川中黑山羊(金堂類群)和藏山羊PRLR基因cDNA克隆及序列分析

胡亮，字向東，盧建遠(yuǎn)，馬力，熊顯榮，王永，任稱羅爾日, 任陶

（1. 西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 四川 成都 610041; 2. 四川省理縣畜牧局, 四川 理縣 623100）

川中黑山羊(金堂類群)和藏山羊PRLR基因cDNA克隆及序列分析

胡亮1，字向東1，盧建遠(yuǎn)1，馬力1，熊顯榮1，王永1，任稱羅爾日2, 任陶2

（1. 西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 四川 成都 610041; 2. 四川省理縣畜牧局, 四川 理縣 623100）

根據(jù)GenBank中綿羊的PRLR基因序列設(shè)計引物, 以川中黑山羊(金堂類群)和藏山羊垂體總RNA為模板, 通過RT-PCR技術(shù)對川中黑山羊(金堂類群)和藏山羊PRLR基因cDNA克隆及進(jìn)行序列分析, 以期為進(jìn)一步研究該基因與山羊的繁殖性能奠定理論基礎(chǔ). 結(jié)果表明：川中黑山羊(金堂類群)和藏山羊PRLR基因編碼區(qū)均長1746bp, 均編碼581個氨基酸. 川中黑山羊(金堂類群)PRLR基因編碼區(qū)與藏山羊、綿羊、牛、牦牛野豬和人的同源性分別為99.71%、99%、95%、95%、83%和80%. 以核苷酸序列構(gòu)建分子系統(tǒng)進(jìn)化樹, 川中黑山羊(金堂類群)先與藏山羊聚為一類, 再與綿羊聚為一類, 后與牛和牦牛聚為一類, 然后與野豬聚為一類, 最后與人聚為一類.

川中黑山羊(金堂類群); 藏山羊;PRLR基因; 克隆; 序列分析

催乳素又稱促乳素或生乳素, 由垂體前葉細(xì)胞合成和分泌, 是繁殖成功所必需的激素[1]. 催乳素在動物生長與發(fā)育、繁殖與泌乳、內(nèi)分泌與代謝、電解質(zhì)平衡等對多種生理過程中起作用[2-3]. 催乳素必須與催乳素受體(prolactin receptor,PRLR)結(jié)合才能發(fā)揮其功能, 通過受體作用于靶細(xì)胞, 從而引起靶細(xì)胞的各種生理生化反應(yīng)[4].PRLR基因在動物體內(nèi)分布極為廣泛, 在哺乳動物乳腺、卵巢、黃體、前列腺、肝臟等多種組織中均有表達(dá)[5-7].PRLR基因作為產(chǎn)仔數(shù)性狀的一個重要的后選基因被廣泛研究[8].

山羊的繁殖性狀遺傳力低, 篩選和鑒定控制多羔性狀基因, 應(yīng)用分子育種等新技術(shù)快速提高其產(chǎn)羔率, 對快速提高我國山羊生產(chǎn)水平和促進(jìn)羊業(yè)的發(fā)展具有重要意義. 川中黑山羊(金堂類群)是四川省金堂縣長期自然選育和人工培育形成的地方山羊品種, 具有早熟、生長發(fā)育快、體型大、繁殖力強(qiáng)、生存適應(yīng)范圍廣等優(yōu)良特性[9-10]. 藏山羊廣泛分布在西藏、四川、青海和甘肅等廣大牧區(qū)、半農(nóng)半牧區(qū)和農(nóng)區(qū), 其繁殖率低, 絕大多數(shù)一年產(chǎn)1羔[11]. 因此, 本研究以川中黑山羊(金堂類群)和藏山羊為研究對象, 對其PRLR基因進(jìn)行克隆及序列比對分析, 為山羊PRLR基因的定位、表達(dá)調(diào)控以及與繁殖性能的關(guān)系等研究提供一定的理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實驗動物

分別選取四川省金堂縣和理縣川中黑山羊(金堂類群)和藏山羊, 屠宰后立即采集垂體, 迅速放入液氮中備用.

