大白菜中擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殘留半定量ELISA免疫檢測方法的建立

文孟棠， 劉 媛， 寇莉萍， 劉賢金

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品質(zhì)量安全與檢測研究所，江蘇 南京210014)

除蟲菊酯類農(nóng)藥是一類模擬天然除蟲菊酯化學(xué)結(jié)構(gòu)合成的農(nóng)藥，具有殺蟲譜廣、高效、低毒的優(yōu)點，是目前較理想的農(nóng)藥。近年來，隨著一批高毒農(nóng)藥的禁用，菊酯類農(nóng)藥在中國的使用量越來越大，但因其具有化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、不易光解、殘留期長等特點，在農(nóng)產(chǎn)品中的殘留逐漸引起人們的重視［1］。聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)已對它們在蔬菜和水果等上的殘留作出了嚴(yán)格限量［2］。中國針對不同農(nóng)產(chǎn)品中的不同擬除蟲菊酯類農(nóng)藥也做了相應(yīng)的最大殘留限量［3］，主要集中在糧油及其制品、蔬果和茶葉上。

目前，定量測定菊酯類農(nóng)藥的方法主要為氣相色譜法、高效液相色譜法以及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用［4-5］。但是儀器法對被測樣品的凈化要求較嚴(yán)格，樣品前處理較為復(fù)雜，且對儀器設(shè)備和檢測人員的專業(yè)知識要求較高，故不適于現(xiàn)場快速檢測［6］。在農(nóng)藥殘留的監(jiān)測體系方面，國際上通行的做法是建立快速篩選和儀器分析相結(jié)合的雙重監(jiān)控體制，即在實驗室儀器確證分析之前，按一定規(guī)范對受檢產(chǎn)品取樣進行快速檢驗［7］。免疫分析法具有特異性強、靈敏度高、分析容量大等優(yōu)點，不僅可以特異性地針對某單一化合物，還可用于結(jié)構(gòu)相似的化合物，適合于現(xiàn)場快速檢測大量樣品。

酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)作為目前使用最普遍的免疫檢測方式，其效率和靈敏度都得到了廣泛認(rèn)可。針對擬除蟲菊酯類農(nóng)藥具有相似結(jié)構(gòu)的特點，以其共性結(jié)構(gòu)的化學(xué)合成物作為免疫原制備出的光譜性抗體可同時檢測幾種農(nóng)藥［8］，使得快速檢測的效率顯著提高，適合現(xiàn)場檢測，因為大多數(shù)情況下檢測人員只需確定某種類型農(nóng)藥的殘留。本試驗擬利用實驗室自制的抗擬除蟲菊酯類的廣譜性抗體［9］，優(yōu)化不同包被抗原和條件，建立對多種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的半定量ELISA免疫分析快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

酶標(biāo)儀(Thermo)，洗板機(Thermo)，酶標(biāo)板(Corning，96 孔)，移液器(Jencons Sealpette)，超純水凈化儀(Labconco)，分析天平(Ohaus)，氮吹儀(Organomation associates)，固相萃取儀(津騰)，高速分散機(麒麟醫(yī)用儀器廠生產(chǎn))，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(Labconic)，水浴鍋(江蘇省東臺市電器廠生產(chǎn))。

1.2 試劑與材料

大白菜(購于蘇果超市)，擬除蟲菊酯類農(nóng)藥多克隆抗體(本實驗室自制)，高效氯氟氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品、甲氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品、氟氰戊菊酯標(biāo)準(zhǔn)品、氰戊菊酯標(biāo)準(zhǔn)品、氯氰菊酯標(biāo)準(zhǔn)品、氯菊酯標(biāo)準(zhǔn)品(農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所提供)，N-羥基琥珀酰亞胺(NHS，Mereker)，環(huán)二己基碳酰亞胺(DCC，Mercker)，水溶性碳化二亞胺(EDC，Sigma-Aldrich)，二甲基甲酰胺(DMF，Sigma)，6-氨基己酸(上海化學(xué)試劑三廠生產(chǎn))，硫酸銨(上?；瘜W(xué)試劑三廠生產(chǎn))，四甲基聯(lián)苯胺(TMB，Sigma)，辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG(武漢博士德公司產(chǎn)品)，H2O2(上?；瘜W(xué)試劑公司產(chǎn)品)，SephadexG-10(上海進口分裝產(chǎn)品)，卵清蛋白(OVA，Sigma)，牛血清蛋白(BSA，Sigma)，間苯氧基苯甲酸(PBA，Sigma)，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 3種包被抗原的合成

