H1N1豬流感病毒感染豬血管內(nèi)皮細(xì)胞后內(nèi)參基因的篩選

朱鑫, 吳巧, 馮曉輝, 湯承, 岳華

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 四川 成都 610041）

H1N1豬流感病毒感染豬血管內(nèi)皮細(xì)胞后內(nèi)參基因的篩選

朱鑫, 吳巧, 馮曉輝, 湯承, 岳華

（西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 四川 成都 610041）

旨在評(píng)價(jià)H1N1豬流感病毒感染豬血管內(nèi)皮細(xì)胞(PUVEC)后, 肽基脯氨酰異構(gòu)酶A(Ppia)、β-肌動(dòng)蛋白(Actb)、核糖體蛋白L4(Rpl4)、酪氨酸3/色氨酸5-單加氧酶激活蛋白(Ywhaz)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Gapdh)等5個(gè)內(nèi)參基因的穩(wěn)定性. 采用Real-time RT-PCR方法測定H1N1 SIV感染PUVEC后3、6、9、12、15、18、24和30h時(shí)5個(gè)內(nèi)參基因mRNA的表達(dá)水平, 未感染PUVEC為對(duì)照, 采用2-△Ct值對(duì)內(nèi)參基因進(jìn)行相對(duì)定量, 應(yīng)用Genorm軟件對(duì)其穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià). 結(jié)果表明, 5個(gè)內(nèi)參基因的穩(wěn)定性由高到低分別為Ppia和Rpl4、Ywhaz、Actb、Gapdh, 其中Ppia和Rp14穩(wěn)定性相同. 據(jù)此可知, Ppia和Rpl4在所選的5個(gè)內(nèi)參基因中是研究H1N1 SIV與機(jī)體互作理想的2個(gè)內(nèi)參基因.

H1N1豬流感病毒; 內(nèi)參基因; Real-time RT-PCR

H1N1豬流感病毒(H1N1 swine influenza virus, H1N1 SIV), 是一種嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)且對(duì)人類健康存在潛在隱患的流感病毒. 因此, 對(duì)H1N1 SIV的認(rèn)識(shí)對(duì)公眾健康越來越重要. 目前, 對(duì)豬流感病毒的致病機(jī)理還不完全清楚, 在病毒感染時(shí), 宿主對(duì)病毒的轉(zhuǎn)錄應(yīng)答是研究致病機(jī)理的一個(gè)重要內(nèi)容, 而實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR是一個(gè)主要的研究手段, 并且已成為基因定量檢測的黃金標(biāo)準(zhǔn)[1-2]. 在比較不同樣本之間的基因表達(dá)時(shí), 最關(guān)鍵的是考慮實(shí)驗(yàn)變量, 如細(xì)胞數(shù)量, 核酸提取和RNA反轉(zhuǎn)錄效率等. 因此, Real-time RT-PCR的準(zhǔn)確性就依靠一個(gè)內(nèi)在的內(nèi)參基因來標(biāo)準(zhǔn)化[3-5]. 有文章報(bào)道在生理狀態(tài)下穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因在病毒感染時(shí)表達(dá)水平會(huì)發(fā)生改變[6-7]. 因此選擇一個(gè)合適的內(nèi)參基因是確定Real-time RT-PCR實(shí)驗(yàn)可靠性的關(guān)鍵.

