二十味沉香丸增強(qiáng)低氧性肺動脈高壓大鼠肺組織PKC-α表達(dá)

王海燕，王 剛，張曉巖，李菊英，賀菊香，李生花

(青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理教研室，青海西寧810001)

慢性高原病是青藏高原特有的常見病，表現(xiàn)為低氧血癥、紅細(xì)胞增生和肺動脈高壓。二十味沉香丸是根據(jù)藏醫(yī)學(xué)原理，采用天然沉香、丁香等20 味藏藥合成(藏藥名:阿嘎爾尼秀日布)，具有改善心肌缺血、肺功能等作用［1］。PKC 是信號傳導(dǎo)通路的重要成員，可能參與了肺動脈高壓肺血管重塑的形成。本研究旨在通過二十味沉香丸干預(yù)，觀察大鼠肺動脈壓、肺組織中PKC-α 表達(dá)水平的變化，探討PKC-α 在二十味沉香丸預(yù)防低氧性肺動脈高壓中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料:兔抗大鼠PKC-α 一抗和兔HRP 辣根過氧化物酶二抗(Genetex 公司)，β-actin 抗體和羊抗兔HRP 標(biāo)記二抗(Santa Cruz 公司)，BCA 蛋白濃度測定試劑盒(Pierce 公司)。二十味沉香丸(青海省金珠藏藥廠)。Wistar 大鼠SPF級，雄性200 ～250g(青海省實驗動物中心，許可證號:醫(yī)動字第14-004 號)。

1.2 肺動脈高壓大鼠模型的建立和分組:將大鼠隨機(jī)分為:1)常氧對照組;2)高原低氧組;3)藥物干預(yù)組(二十味沉香丸干預(yù))。常氧對照組在西寧(海拔2 260 m)飼養(yǎng);高原低氧組和干預(yù)組(海拔4 500 m)飼養(yǎng)30 d。藥物干預(yù)組動物用二十味沉香丸灌胃，每天1 次。

1.2 方法

1.2.1 大鼠肺動脈壓測定:LMS-2B 雙導(dǎo)生理記錄儀采集、分析肺動脈壓。

1.2.2 ELISA 分析各組血清中PKC-α 的含量:按試劑盒說明書操作。

1.2.3 Westem bolt 檢測PKC-α 的表達(dá):使用PIPA 裂解液提取各組肺組織蛋白，BCA 法定量。后上樣、轉(zhuǎn)膜、封閉。兔抗鼠PKC-α 一抗(1∶1 000)，4 ℃過夜。加入羊抗兔二抗(1∶5 000)。LI-COR Odyssey 成像檢測，β-actin 為內(nèi)參計算相對表達(dá)量。

1.2.4 免疫組化檢測PKC-α 的表達(dá):各組肺組織切片脫蠟、水化、抗原修復(fù)、封閉，加入兔抗鼠PKC-α 一抗(1∶1 000)，4 ℃過夜。加入生物素標(biāo)記二抗工作液孵育30 min。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片光鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 二十味沉香丸對肺動脈壓和血清中PKC-α 含量的影響:高原低氧組肺動脈壓顯著高于常氧對照組(P＜0.05)，經(jīng)二十味沉香丸干預(yù)后肺動脈壓顯著低于高原低氧組(P＜0.05)。常氧對照組、高原低氧組、藥物干預(yù)組血清中PKC-α的含量沒有顯著性差別(表1)。

2.2 Western 法檢測肺組織中PKC-α 的表達(dá):高原低氧組第7、15 和30 天肺組織的PKC-α 表達(dá)較第1 天低;藥物干預(yù)組較高原低氧組PKC-α 的表達(dá)沒有顯著性增高(P＜0.05)(圖1，表2)。

表1 各組肺動脈壓和血清中PKC-α 的含量Table 1 Pulmonary artery pressure and concentration of serum PKC-α in normal group，hypoxia group and treatment group(±s，n=10)

表1 各組肺動脈壓和血清中PKC-α 的含量Table 1 Pulmonary artery pressure and concentration of serum PKC-α in normal group，hypoxia group and treatment group(±s，n=10)

*P＜0.05 compared with normal group;#P＜0.05 compared with hypoxia group(1 mmHg=0.133 kPa)．

day normal grouphypoxia grouptreatment group PAP(mmHg)PKC-α(ng/mL)PAP(mmHg)PKC-α(ng/mL)PAP(mmHg)PKC-α(ng/mL)1st20 ±310.55 ±1.5118 ±2*10.40 ±1.2221 ±3#10.63 ±1.44 3rd21 ±29.28 ±2.0523 ±3*10.01 ±3.0222 ±3#10.38 ±1.65 7th21 ±310.29 ±2.0832 ±5*11.88 ±0.7425 ±3#11.30 ±1.30 15th21 ±39.79 ±1.9330 ±3*12.93 ±3.4422 ±5#12.06 ±1.52 30th22 ±310.05 ±1.6749 ±10*10.98 ±2.0527 ±4#11.45 ±0.94

