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    一株雞源致病性大腸桿菌噬菌體的分離及其生物學(xué)特性

    2014-04-16 19:58:47王禮偉屈勇剛楊亞東楊一鳴施研進(jìn)
    關(guān)鍵詞:雞源菌斑噬菌體

    王禮偉, 梁 晏, 屈勇剛, 楊亞東, 李 飛, 楊一鳴, 施研進(jìn)

    (1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,新疆 石河子 832003;2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)農(nóng)八師石河子總場(chǎng)北泉鎮(zhèn)獸醫(yī)站,新疆 石河子832011

    目前,在雞業(yè)發(fā)展過程中,大腸桿菌病是一種較為常見高發(fā)病,常造成雞局部或全身性感染[1-2]。大腸桿菌病是一種條件致病菌,差的衛(wèi)生條件、不良的衛(wèi)生管理,很容易造成大腸桿菌病的發(fā)生。隨著養(yǎng)雞業(yè)規(guī)?;⒓s化的不斷發(fā)展,大腸桿菌病越發(fā)嚴(yán)重,病原對(duì)抗生素和抗菌藥的耐藥性越來越強(qiáng)。為了防治雞大腸桿菌病,飼養(yǎng)主大多采用飼喂抗生素或抗菌藥物的方法,但普遍存在耐藥性和用藥成本升高等問題。同時(shí),由于長期使用抗生素或抗菌藥,使產(chǎn)品存在藥物殘留,導(dǎo)致產(chǎn)品品質(zhì)下降,很難滿足人們對(duì)綠色健康養(yǎng)殖的要求。

    噬菌體是以細(xì)菌為寄主的一類非細(xì)胞微生物。自1917年人們發(fā)現(xiàn)噬菌體以來,利用噬菌體預(yù)防和治療細(xì)菌性疾病引起了人們的關(guān)注[3]。早在20世紀(jì)初噬菌體治療就已經(jīng)取得過可喜的成果,國外第一次公開報(bào)道的噬菌體治療是在1921年,利用噬菌體制劑治療葡萄球菌皮膚感染[4]。現(xiàn)今,噬菌體的運(yùn)用越來越廣泛。利用噬菌體治療具有一些先天性的優(yōu)勢(shì):自身的繁殖能力強(qiáng)、裂解細(xì)菌的特異性較強(qiáng)、無耐藥性、無殘留等。本研究擬從養(yǎng)殖場(chǎng)污水及糞便中分離雞大腸桿菌噬菌體,對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行分析。

    1 材料與方法

    1.1 菌株和污水

    28株雞源致病性大腸桿菌(Eco1~Eco28)由石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院傳染病實(shí)驗(yàn)室分離鑒定,凍干保存于-20℃。污水采自石河子周邊地區(qū)養(yǎng)雞場(chǎng)附近,共10份。

    1.2 主要試劑

    LB培養(yǎng)基按文獻(xiàn)[5]配制;普通營養(yǎng)瓊脂、麥康凱培養(yǎng)基均購于北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

    1.3 宿主菌的準(zhǔn)備

    將28株雞源致病性大腸桿菌分別接種到裝有3 ml液體LB液體培養(yǎng)基的試管中,于37℃條件下,160 r/min振蕩培養(yǎng)8 h,備用。

    1.4 噬菌體的富集與分離

    將采集的污水用8層紗布過濾,再用2層濾紙過濾,取過濾后的污水2.5 L,加入固體 CaCl2使終濃度達(dá)到1 mmol/L,在10 000 r/min下離心10 min。過濾除菌,取液體1 L,加入30 ml液體LB培養(yǎng)基和28株新鮮培養(yǎng)的雞源致病性大腸桿菌懸液各1 ml,37℃振蕩培養(yǎng)24 h,在10 000 r/min下離心5 min,上清液用0.22μm的濾膜過濾除菌。取28支試管,每管分別加入新鮮培養(yǎng)的28株雞源致病性大腸桿菌懸液0.3 ml,再加入處理后的液體0.3 ml,振蕩使其充分混勻,室溫下靜置10~15 min,使噬菌體和宿主菌充分吸附。再加5 ml已溶化的50℃左右0.7%半固體LB培養(yǎng)基,再次振蕩混勻,然后均勻地鋪在1.8%的固體LB瓊脂上,待其凝固后,37℃倒置培養(yǎng)8~12 h,觀察噬菌斑的生長情況[6]。

    1.5 噬菌體的純化

    當(dāng)有噬菌斑出現(xiàn)時(shí),先取相應(yīng)的宿主菌接種到5 ml液體LB培養(yǎng)基中,37℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)8 h。然后用10 μl槍頭挑取單個(gè)噬菌斑接種到相應(yīng)的宿主菌培養(yǎng)物中,37℃、160 r/min振蕩培養(yǎng) 8 h,擴(kuò)增噬菌體。然后在10 000 r/min下離心5 min,過濾除菌,無菌取上清液。單個(gè)噬菌斑經(jīng)此方法反復(fù)純化3~5次,即可得到較純的噬菌體。