血管內(nèi)皮細(xì)胞具有屏障功能、分泌多種細(xì)胞因子、免疫調(diào)節(jié)、消除炎癥等作用[8-9]; 同時(shí), 血管內(nèi)皮細(xì)胞還是H1N1流感病毒等多種病毒入侵機(jī)體時(shí)的靶細(xì)胞, 在病毒感染下能夠產(chǎn)生大量炎癥細(xì)胞因子[10]. 在本實(shí)驗(yàn)室前期工作中, 用H1N1等幾種亞型病毒成功感染了豬血管內(nèi)皮細(xì)胞(PUVEC), 據(jù)此, 我們選用了PUVEC作為研究H1N1 SIV與宿主互作的細(xì)胞模型. 根據(jù)現(xiàn)有報(bào)道, H1N1 SIV感染狀態(tài)下, 在該細(xì)胞中理想的內(nèi)參基因尚未進(jìn)行篩選. 本研究參考相關(guān)文獻(xiàn), 選擇肽基脯氨酰異構(gòu)酶A(peptidyl prolyl isomerase A, Ppia), β-肌動(dòng)蛋白(β-actin gene, Actb)核糖體蛋白L4(ribosomal protein L4, Rpl4), 甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, Gapdh), 酪氨酸3/色氨酸5-單加氧酶激活蛋白(tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein, Ywhaz)共5個(gè)候選內(nèi)參基因, 研究其在H1N1 SIV感染PUVEC后的表達(dá)水平, 從中選出穩(wěn)定的內(nèi)參基因, 為研究H1N1 SIV與機(jī)體的互作提供新的依據(jù).

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及毒株

PUVEC細(xì)胞和H1N1 SIV毒株均由本實(shí)驗(yàn)室保存并提供, HA效價(jià)為27.

1.2 主要試劑

SYBR?Premix Ex TaqTM、TapDNA酶、Trizol Reagent及反轉(zhuǎn)錄試劑盒為TaKaRa公司的產(chǎn)品, MarkerⅠ購自北京博邁德, DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、胰蛋白酶為美國HyClone公司的產(chǎn)品, 胎牛血清為美國Gibco公司的產(chǎn)品, JM109工程菌由本實(shí)驗(yàn)室制備, Plasimid Miniprep Kit和AxyPrep DNA Gel Extraction Kit為美國Axygen公司的產(chǎn)品.

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀ABI 7300為美國ABI公司的產(chǎn)品; 凝膠成像系統(tǒng)Doc2000和PCR儀my cyclerTM為美國Bio-Rad公司的產(chǎn)品; 高速冷凍離心為德國Eppendorf公司的產(chǎn)品; Casy TT細(xì)胞計(jì)數(shù)儀為瑞士Roche公司的產(chǎn)品.

1.4 H1N1 SIV感染PUVEC

將培養(yǎng)瓶中匯合度達(dá)到85%～95%的PUVEC用胰蛋白酶消化, 制成2～4×105個(gè)/mL細(xì)胞懸液, 接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中, 2.5 mL/孔, 臵于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 待細(xì)胞匯合度達(dá)到85%～95%時(shí)接種H1N1 SIV, 0.5mL/孔, 臵于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中孵育1 h, 吸棄接種物, 加入2.5 mL/孔的含5 μg/mL TPCK胰酶和4%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基, 臵于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng). 共使用八個(gè)6孔板, 每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)板3孔接種病毒,另3孔用等量Hank's液代替病毒, 作為空白對(duì)照.

1.5 樣本收集

觀察各培養(yǎng)板中細(xì)胞的狀態(tài), 并于H1N1 SIV感染后的3、6、9、12、15、18、24和30h各取出一個(gè)培養(yǎng)板,向各孔加入Trizol 試劑700μL, 收集細(xì)胞裂解物, 于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?

1.6 細(xì)胞樣本總RNA 的提取及cDNA的合成

將細(xì)胞裂解物按照Trizol試劑說明書提取細(xì)胞總RNA, 并按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒成cDNA, 于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?

教師建立小組競爭機(jī)制，展開組間競爭。教室內(nèi)各組分開，設(shè)立獨(dú)立實(shí)驗(yàn)環(huán)境，各組成員可以隨時(shí)了解其他組進(jìn)度，形成企業(yè)競爭氛圍，促進(jìn)各組項(xiàng)目順利完成；培養(yǎng)學(xué)生危機(jī)感，樹立競爭理念。各組完成任務(wù)后展示成果，每組選派代表上臺(tái)演示設(shè)計(jì)思路、實(shí)現(xiàn)過程、存在問題等。然后組內(nèi)互評(píng)、組間互評(píng)、教師評(píng)價(jià)。通過分享、評(píng)價(jià)，讓學(xué)生在享受成就，交流經(jīng)驗(yàn)，提升溝通表達(dá)能力，深化學(xué)習(xí)成果。

1.7 引物的設(shè)計(jì)與合成

按照這5對(duì)常用內(nèi)參基因的保守序列各設(shè)計(jì)一對(duì)引物, H1N1的引物采用文獻(xiàn)[11]中報(bào)道的H1N1 M基因的引物, 豬內(nèi)參基因的引物如表1.