活性酯法［10］合成包被抗原1:稱PBA 10.00 mg(0.045 mmol)溶于0.3 ml的DMF，加入等摩爾數(shù)的NHS5.18 mg(0.045 mmol)、DCC 9.30 mg(0.045 mmol)，充分混勻后室溫避光靜置過夜。次日10 000 g離心10 min，取上清液緩慢滴加至含10.00 mg(0.000 225 mmol)OVA的5 ml磷酸鹽緩沖液(pH 8.67)，反應(yīng)液在4℃ 1 L PBS(pH 7.4)中透析3 d，得到包被抗原1。透析液用紫外掃描。

用混合酸酐法［11］合成包被抗原2:稱取11.00 mg(0.05 mmol)半抗原溶于l ml二氧六環(huán)，加入12 μl三丁胺9.27 mg(0.05 mmo1)，待反應(yīng)液冷卻到4℃，再加入 7μl氯甲酸異丁酯 6.83 mg(0.05 mmol)，反應(yīng)液在4℃下繼續(xù)攪拌20 min。反應(yīng)結(jié)束后，將混合液滴入10 ml預(yù)冷至4℃且攪拌均勻含有45.00 mg(0.001 mmol)OVA的溶液中(水∶二氧六環(huán)=1∶1，體積比;pH 9.0～9.5)。加入過程約在15 min左右完成，分別在15 min(pH下降到6.0左右)及1 h(pH在8.0左右)后監(jiān)控反應(yīng)的pH值變化，用l mol的NaOH將pH值調(diào)到8.5。整個反應(yīng)時間控制在4.5～5.0 h。反應(yīng)產(chǎn)物用大量蒸餾水4℃透析3 d，透析液用紫外掃描。

用6-氨基己酸法［8］包被抗原3:先稱取6-氨基己酸 6.56 mg(0.05 mmol)、EDC 7.76 mg(0.05 mmol)、OVA 22.5 mg(0.000 5 mmol)溶于水中，調(diào)pH至7.5，室溫暗中反應(yīng)18 h后，用SephadexG-10純化，冷凍，干燥保存。將上述樣品溶于含20%DMF的水中，另稱PBA 10.7 mg(0.05 mmol)溶于DMF中，慢慢滴加入到上述樣品液，然后再加入溶于DMF的DCC 10.3 mg(0.05 mmol)，使DMF最終濃度為30%(體積比)，室溫暗中反應(yīng)18 h，混合物過濾除沉淀后用大量蒸餾水4℃透析3 d，透析液用紫外掃描儀掃描。

1.4 最佳工作條件的確定

采用方陣滴定法確定3種包被抗原和抗體的最佳工作濃度。選擇吸光值在1.0左右的抗原抗體稀釋濃度作為抗血清及包被抗原工作濃度［12］。設(shè)定抗原 濃 度 為 8.000 μg/ml、4.000 μg/ml、2.000 μg/ml、1.000 μg/ml、0.500 μg/ml、0.250 μg/ml、0.125μg/ml等濃度梯度，抗體從1∶2 000開始做倍比稀釋，用間接非競爭ELISA測定最優(yōu)工作條件。

