chǎn)品，批號0703116。鏈脲佐菌素（STZ）為ALEXIS公司產(chǎn)品，批號L18034。PKC小鼠單克隆抗體（BM0401）、TGF-β1兔多克隆抗體（BA0290）、山羊抗小鼠/兔IgG免疫組化檢測試劑（SA1050）為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品，DAB顯色劑為北京中杉金橋有限公司產(chǎn)品，抗兔IgG-HRP （Sigma，A6154）。

動物：健康雄性SD大鼠，8周齡，體質(zhì)量200～220g，由第三軍醫(yī)大學大坪醫(yī)院實驗動物中心提供，動物合格證號0052769。

主要儀器：H-7500透射電鏡、ROCHE MODULAR全自動生化分析儀，微量血糖測定儀，Olympus公司圖像采集系統(tǒng)，北京醫(yī)學圖像分析管理系統(tǒng)，LabworksTM掃描分析軟件系統(tǒng)。

造模及給藥：按參考文獻［3］稍加修改建立模型，取SD大鼠60只禁食12h后，用0.1mmol/L無菌枸櫞酸鈉緩沖液（pH＝4.2，4℃）配制濃度為2%的STZ溶液，按60mg/kg左下腹腔單次注射STZ，制造DM模型。72h后尾尖取血測空腹血糖，血糖大于等于16.65mmol/L確定為DM成模大鼠，共成模51只。將成模大鼠隨機分成模型組、解聚復腎寧組（中藥組）、解聚復腎寧加厄貝沙坦組（中西醫(yī)結(jié)合組）各13只、厄貝沙坦組（西藥組）12只。另取不注射STZ大鼠10只作為正常對照組，腹腔注射等量無菌枸櫞酸鈉緩沖液，尾尖取血測血糖，血糖均在4.7～8.3mmol/L。造模7天后，中藥組用解聚復腎寧29.87g/（kg·d）灌胃，厄貝沙坦組用厄貝沙坦50mg/（kg·d）灌胃，中西醫(yī)結(jié)合組用解聚復腎寧29.87g/（kg·d）和厄貝沙坦50mg/（kg·d）灌胃，每日上午1次，正常對照組和模型組大鼠每日上午用等量蒸餾水灌胃。實驗期間，對血糖過高可能危及生存的大鼠皮下注射胰島素。室溫18℃～20℃，相對濕度69%，12h交替照明，大鼠自由飲水、進食。共喂養(yǎng)12周。

標本收集與檢測：實驗結(jié)束前1天，用代謝籠留取24h尿液，記錄總量，離心，-80℃冰箱保存。實驗結(jié)束，所有動物于空腹狀態(tài)稱體質(zhì)量（BW），10%水合氯醛腹腔麻醉，心臟取血，分離血清，-80℃冰箱保存；剖腹分離雙側(cè)腎臟，右腎用冰生理鹽水清洗，吸干水分，稱腎質(zhì)量（KW），左腎取少部分皮質(zhì)制備1mm3數(shù)塊，用4%戊二醛固定，待做透射電鏡觀察，取1/2腎組織放入4%多聚甲醛溶液中固定，待行病理和免疫組化。余腎臟標本均用液氮快速冷凍，-80℃冰箱保存，備行Western blot檢測等。血糖、血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）和24h尿白蛋白排泄率（UAER）用ROCHE MODULAR全自動生化分析儀測定。將石蠟包埋的腎組織制成厚4μm切片，按照免疫組化三步法檢測腎組織PKC的表達，以PBS代替一抗作為陰性對照，每個標本在400倍光鏡下隨機選取8個視野，采用Olympus公司圖像采集系統(tǒng)及北航醫(yī)學圖像分析管理系統(tǒng)進行半定量分析，染色陽性部位的深淺以平均光密度值表示。取冰凍組織100mg提取蛋白，蛋白考馬斯亮藍法定量，取蛋白SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，入含6%脫脂牛奶（pH7.2）的PBS中封閉室溫1～2h，置4℃冰箱過夜，洗膜后用一抗進行雜交，再用二抗進行雜交，化學發(fā)光試劑檢測進行放射自顯影。用LabworksTM掃描分析軟件系統(tǒng)定積分光密度值。

統(tǒng)計學處理：用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)用（x±s）表示，組間差異性比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

各組大鼠KW/BW、BUN、Scr和UAER比較。模型組大鼠的腎質(zhì)量/體質(zhì)量、尿素氮、血肌酐、UAER顯著增高，中藥組、西藥組和中西醫(yī)結(jié)合組上述指標顯著低于模型組（P＜0.05），中西醫(yī)結(jié)合組各項指標改善明顯優(yōu)于模型組、中藥組和西藥組（P＜0.05）但未達到正常對照組水平，中藥組與西藥組之間比較無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 12周后各組大鼠KW/BW×1000、BUN、Scr、UAER（x±s）

各組大鼠PKC表達。PKC陽性染色主要位于腎小球上皮細胞、系膜細胞及系膜區(qū)、腎小管基膜及管周毛細血管處。正常對照組大鼠腎小球、腎小管PKC僅有微弱表達（見圖1-5）。半定量分析結(jié)果顯示，模型組PKC表達明顯高于正常對照組（P＜0.05）。中藥組、西藥組和中西醫(yī)結(jié)合組PKC表達明顯低于模型組（P＜0.05）。中西醫(yī)結(jié)合組較中藥組和西藥組表達降低更為顯著（P＜0.05），但仍高于正常對照組。中藥組與西藥組之間比較無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2、圖1-5。

