MIBG對人肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響

劉逢秋，管小琴，王婭蘭，蘇 晏

(重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，分子醫(yī)學(xué)與腫瘤研究中心，重慶400016)

單腺苷二磷酸核糖基化(mono-ADP-ribosylation)是由單腺苷二磷酸核糖基化轉(zhuǎn)移酶(mono-ADP-ribosyltransferases，mono-ARTs)催化的一種蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾，其將ADP-核糖從NAD +轉(zhuǎn)移到受體蛋白特定的氨基酸位點如精氨酸、半胱氨酸殘基上。又可根據(jù)接受單腺苷二磷酸核糖基化作用的不同氨基酸種類，將其分為4 種亞型。精氨酸特異性單腺苷二磷酸核基化就是其中重要一種［1］。

MIBG 是一種去甲腎上腺素神經(jīng)遞質(zhì)胍類似物。放射性131I 標(biāo)記的MIBG 在臨床上作為腫瘤靶放射藥物來診斷和治療腎上腺腫瘤。而未放射標(biāo)記的MIBG 可以影響多種細(xì)胞生物學(xué)功能。目前研究發(fā)現(xiàn)MIBG 能夠特異性抑制精氨酸特異性單腺苷二磷酸核糖基化的功能。因MIBG 其化學(xué)結(jié)構(gòu)與精氨酸特異性單腺苷二磷酸核糖基化轉(zhuǎn)移酶催化的底物結(jié)構(gòu)類似，從而可以競爭性抑制精氨酸特異性單腺苷二磷酸核糖基化作用［2］。通過加入MIBG 能引起細(xì)胞膜到細(xì)胞核的一系列信號的傳導(dǎo)的改變最終可抑制平滑肌細(xì)胞增殖和遷移［3］。

本實驗通過使用MIBG 抑制精氨酸特異性單腺苷二磷酸核糖基化作用，進(jìn)一步探究其對肝癌HepG2 細(xì)胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

新生小牛血清(四季青公司);RPMI-1640 培養(yǎng)基、胰蛋白酶(HyClone 公司);PMSF，PIPA 裂解液(Beyotime);MIBG(Sigma 公司);ART1 多克隆抗體(SANTA 公司與Sigma 公司);兔抗山羊IgG/FITC標(biāo)記抗體(中衫金橋);RhoA，c-myc 多克隆抗體(武漢山鷹公司);cyclin A1 多克隆抗體(博士德生物);辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG(北京博奧森);BCA 試劑盒(碧云天公司)。

1.2 細(xì)胞的培養(yǎng)及處理

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng):人肝癌HepG2 細(xì)胞株用含10%新生小牛血清、100 U/mL 青霉素及100 U/mL鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)液于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，待細(xì)胞匯合至80%左右。PBS 清洗3次加入胰蛋白酶消化離心后傳代處理。

1.2.2 細(xì)胞免疫熒光實驗檢測:ART1 在HepG2 中的表達(dá):將滅菌處理后的玻璃爬片放入6 孔板中，HepG2 細(xì)胞以1 ×106cells/L 接種于6 孔板，待細(xì)胞匯合至玻璃爬片60% 左右，取出爬片PBS 清洗3次。用10%甲醛固定30 min，在用PBS 清洗3 次每次2 min，加入0.5% Triton 處理15 min，PBS 洗2次，每次5 min。然后1%牛血清白蛋白(BSA)封閉30 min，在用1∶100 的ART1 抗體4 ℃孵育過夜，對照組PBS 代替一抗做陰性對照。過夜后PBS 清洗3次，每次5 min，加入濃度為1∶50 的兔抗山羊IgG/FITC 標(biāo)記抗體，37 ℃避光雜交孵育1 h。孵育完畢后再用PBS 清洗3 次，每次5 min。最后用熒光抗淬滅封片液封片，熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.2.3 噻咗藍(lán)(MTT)比色實驗檢測細(xì)胞生存:HepG2細(xì)胞以1 ×106cells/L 接種于96 孔板，200 μL/孔。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，加入MIBG 至所需的不同濃度，繼續(xù)培養(yǎng)12 h。每孔加入MTT(5 g/L)20 μL，37 ℃繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，棄去上清液，每孔加入150 μL 二甲基亞砜，輕輕振蕩10 min，使甲臜溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀上，490 nm 波長測定各孔吸光值。細(xì)胞生存率=［(實驗組吸光值－空白組吸光值)/(對照組吸光值－空白組吸光值)］×100%。