1.5 包被抗原的優(yōu)化

在最優(yōu)工作條件下用間接競爭ELISA(ICELISA)測定3種包被抗原對各種菊酯農(nóng)藥的抑制情況。以包被抗原1、2、3分別包被ELISA板，每孔100μl，4℃靜置過夜，次日用PBS洗板3次，加入1%OVA(質(zhì)量體積比)，每孔200μl，37℃封閉1 h，PBST洗板3次，加入抗血清和不同濃度PBA及農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品各50μl，37℃孵育1 h，PBST洗板3次，加入1∶5 000稀釋的二抗，每孔100μl，37℃作用1 h，PBST洗板3次，加入 TMB底物，每孔100 μl，37 ℃ 反應(yīng) 15 min，2 mol/L 硫酸終止反應(yīng)，每孔50μl，測定450 nm處吸光值。

1.6 抗原抗體預(yù)反應(yīng)

由于包被抗原和半抗原與抗體的結(jié)合能力不同，一般認(rèn)為大分子的偶聯(lián)物抗原會優(yōu)先與抗體發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，所以須將抗體和半抗原預(yù)先混合，使半抗原與抗體充分結(jié)合后剩余的抗體再與包被抗原反應(yīng)，以達到檢測的準(zhǔn)確性［12-13］?？紤]到現(xiàn)場快速檢測的要求，針對抗原抗體預(yù)先混合反應(yīng)的必要性做出驗證，設(shè)置兩組試驗，一組將 PBA標(biāo)準(zhǔn)品從10μg/ml做系列倍比稀釋，然后分別和最優(yōu)工作條件下的抗體等體積混合，室溫過夜。另一組則不預(yù)混，按照正常IC-ELISA程序進行，觀測兩組吸光值的變化。

1.7 抗原抗體反應(yīng)時間的優(yōu)化

對于現(xiàn)場快速檢測來說，縮短檢測時間是非常重要的，故針對抗原抗體反應(yīng)時間做優(yōu)化試驗。分別設(shè)置抗原抗體反應(yīng)時間為 30 min、45 min、60 min、90 min，按照IC-ELISA方法進行測定，根據(jù)450 nm下的吸光值讀數(shù)計算不同抗原抗體反應(yīng)時間下的抑制中濃度。

1.8 樣品前處理［13］

取大白菜樣品可食部分，用干凈紗布輕輕擦去樣品表面的附著物，切碎后放入食品加工器粉碎，混勻，制成待測樣，備用。準(zhǔn)確稱取20.00 g樣品放入打漿瓶中，添加農(nóng)藥標(biāo)品，加入40.00 ml乙腈，高速勻漿1 min后用濾紙過濾，濾液收集到裝有7.00 g氯化鈉的50 ml具塞量筒中，蓋上塞子，劇烈震蕩1 min，室溫下靜置10 min，使乙腈相和水相分層。準(zhǔn)確吸取10 ml乙腈相溶液，加到10 ml試管中，用氮吹儀蒸發(fā)至干。用甲醇定容，按照試驗所需濃度稀釋后直接用于ELISA免疫分析測定。

1.9 半定量ELISA應(yīng)用檢測

根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)，這幾種菊酯農(nóng)藥在大白菜中的農(nóng)藥限量分別為氟氰戊菊酯0.5 mg/kg、高效氯氰菊酯2.0 mg/kg、氯氰菊酯2.0 mg/kg、氯菊酯1.0 mg/kg、氰戊菊酯3.0 mg/kg，以此作為試驗中各種農(nóng)藥的檢測超標(biāo)限，分別作樣品空白對照孔和超標(biāo)對照孔。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn):①若樣品平均吸光值≥空白對照孔吸光值，則待測樣中不含農(nóng)藥;②若超標(biāo)對照孔吸光值＜待測樣品平均吸光值＜空白對照孔吸光值，則待測樣中含有農(nóng)藥但未超過限量標(biāo)準(zhǔn);③若待測樣品平均吸光值≤超標(biāo)對照孔吸光值，則待測樣中有農(nóng)藥超標(biāo)［7］。