    1.6 噬菌體的保存

    將分離純化后得到的噬菌體1 ml移入1.5 ml凍存管,每株噬菌體6管,置于-20℃冰箱中保存。

    1.7 噬菌體生物學(xué)特性測(cè)定

    1.7.1 噬菌體效價(jià)(滴度)測(cè)定 用LB液體培養(yǎng)基作為稀釋液,把純化后的噬菌體做連續(xù)10倍稀釋,分別取100μl加入0.2 ml相應(yīng)宿主菌,振蕩使其充分混勻,室溫靜置15 min,使噬菌體充分吸附宿主菌。再加入5 ml已溶化的50℃左右的0.7%LB半固體培養(yǎng)基,再次振蕩混勻,采用雙層瓊脂平板法,觀察噬菌斑的生長情況[7]。上述每個(gè)稀釋度分別做3個(gè)平行重復(fù)。計(jì)數(shù)時(shí),選取噬菌斑數(shù)為30~300的稀釋度平板,然后取適當(dāng)稀釋度3個(gè)平行重復(fù)的平均數(shù),以計(jì)算噬菌體的滴度。噬菌體的效價(jià)(PFU/ml)=稀釋倍數(shù)×平均噬菌斑數(shù)×100。

    1.7.2 噬菌體裂解譜的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[8],采用單斑法進(jìn)行測(cè)定:即取28株雞源致病性大腸桿菌的菌懸液分別均勻地涂在固體LB瓊脂平板上,然后分別取2μl純化后的噬菌體懸液,滴在平板不同的位置上,每板可滴4~6滴,懸液之間不能接觸,37℃培養(yǎng)8~12 h,觀察噬菌斑的生長情況。

    1.7.3 噬菌體的最佳感染復(fù)數(shù)測(cè)定 感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of infection,MOI)是指感染發(fā)生之前,噬菌體與宿主菌數(shù)量的比值。最佳感染復(fù)數(shù)為獲得子代噬菌體最高產(chǎn)量時(shí)的MOI。據(jù)文獻(xiàn)[9],取分離株噬菌體對(duì)應(yīng)的對(duì)數(shù)期菌懸液,按感染復(fù)數(shù)分別為 0.001、0.010、0.100、1.000加入噬菌體。37℃搖床振蕩培養(yǎng)8 h,采用雙層瓊脂平板法測(cè)定最佳感染復(fù)數(shù)。

    1.7.4 噬菌體的pH穩(wěn)定性測(cè)定 用鹽酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)配制 pH 為4、5、6、7、8、9的 LB 液體培養(yǎng)基。取不同 pH 值的液體LB培養(yǎng)基1 ml分別加入試管,高壓滅菌。將100μl噬菌體加入試管,在37℃條件下反應(yīng)2 h。利用LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋,取100μl噬菌體處理液,加入0.2 ml相應(yīng)宿主菌,振蕩使其充分混勻,室溫靜置15 min。采用雙層瓊脂平板法,測(cè)定不同pH值條件下噬菌體的效價(jià)。

    1.7.5 噬菌體的溫度穩(wěn)定性測(cè)定 調(diào)節(jié)水浴鍋的溫度分別為30℃、40℃、50℃、60℃。將分離株噬菌體放在水浴鍋靜置1 h。利用LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋,取100μl噬菌體處理液,加入0.2 ml相應(yīng)宿主菌,振蕩使其充分混勻,室溫靜置15 min。采用雙層瓊脂平板法,測(cè)定不同溫度條件下噬菌體的效價(jià)。

    1.7.6 噬菌體的紫外線穩(wěn)定性測(cè)定 將1 ml噬菌體稀釋液(1.98×102PFU/ml)加入平板中,直接暴露在超凈工作臺(tái)中,紫外線照射燈功率為20 W,距離為40 cm。在0 min、2 min、4 min、6 min、8 min、10 min、12 min 時(shí),取 100 μl噬菌體處理液加入0.2 ml相應(yīng)宿主菌,振蕩使其充分混勻,室溫靜置15 min。采用雙層瓊脂平板法,測(cè)定不同照射時(shí)間條件下噬菌體的效價(jià)。

    2 結(jié)果

    2.1 大腸桿菌噬菌體的分離及噬菌斑的觀察

    采用雙層瓊脂平板法,肉眼可見大小不一、邊緣整齊、無暈環(huán)、透明清晰的噬菌斑,在顯微鏡下測(cè)量其直徑為0.597 mm。最終分離純化出1株大腸桿菌噬菌體,將其命名為EcP10。