表1 豬5個(gè)內(nèi)參基因的RT-PCR引物信息Tab.1 Information for primers of RT-PCR

1.8 引物特異性鑒定及陽性標(biāo)準(zhǔn)品制備

以1.6中反轉(zhuǎn)錄好的cDNA為模板, 用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增. PCR反應(yīng)體系為25μl：10×PCR Buffer 2.5 μl, Taq DNA聚合酶0.125μl, MgCl21.5 μl, 上、下游引物各1 μl, dNTPs 2 μl, cDNA 2μl, 去離子水補(bǔ)足至25μl. 反應(yīng)條件為：95℃下預(yù)變性5分鐘; 95℃下變性30秒, 54℃下退火1分鐘, 72℃下延伸45秒, 35個(gè)循環(huán); 72℃下延伸5分鐘; 37℃結(jié)束反應(yīng). 瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物, 經(jīng)試劑盒回收并純化, 將產(chǎn)物克隆至pMD19-T載體中, 將其轉(zhuǎn)化到JM109工程菌中, 用Plasmid Miniprep Kit提取重組質(zhì)粒, 送到測序公司測序, 作為本研究的陽性標(biāo)準(zhǔn)品.

1.9 優(yōu)化Real-time PCR條件

在ABI 7300熒光定量PCR儀上用SYBR GreenⅠ染料法進(jìn)行擴(kuò)增和數(shù)據(jù)分析. 以最高熒光值和最小Ct值為標(biāo)準(zhǔn), 優(yōu)化退火溫度、引物濃度及循環(huán)條件. 以SYBR GreenⅠ試劑推薦的反應(yīng)體系(20μl), 引物終濃度優(yōu)化的范圍為0.1～1.0μmol/L, 運(yùn)用2步法和3步法進(jìn)行擴(kuò)增. 采用優(yōu)化的引物濃度和循環(huán)條件, 將退火溫度從54℃遞增至60℃, 遞增度數(shù)為1℃, 優(yōu)化退火溫度.

1.10 驗(yàn)證H1N1 SIV感染PUCEV及各樣本的檢測

以感染組的cDNA為模板, 以本實(shí)驗(yàn)室建立的RT-PCR方法[11]檢測H1N1的M基因, 以驗(yàn)證H1N1 SIV是否成功感染PUVEC.

分別取每個(gè)時(shí)間點(diǎn)感染組和對(duì)照組的3個(gè)生物學(xué)重復(fù), 將反轉(zhuǎn)錄好的cDNA用于熒光定量檢測, 得到各個(gè)樣本各內(nèi)參基因的Ct值.

1.11 穩(wěn)定性的檢測

應(yīng)用Genorm軟件檢測穩(wěn)定性：通過ABI7300軟件得出各內(nèi)參基因的Ct值, 然后將各內(nèi)參基因的Ct值代入公式△Ct值=樣本Ct值－最小Ct值, 算出△Ct值后得到各內(nèi)參基因的2-△Ct值, 應(yīng)用Genorm軟件得出5個(gè)候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定值M, 然后通過軟件的自動(dòng)分析算出這5個(gè)內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性的順序.

2 結(jié)果

2.1 H1N1 SIV成功感染PUVEC

隨機(jī)抽取感染3h后的細(xì)胞樣本進(jìn)行PCR檢測, 結(jié)果表明H1N1 SIV成功感染PUVEC細(xì)胞(圖1).

圖1 H1N1感染后細(xì)胞中H1N1 M基因擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 Amplification of H1N1 M gene by PCR

2.2 內(nèi)參基因的引物特異性

圖2為瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果. 從圖2可知, 這5個(gè)內(nèi)參基因的條帶清晰, 與目的基因的序列完全一致, 證明這5對(duì)引物的特異性和準(zhǔn)確性良好.