取大白菜添加不同劑量的農(nóng)藥樣品，添加按前文所述的提取方法，用IC-ELISA對樣本進行測定。

2 結(jié)果

2.1 包被抗原的紫外鑒定

由圖1可以看出，3種方法合成的PBA-OVA的紫外吸收圖譜與OVA、PBA相比，吸收曲線發(fā)生了明顯的改變，3種PBA-OVA在PBA的最大吸收峰296 nm處吸光值都有不同程度的增加，表明3種包被抗原PBA-OVA的偶聯(lián)是成功的。

2.2 包被抗原的優(yōu)化

圖1 PBA、OVA、包被抗原的紫外掃描圖譜Fig.1 UV scanning spectra of PBA，OVA and three different coating antigens

方正滴定法確定3種包被抗原的最優(yōu)工作條件分別是:6-氨基己酸法，抗體稀釋倍數(shù)1∶32 000，包被抗原濃度0.250μg/ml;活性酯法，抗體稀釋倍數(shù)1∶30 000，包被抗原濃度1.000μg/ml;混合酸酐法，抗體稀釋倍數(shù)1∶12 000，包被抗原濃度2.000 μg/ml。

由圖2可以看出，3種不同方法合成的包被抗原在各自的最優(yōu)工作條件下對PBA和幾種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的標(biāo)準(zhǔn)品的抑制作用有差異，其中用6-氨基己酸法合成的包被抗原的效果最好，且所用的抗體濃度和包被抗原濃度均是3種包被抗原中最小。這可能是免疫原用的是活性酯法合成的免疫抗原，所以用活性酯法合成包被抗原檢測時抗體中針對偶聯(lián)手臂結(jié)構(gòu)的較多，特異性識別半抗原能力相對變?nèi)?而混合酸酐法是讓PBA的羧基形成混合酸酐作為中間體和蛋白質(zhì)的氨基相連接，雖然是不同的連接方式，但是從紫外圖譜可以看出，此偶聯(lián)物在PBA的特征吸收波長296 nm處吸收值較低，可能是偶聯(lián)比率太小導(dǎo)致對半抗原識別能力太差。而6-氨基己酸法是用一種新途徑合成了一個六碳連接橋，有效避免了對相同手臂的識別，以提高對農(nóng)藥的識別靈敏性，這與駱愛蘭等［9］的研究結(jié)果相一致。因此選擇此種包被抗原用于下一步試驗。

圖2 不同包被抗原對擬除蟲菊酯農(nóng)藥IC-ELISA檢測的影響Fig.2 Effects of different coating antigens on IC-ELISA for pyrethroid pesticides

2.3 抗原抗體預(yù)反應(yīng)方式優(yōu)化

由圖3可以看出，抗原抗體提前過夜預(yù)混與不預(yù)混相比，吸光值有相應(yīng)降低，這可能是抗體在室溫放置過夜后活性有些許下降。而兩種方式都呈現(xiàn)相同的趨勢，并無很大差異，可能是半抗原抗體分子與抗體的反應(yīng)是在液相中，較固相載體上連接的包被抗原有更充分的接觸面積，所以會較快地與抗體結(jié)合。所以并不需要經(jīng)行提前過夜預(yù)混處理，這樣不僅保持了抗體的活性，而且大大節(jié)約了時間成本，更符合現(xiàn)場快速檢測的要求。

圖3 不同抗原抗體反應(yīng)方式對擬除蟲菊酯農(nóng)藥IC-ELISA檢測的影響Fig.3 Effect of antigen-antibody premixing on IC-ELISA for pyrethroid pesticides

2.4 抗原抗體反應(yīng)時間的優(yōu)化

由圖4可以看出，隨著抗原抗體反應(yīng)時間的延長，抑制中濃度有小幅度的下降，從30 min的6.95 μg/ml下降至90 min的5.46μg/ml，即隨著反應(yīng)時間的延長，抗體和抗原的的結(jié)合力度更完全更充分。但是對于現(xiàn)場快速檢測來說，節(jié)約時間是關(guān)鍵，所以選擇45 min作為最優(yōu)反應(yīng)時間，這樣可以達到相對較低的抑制中濃度6.30μg/ml和節(jié)約時間的雙重效果。