    2.2 噬菌體EcP10效價(jià)(滴度)

    通過雙層瓊脂平板法測(cè)定可知,噬菌體EcP10的效價(jià)為1.95 ×108PFU/ml。

    2.3 噬菌體EcP10裂解譜

    通過噬菌譜的測(cè)定,發(fā)現(xiàn)噬菌體EcP10可裂解28株雞源致病性大腸桿菌(Eco1~Eco28)中的12株(Eco2、Eco4、Eco5、Eco6、Eco10、Eco13、Eco15、Eco16、Eco20、Eco23、Eco25、Eco26),其裂解率為42.86%。

    2.4 噬菌體EcP10的最佳感染復(fù)數(shù)

    經(jīng)過8 h的培養(yǎng),通過效價(jià)的測(cè)定,當(dāng)MOI=1時(shí),噬菌體EcP10產(chǎn)生子代的效價(jià)為 5.8×108PFU/ml,為在4種不同條件下最高的,說明EcP10的最佳感染復(fù)數(shù)為1。

    2.5 噬菌體EcP10的p H值穩(wěn)定性

    噬菌體EcP10經(jīng)過6種不同的pH條件(pH 4、pH 5、pH 6、pH 7、pH 8、pH 9)處理2 h 后,在 pH 值為6 的時(shí)候,噬菌體的效價(jià)最高,為 6.25×106PFU/ml。當(dāng)pH為4時(shí),效價(jià)下降到3.3×105PFU/ml;當(dāng)pH為9時(shí),效價(jià)下降到1.15×105PFU/ml。這種趨勢(shì)說明過酸、過堿都會(huì)造成噬菌體的裂解能力下降,明顯影響噬菌體EcP10的活性。

    2.6 噬菌體EcP10的溫度穩(wěn)定性

    噬菌體EcP10經(jīng)過4種不同溫度(30℃、40℃、50℃、60℃)條件處理1 h后,溫度為30℃時(shí)效價(jià)最高,達(dá)到6.75×105PFU/ml,同時(shí),30 ~50 ℃ 時(shí)效價(jià)均維持在 105PFU/ml以上;60℃時(shí),效價(jià)明顯下降。這種趨勢(shì)說明高溫也嚴(yán)重影響噬菌體的活性。

    2.7 噬菌體EcP10的紫外線穩(wěn)定性

    隨著紫外線照射時(shí)間的持續(xù),噬菌斑數(shù)目測(cè)定結(jié)果表明,噬菌體EcP10的活性逐漸降低。紫外線持續(xù)照射12 min時(shí)僅產(chǎn)生2個(gè)噬菌斑,紫外線的照射直接導(dǎo)致噬菌體快速失活。

    2.8 噬菌體EcP10保存時(shí)間

    分離株噬菌體EcP10在-20℃冰箱中保存1個(gè)月,噬菌體的效價(jià)為1.40×108PFU/ml,沒有發(fā)生明顯的變化。

    3 討論

    噬菌體是感染細(xì)菌的病毒,可分為裂解性噬菌體和溫和噬菌體。噬菌體對(duì)宿主細(xì)菌的裂解和感染是特異性的,是由受體決定的,很少產(chǎn)生耐藥性的問題,也不會(huì)造成機(jī)體的菌群失調(diào),每種細(xì)菌都有自身敏感的噬菌體。利用這一特性,用噬菌體殺滅細(xì)菌,稱為噬菌體療法[9]。作為一種微生態(tài)制劑,噬菌體治療具有取材廣泛、繁殖能力強(qiáng)、裂解細(xì)菌相對(duì)特異性、無耐藥性、無殘留等優(yōu)點(diǎn)。因此,噬菌體相關(guān)研究越來越受到人們的重視[10]。近年來,噬菌體微生態(tài)制劑,已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)、食品行業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)、環(huán)境控制等相關(guān)領(lǐng)域[11]。

    本試驗(yàn)利用雞源致病性大腸桿菌作為宿主菌,從采自石河子周邊地區(qū)雞場(chǎng)附近的污水中分離純化出1株雞源致病性大腸桿菌噬菌體EcP10,同時(shí)對(duì)分離株噬菌體EcP10的生物學(xué)特性進(jìn)行了系統(tǒng)分析。通過效價(jià)、噬菌譜、最佳感染復(fù)數(shù)、pH值穩(wěn)定性、溫度穩(wěn)定性、紫外線穩(wěn)定性的測(cè)定,以及在-20℃條件下保存1個(gè)月的效價(jià)變化等多項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定,證實(shí)該分離株噬菌體EcP10具有較高的效價(jià)、較廣的噬菌譜和較好的穩(wěn)定性。本研究為后期研發(fā)噬菌體微生態(tài)制劑,開展噬菌體治療工作奠定了基礎(chǔ)。

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