表2 12周后各組大鼠腎PKC的表達 （x±s）

圖1正常對照組（200倍）

圖2模型組（200倍）

圖3中藥組（200倍）

圖4西藥組（200倍）

圖5中西結(jié)合組（200倍）

各組大鼠TGF-β1表達。糖尿病大鼠腎組織TGF-β1蛋白Western blot檢測，定量分析結(jié)果顯示，模型組TGF-β1表達明顯高于正常對照組（P＜0.05），中藥組、西藥組和中西醫(yī)結(jié)合組TGF-β1表達明顯低于模型組（P＜0.05），中西醫(yī)結(jié)合組較中藥組和西藥組表達降低更為顯著（P＜0.05）但仍高于正常對照組，中藥組與西藥組之間比較無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3，圖6。

表3 12周后各組大鼠腎TGF-β1的表達 （x±s）

圖6

3 討 論

DN發(fā)病機制尚不完全清楚，目前認為與遺傳、高血糖、血流動力學改變以及細胞因子等因素有關。高血糖可使組織細胞內(nèi)二?；视停―AG）增加，DAG是激活PKC的主要細胞內(nèi)物質(zhì)，它可直接激活PKC，DAG/PKC信號通路的活化，可啟動多元醇途徑、氧化應激、糖基化終末產(chǎn)物等參與糖尿病微血管病變的發(fā)生，調(diào)節(jié)腎小球內(nèi)皮細胞的通透性、細胞外基質(zhì)的合成/轉(zhuǎn)化等過程［4］。PKC也可以通過啟動TGF-β信號通路參與DN足細胞損傷過程［5］，本研究結(jié)果也顯示，除正常對照組外，腎質(zhì)量/體質(zhì)量、24h尿蛋白及Scr均增高，表明糖尿病大鼠腎功能受損，高血糖與腎臟損傷密切相關。

蛋白激酶C（PKC）是不同結(jié)構(gòu)、不同生物活性的同工酶組成的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族。在高糖環(huán)境中培養(yǎng)系膜細胞，其PKC處于激活狀態(tài)，同時發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)的DAG濃度也相應的升高，提示激活的DAG/PKC信號通路可能參與腎系膜細胞損傷過程［6］。本研究中糖尿病大鼠腎組織PKC表達增加，腎指數(shù)、Scr和BUN增加，并出現(xiàn)大量蛋白尿，也顯示PKC在DN發(fā)病中可能起重要作用。

足細胞損傷是DN重要的病理表現(xiàn)之一，與其疾病加重有關，PKC可以啟動TGF-β信號通路，而TGF-β參與了DN足細胞的損傷過程［5］。同時大量研究證明TGF-β1在腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化中也扮演著極為重要的角色，其最重要的生物學作用為增加腎小球系膜區(qū)ECM（細胞外基質(zhì)）的合成、抑制ECM的降解，導致腎小球硬化，腎功能衰竭［7］。本研究糖尿病大鼠腎組織TGF-β1表達增加，并出現(xiàn)大量蛋白尿，腎指數(shù)、Scr和BUN增加，也顯示TGF-β1參與了DN的發(fā)生發(fā)展過程。

采用國際常用腹腔注射STZ的方法制備DN動物模型，以厄貝沙坦作為對照組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)解聚復腎寧具有和厄貝沙坦相當?shù)闹委熥饔?，能夠降低DM大鼠腎組織PKC和TGF-β1表達，明顯減少24hUEAR，降低Scr水平，減輕DM大鼠腎組織損傷，提示解聚復腎寧具有較好的抗DM大鼠腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化進程的作用。解聚復腎寧對DM大鼠所表現(xiàn)出的腎臟保護效應，可能與其抑制腎組織PKC和TGF-β1過度表達有關，但發(fā)揮這些生物學效應的機制尚需進一步研究。

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［4］ Geraldes P，King GL.Activation of protein kinase C isoforms and its impacton dibaetic complications［J］. Rc Res，2010，106（8）：1319-1331.

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Objective：To investigate Jiejufushenning on effect of renal protein kinase C，renal transforming growth factor β1and renal protection in diabetic nephropathy rats.Methods：The diabetic SD rats induced by STZ were divided into four groups：diabetic control group，Jiejufushenning group，Irbesartan group and Jiejufushenning combined with Irbesartan group，and the normal control group. After experimental rats in every group were respectively treated for 12 weeks by above intervention methods.The relative kidney weight，blood sugar，urea nitrogen，serum creatinine，and urinary albumin excretion rate （UAER） were detected by routine analysis methods，and PKC in renal tissue was detected by immunohistochemical techniques，and TGF-β1in renal tissue was detected by Western blot.Results：The expression of renal cortex PKC and TGF-β1was increased in diabetic rats.The the blood sugar，UAER，urea nitrogen，serum creatinine and relative kidney weight were significantly increased in diabetic rats. While the above indexes in Jiejufushenning group，Irbesartan group and Jiejufushenning combined with Irbesartan group were significantly lower than in diabetic control group （P＜0.05），and the improvement of all indexes in Jiejufushenning combined with Irbesartan group was most significant （P＜0.05）.Conclusion：The mechanism of the protective effects of Jiejufushenning on renal lesion may be decreasing the level of TGF-β1in the renal tissue，and downregulating the expression of PKC.

Jiejufushenning；Diabetes；Protein kinase C；transforming growth factor beta 1

R255.487.2

B

1004-2814（2014）04-0259-03

2013-12-13