圖1 肺組織中PKC-α 的表達(dá)Fig 1 Expression of PKC-α in lung tissue

2.3 用免疫組化檢測大鼠肺組織中PKC-α 的表達(dá):藥物干預(yù)組中的PKC-α 表達(dá)較高原低氧組要強(qiáng)(P＜0.05)(圖2，表2)。

3 討論

二十味沉香丸是否通過調(diào)節(jié)PKC 途徑抑制肺動脈高壓?本實驗在高海拔低氧環(huán)境下成功復(fù)制大鼠肺動脈高模型。藥物干預(yù)組與高原對照組相比肺動脈壓顯著降低，提示二十味沉香散能抑制低氧引起的肺動脈高壓。高原低氧組第7、15 和30 天大鼠肺組織的PKC-α 表達(dá)較第1 天低，提示在慢性低氧環(huán)境下細(xì)胞由適應(yīng)發(fā)展為損傷，PKC-α 的表達(dá)下降，大鼠肺動脈高壓形成。藥物干預(yù)組較高原低氧組PKC-α的蛋白表達(dá)顯著性增高，提示二十味沉香丸對肺動脈高壓具有抑制作用，具有保護(hù)肺功能的作用。但是ELISA 法檢測到血清中PKC-α 結(jié)果為各組沒有顯著性差別，說明PKC-α 在肺組織中的表達(dá)對低氧環(huán)境更為敏感;二十味沉香丸可能通過PKC-α 途徑發(fā)揮降低肺動脈高壓的藥效，同期研究中也發(fā)現(xiàn)二十味沉香丸與MAPK 通路有聯(lián)系。PKC-α 在低氧中起到保護(hù)作用可能與以下機(jī)制有關(guān):1)PKC可能通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)游離Ca2+水平來實現(xiàn)保護(hù)作用。2)PKC 通過上調(diào)ATP 敏感K+通道活性防止細(xì)胞的代謝性損害［2］。3)PKC 通過下游絲裂原激活的蛋白激酶家族(MAPK)通路對細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)［3］。

表2 二十味沉香丸對大鼠肺組織PKC-α 蛋白表達(dá)的影響Table 2 Twenty flavour aloes pil influence expression of PKC-α in hypoxia group and treatment group(±s)

表2 二十味沉香丸對大鼠肺組織PKC-α 蛋白表達(dá)的影響Table 2 Twenty flavour aloes pil influence expression of PKC-α in hypoxia group and treatment group(±s)

＊P＜0.05 compared with hypoxia group．

day hypoxia grouptreatment group APKC-α/Aβ-actin(n=3)A value(n=7)APKC-α/Aβ-actin(n=3)A value(n=7)1st0.874 ±0.0320.310 ±0.0580.901 ±0.0390.363 ±0.041 7th0.717 ±0.0250.388 ±0.0931.151 ±0.030*0.330 ±0.062 15th0.692 ±0.0370.243 ±0.1441.202 ±0.045*0.373 ±0.104*30th0.631 ±0.0210.198 ±0.0771.194 ±0.037*0.395 ±0.094*

圖2 肺組織中PKC-α 的表達(dá)Fig 2 Expression of PKC-α in the lungs(×200)

本研究只是觀察到了二十味沉香丸預(yù)防低氧性肺動脈高壓機(jī)制中的部分現(xiàn)象，其通過PKC 途徑的具體作用靶點(diǎn)及機(jī)制有待更進(jìn)一步的研究和探索。

［1］閆曉麗，田紅燕，劉亞．肺動脈高壓5-HT2A 鼠肺動脈中PKC、TGF-β1 的表達(dá)及受體拮抗劑對其表達(dá)的調(diào)控［J］．西安交通大學(xué)學(xué)報，2013，34:293-295．

［2］張松濤，王微，張權(quán)宇．虎杖苷通過PKC 對大鼠離體缺血再灌注心肌的保護(hù)作用［J］．心臟雜志，2010，3:48-50．

［3］Chung YW，Kim HK，Kim IY，et al．Dual function of protein kinase C (PKC)in 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)-induced manganese superoxide dismutase (Mn-SOD)expression:activation of CREB and FOXO3a by PKC-alpha phosphorylation and by PKC-mediated inactivation of Akt，respectively［J］．J Biol Chem，2011，286:29681-29690．