2.3 優(yōu)化出的檢測5個(gè)內(nèi)參基因Real-time RT-PCR條件

Gapdh、Actb、Ppia、Rpl4、Ywhaz 5個(gè)內(nèi)參基因優(yōu)化出的反應(yīng)體系為20μl：SYBR Green Ⅰ10 μl, 去離子水6 μl, 模板2 μl, 上、下游引物各1 μl. 反應(yīng)條件為：95℃下預(yù)變性3分鐘, 95℃下變性15秒, 56℃下退火30秒, 循環(huán)數(shù)：40個(gè).

圖2 內(nèi)參基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2 Amplification of Reference gene by PCR

2.4 熔解曲線分析

由熔解曲線分析可見, Gapdh、Actb、Ppia、Rpl4、Ywhaz mRNA的Real-time RT-PCR產(chǎn)物僅有1個(gè)特異峰,無非特異擴(kuò)增和引物二聚體. 其熔解溫度分別為：81.4℃±0.5℃、86.2℃±0.3℃、85.2℃±0.2℃、83.0℃±0.3℃、81.8℃±0.3℃(圖3).

圖3 內(nèi)參基因的熔解曲線Fig.3 Melting curve of Reference gene

2.5 內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性

表2為內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性. 從表2可知, 綜合評(píng)價(jià)感染組和對(duì)照組的M值后, 5個(gè)內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定性由高到低分別為Ppia和Rpl4, Ywhaz, Actb, Gapdh, 且它們的M值均小于1.5, 表明這5個(gè)內(nèi)參基因均能在H1N1 SIV感染時(shí)穩(wěn)定表達(dá), 其中Ppia和Rp14為最穩(wěn)定的內(nèi)參基因.

表2 內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定值Tab.2 Stable value of Reference gene

3 討論

到目前為止, Real-time PCR技術(shù)在基因表達(dá)分析上有廣泛的應(yīng)用, 而篩選理想的內(nèi)參基因是基因分析表達(dá)試驗(yàn)的重要的一環(huán). 隨著研究的深入, 已經(jīng)有諸多證據(jù)表明, 在生理狀態(tài)下穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因在病毒感染時(shí)表達(dá)水平會(huì)發(fā)生改變, 不能用于標(biāo)化目的基因, 因此, 合適的內(nèi)參基因須由試驗(yàn)條件來確定. 理想的內(nèi)參基因應(yīng)該滿足以下幾點(diǎn)條件：(1)穩(wěn)定表達(dá)于各種細(xì)胞和組織, 不受生理、病理變化以及環(huán)境因素的影響;(2)在各種細(xì)胞和組織中均能表達(dá), 不受細(xì)胞種類的影響, 相同組織類型的不同樣本其表達(dá)水平應(yīng)當(dāng)保持一致, 在不同組織間的表達(dá)不應(yīng)有顯著變化;(3)不存在假基因, 以避免基因組 DNA 的擴(kuò)增, 表達(dá)豐度中等, 不能太高和太低, 內(nèi)參基因和目的基因的表達(dá)水平應(yīng)當(dāng)在一個(gè)相同數(shù)量級(jí); 然而往往被認(rèn)為表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因卻表達(dá)不穩(wěn)定[12-13].根據(jù)大量文獻(xiàn)的報(bào)道, 任意一種內(nèi)參基因的穩(wěn)定表達(dá)都是指在某些類型或者一定實(shí)驗(yàn)條件下的穩(wěn)定. 在其他類型的細(xì)胞和組織中或者受某些實(shí)驗(yàn)因素及病理、環(huán)境等的作用下, 內(nèi)參基因的表達(dá)是變化的, 其表達(dá)差異可能是十幾倍到幾十倍[14-15].