1.2 主要試劑

TRIzol?Reagent購自Life Technologies公司; 2×Long PCR MasterMix感受態(tài)細(xì)胞均購自上海天根生物科技有限公司; DNA膠回收試劑盒購自愛思進(jìn)生物工程有限公司; 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自FERMENTAS (MBI )公司; 克隆載體pMD-19 Vector、氨芐青霉素(Ampr)購自大連寶生物公司.

1.3 PCR引物設(shè)計及合成

根據(jù)GenBank中綿羊PRLR基因序列(登錄號：AF041257.1)設(shè)計一對引物, 上游：5'-AGAGGAAGGAGCCAACATGAAG -3'、下游: 5'-GCTGGATTCTATGGCAGGG -3', 由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成.

1.4 總RNA的提取及cDNA的合成

用Trizol法提取藏山羊和川中黑山羊(金堂類群)垂體中的總RNA后, 根據(jù)Fermentas反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA的合成.

1.5 PRLR基因的PCR擴(kuò)增、純化

以反轉(zhuǎn)錄cDNA作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng), 反應(yīng)體系為25μL：上、下游引物(20pmol/L)各1μL, cDNA模板0.5μL, 2×Taq PCR MasterMix12.5μL, ddH2OμL. PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性4min; 94℃變性30s, 54℃退火35s, 72℃延伸90s, 30個循環(huán); 最后72℃延伸4 min; 4 ℃保存. PCR產(chǎn)物純化按照愛思進(jìn)生物工程有限公司膠回收試劑盒進(jìn)行.

1.6 PRLR基因的克隆、鑒定和測序

膠回收產(chǎn)物與克隆載體pMD-19Vector于16℃連接過夜. 連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化宿主菌E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞,涂布于含氨芐青霉素的LB固體平板上, 于37℃恒溫箱培養(yǎng)過夜. 挑選白色單克隆菌落于LB液體培養(yǎng)基37℃振蕩培養(yǎng)12 h, 并進(jìn)行菌液PCR鑒定, 產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后, 挑選陽性克隆菌液2mL送交上海英俊生物技術(shù)有限公司測序.

2 結(jié)果

2.1 PRLR基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

分別吸取5uL川中黑山羊(金堂類群)和藏山羊PRLR基因擴(kuò)增產(chǎn)物對其進(jìn)行電泳檢測, 用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶, 如圖1, 川中黑山羊(金堂類群)和藏山羊PRLR基因目的條帶, 與預(yù)期大小1770bp基本一致,且目的條帶明亮, 有利于后續(xù)實驗的進(jìn)行.

圖1 川中黑山羊(金堂類群)和藏山羊PRLR基因瓊脂糖電泳Fig.1 Electrophoresis results of Chuanzhong black goat and Tibetan goat PRLR genes PCR products

2.2 川中黑山羊(金堂類群)和藏山羊PRLR基因序列測定

獲得的川中黑山羊(金堂類群)和藏山羊PRLR基因編碼區(qū)的核苷酸序列已提交到NCBI中(川中黑山羊的登錄號：KJ792312, 藏山羊的登錄號：KJ782313),PRLR基因的編碼區(qū)均長1746bp, 均編碼581個氨基酸, 理論分子質(zhì)量分別為65261.49、65305.61. 川中黑山羊(金堂類群)和藏山羊PRLR基因編碼區(qū)序列比對, 同源性為99.71%, 有5處堿基不同：177位T→C, 786位C→T, 797位T→C, 1355位C→T, 1645位G→A. 核苷酸的不同引起2處氨基酸的差異(圖2)：452位I(異亮氨酸)→T(蘇氨酸)、549位M(甲硫氨酸)→V(纈氨酸).