2.5 大白菜基質(zhì)對于IC-ELISA的影響

選取氟氰戊菊酯作為對象，從圖5中可以看出，大白菜基質(zhì)對IC-ELISA有一定的影響，主要表現(xiàn)為吸光值有一定的下降，但是抗體和氟氰戊菊酯相互作用的趨勢卻大致類似，所以并不影響半定量ELISA的檢測。因此，所用的前處理方法是適用于大白菜的實際快速粗篩的。

2.6 大白菜中幾種擬除蟲菊酯農(nóng)藥殘留半定量快速 ELISA 篩選［14］

圖4 不同抗原抗體反應(yīng)時間對擬除蟲菊酯農(nóng)藥IC-ELISA檢測的影響Fig.4 Effect of antigen-antibody reaction time on IC-ELISA for pyrethroid pesticides

圖5 大白菜基質(zhì)對擬除蟲菊酯農(nóng)藥IC-ELISA檢測的影響Fig.5 Effect of Chinese cabbage on IC-ELISA for pyrethroid pesticides

共選取5種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥，分別添加不同的量:0.1 mg/kg、1.0 mg/kg、10.0 mg/kg。每組水平做3個樣。同時空白樣和各類農(nóng)藥的超標(biāo)限濃度每一個做10份，取其平均值作為判定標(biāo)準(zhǔn)?？紤]到在實際使用農(nóng)藥的時候，可能將不同的農(nóng)藥混合使用，所以選擇了高效氯氰菊酯和氯氰菊酯等量混合，以驗證農(nóng)藥是否有疊加效應(yīng)。

由表1可以看出，一共檢測了54份大白菜樣品，其中假陽性5份，假陰性1份，假陽性率為7.41%，假陰性率為1.85%。對于添加混合菊酯農(nóng)藥的大白菜樣品，經(jīng)過檢測后發(fā)現(xiàn)有一定的疊加效應(yīng)，原因是抗體能夠識別多種農(nóng)藥，所以在單一農(nóng)藥有限時，多余的抗體會和另一農(nóng)藥結(jié)合，但是這個不是簡單的相加疊加效應(yīng)，因為抗體對不同種類的擬除蟲菊酯農(nóng)藥的親和力不同，具體還有待于進一步驗證?？偟膩碚f作為粗篩方法，可以允許一定的假陽性結(jié)果出現(xiàn)，但是假陰性應(yīng)盡量避免。檢測氰戊菊酯時出現(xiàn)了假陰性現(xiàn)象，但在蔬菜中氰戊菊酯超標(biāo)的情況很少，因此該方法可以適用于大白菜菊酯 農(nóng)藥類實際快速粗篩的檢測需求。

表1 半定量ELISA檢測大白菜中幾種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥結(jié)果Table 1 The pyrethroid pesticide residues in Chinese cabbage detected by semi-quantitative ELISA

3 討論

ELISA免疫檢測方法具有操作簡單、不需復(fù)雜的樣品前處理、需樣量少、通量大的特點，目前已有大量的研究報告，但實際應(yīng)用很少，除了該技術(shù)自身存在一些不足，如準(zhǔn)確性不如儀器法，重現(xiàn)性太差等，作者認(rèn)為該技術(shù)的定量要求較高也是一個重要原因。作為粗篩方法，半定量ELISA的判定標(biāo)準(zhǔn)是一種簡單實用的方法，超標(biāo)樣品可以用儀器法進一步分析。從本試驗中對大白菜樣品的半定量ELISA的檢測結(jié)果可以看出，該方法可以同時滿足幾種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的超標(biāo)初篩，假陽性率很低，能有效防止漏篩;氟氰戊菊酯檢測結(jié)果出現(xiàn)了假陰性，可能是因為半定量的準(zhǔn)確性較低?？紤]到實際施藥情況的復(fù)雜性，對于單個不超標(biāo)的幾種農(nóng)藥混合的情況，可能會判定為陽性結(jié)果。因此本試驗建立的半定量ELISA檢測方法對于大白菜中幾種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥檢測具有可行性。

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