近年來, ACTB和GAPDH被廣泛應(yīng)用作內(nèi)參基因進(jìn)行相對(duì)定量的分析研究, 它們一直以來都是人們常用的內(nèi)參基因, 但是根據(jù)大量研究表明, 人們發(fā)現(xiàn)在某些條件下, 例如病毒感染, 環(huán)境等因素, ACTB和GAPDH不能作為穩(wěn)定的內(nèi)參基因?qū)δ康幕蜻M(jìn)行定量分析[16]. 所以理想的內(nèi)參基因應(yīng)該根據(jù)特定的試驗(yàn)條件來選擇. Nygard等研究在豬組織基因表達(dá)時(shí), ACTB和RPL4對(duì)高豐度的轉(zhuǎn)錄物是很好的內(nèi)參基因, 而TATA盒結(jié)合蛋白(TBP)和次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶1(HPRT1)對(duì)低豐度的轉(zhuǎn)錄物是很好的內(nèi)參基因[4]. Silver等在研究人類網(wǎng)狀細(xì)胞的基因表達(dá)時(shí), GAPDH是最好的內(nèi)參基因, 而常用的β2-微球蛋白(B2M)應(yīng)該避免使用[3]. Jung等在研究人類腎細(xì)胞癌時(shí), 在比較腫瘤組織和正常組織時(shí), PPIA和TBP是最穩(wěn)定的內(nèi)參基因[17]. YUE等在研究禽流感病毒感染雞胚成纖維細(xì)胞時(shí), ACTB和RPL4是在病毒感染狀態(tài)下的CEFs中最好的內(nèi)參基因[18]. 然而在流感病毒感染下, 篩選穩(wěn)定內(nèi)參基因的報(bào)道較少. 本試驗(yàn)證實(shí)在H1N1 SIV感染的豬血管內(nèi)皮細(xì)胞中, PPIA和RPL4是在5個(gè)候選的內(nèi)參基因中表達(dá)最為穩(wěn)定的, 結(jié)果表明在H1N1 SIV感染狀態(tài)下, PPIA和RPL4可用于標(biāo)化實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果.

Genorm作為內(nèi)參基因選擇的良好工具, 為廣大科研工作者解決了這一大難題. 利用Genorm程序, 研究人員可以在任何細(xì)胞和組織的眾多內(nèi)參基因中篩選出2個(gè)以上的內(nèi)參基因. 研究結(jié)果表明, 使用多個(gè)內(nèi)參基因?qū)⒏佑欣谙到y(tǒng)偏差的校正, 得到更可靠的定量結(jié)果[12]. 本試驗(yàn)通過Genorm程序分析得出PPIA和RPL4在所選的5個(gè)內(nèi)參基因中是研究H1N1 SIV與機(jī)體互作相對(duì)理想的2個(gè)內(nèi)參基因, 這為研究H1N1 SIV與機(jī)體的互作提供了新的參考.

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Selection of reference genes in porcine umbilicus vein endothelial cells infected with H1N1 swine influenza virus

ZHU Xin, WU Qiao, FE
NG Xiao-hui, TANG Cheng, YUE Hua
(School of Life Science and Technology, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, P.R.C.)

The purpose of this study is to analysis the expression stability of Ppia, Actb, Rpl4, Ywhaz and Gapdh genes in porcine umbilical vein endothelial cells infected by H1N1 swine influenza virus. The paper detected mRNA expression level of these five genes at 3h, 6h, 9h, 12h,15h,18h, 24h and 30h post-infection using real-time RT-PCR, and the uninfected group was set as a control group. Relative quantification of these 5 genes was calculated using 2-△Ctvalue and then analysis of their expression stabilities was conducted using Genorm softwere. The result showed that the expression stability of these 5 genes ranges in a decreasing order as follows: Ppia, Rpl4, Ywhaz, Actb, and Gapdh, among which Ppia and Rpl4 have the same expression stability. In sum, the Ppia and Rpl4 genes are the ideal reference genes in H1N1 SIV infected PUVEC.

H1N1 SIV; reference gene; real-time RT-PCR

S855.8,S858.28

A

1003-4271(2014)04-0489-06

10.3969/j.issn.1003-4271.2014.04.03

2014-05-13

岳華(1963-), 女, 漢族, 河南人, 教授, 博士, E-mail: yhua900@163.co.m

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)31172307).