圖2 川中黑山羊(金堂類群)和藏山羊PRLR基因編碼區(qū)氨基酸序列比較Fig.2 Comparison of animoacids of PRLR gene in Chuanzhong black goat and Tibetan goat

2.3 PRLR基因編碼區(qū)的同源性比對與分子進(jìn)化樹的構(gòu)建

經(jīng)過比對發(fā)現(xiàn), 川中黑山羊(金堂類群)PRLR基因與藏山羊、綿羊、牛、牦牛、野豬、人的同源性分別為99.71%、99%、95%、95%、83%和80%, 說明PRLR基因有較高的保守性. 用Mega5.0 等生物軟件構(gòu)建分子系統(tǒng)進(jìn)化樹, 如圖3, 結(jié)果表明, 川中黑山羊(金堂類群)與藏山羊的親緣關(guān)系最近. 川中黑山羊(金堂類群)先與藏山羊聚為一類, 再與綿羊聚為一類, 后與牛和牦牛聚為一類, 然后與野豬聚為一類, 最后與人聚為一類, 符合進(jìn)化關(guān)系.

圖3 基于核苷酸序列的PRLR基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 3 Phylogenetic tree of PRLR gene in mammals

3 討論

很多研究表明PRLR基因與動物繁殖性狀相關(guān), 還影響動物初情期年齡、排卵數(shù)、生殖器官的大小、卵巢重量和子宮等[4]. Vincent等[12]1998年發(fā)現(xiàn),PRLR基因與產(chǎn)子數(shù)相關(guān). Terman[13]研究波蘭豬PRLR基因與產(chǎn)仔數(shù)的關(guān)系的表明, 不同的PRLR基因型的第一胎母豬之間產(chǎn)仔數(shù)的差異顯著(p<0.01). 穆曉琨等[14]對樂至黑山羊PRLR基因第10外顯子進(jìn)行了PCR-SSCP檢測與產(chǎn)仔性能的相關(guān)性研究, 結(jié)果表明PRLR基因?qū)分梁谏窖虻漠a(chǎn)仔性能有一定影響.

本研究通過RT-PCR技術(shù)克隆得到川中黑山羊(金堂類群)和藏山羊PRLR基因序列, 均長1770bp, 其中編碼區(qū)序列長1746bp, 二者編碼區(qū)序列存在5處堿基的差異, 導(dǎo)致2處氨基酸的不同, 這種差異是否直接影響了川中黑山羊(金堂類群)和藏山羊產(chǎn)羔數(shù)還有待進(jìn)一步研究.PRLR基因編碼區(qū)與其他物種同源性較高, 說明PRLR基因具有較高的保守性. 構(gòu)建的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹表明, 川中黑山羊(金堂類群)先與藏山羊聚為一類, 再與綿羊聚為一類, 后與牛和牦牛聚為一類, 然后與野豬聚為一類, 最后與人聚為一類. 川中黑山羊(金堂類群)與藏山羊的親緣關(guān)系最近, 符合進(jìn)化關(guān)系. 系統(tǒng)進(jìn)化樹各個分支臵信度高, 結(jié)果可靠.

多胎的川中黑山羊(金堂類群)和單胎的藏山羊PRLR基因的克隆和序列比對分析, 為進(jìn)一步研究PRLR基因?qū)ι窖虍a(chǎn)羔率的影響提供了一定的理論依據(jù), 為提高山羊繁殖率奠定了理論基礎(chǔ).

[1] 李昆明. 催乳素對生殖生理的調(diào)控作用[J]. 生殖與避孕, 2001, 21(1): 75-78.

[2] 譚敦勇, 彭湘萍. 催乳素受體研究[J]. 生理科學(xué)進(jìn)展, 2012, 43(1): 17-23.

[3] 張芬芬, 王長法, 黃金明, 等. 催乳素受體的研究進(jìn)展[J]. 家畜生態(tài)學(xué)報, 2009, 30(3): 6-9.

[4] 王懷禹.PRLR基因多態(tài)性與動物繁殖性能的關(guān)系[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報, 2009, 25(12): 1-5.

[5] SAKI S, KATOH M, BERTHON P, et al. Characterization of prolactin receptors in pig mammary gland [J]. Biochem, 1985, 224: 911-922.

[6] 趙悅. 家禽催乳素結(jié)構(gòu)與功能研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代畜牧獸醫(yī), 2006, 9(49): 45-49.

[7] YOUNG K, KRAELING RR, BAZER FW. Effect of pregnancy and exogenous ovarian steroids on endometrial prolactin receptor ontogeny and uterine secretory response in pigs [J]. Bio Reprod, 1990, 43: 592-599.

[8] WU XH, MU XK, LU JY, et al. mRNA expression, polymorphism of prolactin receptor (PRLR) gene and their association with prolificacy in Lezhi black goats [J]. J Appl Anim Res, 2013, 87: 5910-5915.

[9] 李貴英, 王同軍, 佘陸均, 等. 涼山州引進(jìn)金堂黑山羊適應(yīng)性觀察[J]. 中國草食動物, 2010,30(2): 35-37.

[10] 許德貴, 張家明, 唐詩軍, 等. 金堂黑山羊生產(chǎn)性能研究[J]. 四川畜牧獸醫(yī), 2006, 33(11): 25-26.

[11] 王杰, 王永, 歐陽熙, 等. 藏山羊研究[J]. 中國畜牧雜志, 1993, 29(1): 10-13.

[12] VINCENT AL, TUGGLE CK, ROTHSCHILD MAX F, et al. The prolactin receptor gene is associated with increased litter size in pigs [C]// Proceedings of the 6th World Congress on genetics Applied to Livestock Production. Armidale, Australia, 1988, 27: 15-18.

[13] TERMAN A. Effect of the polymorphism of prolactin receptor (PRLR) and leptin (LEP) genes on litter size in Polish pigs [J]. Anim Breed Genet, 2005, 122(6): 400-404.

[14] 穆曉琨, 字向東, 王永, 等. 樂至黑山羊PRLR基因外顯子10多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)系研究[J]. 生物技術(shù)通報, 2011(3): 111-115.

Cloning and sequence analysis of PRLR gene in Jintang black goat and Tibetan goat

HU Liang1, ZI Xiang-dong1, LU Jian-yuan1, MA Li1, XIONG Xian-rong1, WANG Yong1, RENCHEN Le-er-ri2, REN Tao2
(1. School of Life Science and Technology, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, P.R.C.; 2. Animal Husbandry Bureau of Lixian County, Sichuan 623100, P.R.C.)

The primers were designed according to the GenBank gene sequence of sheepPRLR. Total RNA was extracted from the pituitary of Jintang black goat and Tibetan goat. ThePRLRgene of Jintang black goat and Tibetan goat were cloned and the sequences were analyzed in order to understand the effect of this gene on reproductive performance in goat. The results showed that the amplification coding region of thePRLRgene in Jintang black and Tibetan goat was 1746bp long, encoding 518 amino acids. The homologies of CDS ofPRLRgene between Jintang black goat and Tibetan goat, sheep, cattle, yak, pig and human were 99.71%, 99%, 95%, 95%,83% and 80%. Phylograms constructed on the basis of CDS from species indicated that Jintang black goat and Tibetan goat, then assembled with sheep, cattle sand yak assembled separately, and then assembled with pig, and then assembled with human finally.

Jintang black goat; Tibetan goat;PRLRgene; clone; sequence analysis

S814,S827

A

1003-4271(2014)04-0485-04

10.3969/j.issn.1003-4271.2014.04.02

2014-06-09

字向東(1963-), 男, 白族, 云南云龍人, 教授，E-mail: zixd@sina.com.

四川省應(yīng)用基礎(chǔ)項目（2013JY0043）.