1.2.4 流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期:HepG2 細(xì)胞以1 ×106cells/L接種于6 孔板，2 mL/孔。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，加入MIBG 至所需的不同濃度，繼續(xù)培養(yǎng)12 h。用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液并用PBS 洗滌，離心后棄上清液，重新懸浮于4 ℃預(yù)冷的0.9%氯化鈉注射液中，緩慢加入－20 ℃預(yù)冷的95%乙醇，使其終濃度為70%。固定4 h 后流式細(xì)胞周期檢測。

1.2.5 Western blot 檢測蛋白表達(dá):將各組培養(yǎng)的細(xì)胞裂解之后提取蛋白，然后用BCA 試劑盒測定各組蛋白濃度。5∶1 體積與蛋白上樣緩沖液混合，沸水中水浴5 min。按每孔相同蛋白總量加入凝膠，ART1、c-myc、cyclinA1 和β-actin 用10% 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，RhoA 用15%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離。然后再電轉(zhuǎn)到0.45 μm聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。封閉1 h。一抗c-myc、cyclinA1 濃度1 ∶300，ART1、RhoA 濃度1∶200，β-actin 濃度1∶500 4 ℃過夜。吐溫20/三羥甲氨基甲烷緩沖液(TBST)清洗3 次后用1∶1 000辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG 孵育2 h，加入ECL 化學(xué)顯影試劑后凝膠圖像分析系統(tǒng)拍照，檢測蛋白質(zhì)印跡條帶。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞的免疫熒光

熒光顯微鏡下見HepG2 的胞膜、胞質(zhì)均有熒光。而用PBS 陰性對照的HepG2 細(xì)胞中則沒有(圖1)。

2.2 MTT

50μmol/L MIBG 開始，呈劑量依賴性抑制細(xì)胞存活(P＜0.05)(表1)。

2.3 流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期

隨著MIBG 濃度的增加，處于S 期的細(xì)胞比例也隨之增加(P＜0.05)(圖2，3)。

2.4 Werstern bolt

與對照組比較，實驗組ART1、RhoA、c-myc 和cyclinA1 蛋白表達(dá)水平降低。4 個指標(biāo)各組間兩兩比較均有差異(P＜0.05)(圖4)。

圖1 細(xì)胞免疫熒光法檢測人肝癌細(xì)胞HepG2 中ART1 的表達(dá)情況Fig 1 The expression of ART1 in hepatoma carcinoma HepG2 cells detected by cellular immunofluore scence method(taken the pictures by fluores cence microscope，×400)

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度MIBG 處理后的HepG2 細(xì)胞周期Fig 2 HepG2 cell cycle phases treated with different concentration of MIBG analysed by flow cytometry

表1 不同濃度MIBG 處理HepG2 細(xì)胞后MTT 法測量A 值以及細(xì)胞存活率Table 1 Effects of different concentration of MIBG on cell growth and cell survival rate in human HepG2 detected by MTT(±s，n=3)

表1 不同濃度MIBG 處理HepG2 細(xì)胞后MTT 法測量A 值以及細(xì)胞存活率Table 1 Effects of different concentration of MIBG on cell growth and cell survival rate in human HepG2 detected by MTT(±s，n=3)

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01 compared with control group．

concentration(μmol/L)MTT assay(A value/well)cell survival rate(%)0(Con．)1.222 ±0.024100 501.114 ±0.019*90.665 ±0.406*1001.027 ±0.053＊＊83.208 ±3.093＊＊1500.853 ±0.021＊＊68.259 ±0.643＊＊2000.854 ±0.032＊＊68.300 ±1.391＊＊2500.537 ±0.014＊＊41.103 ±0.478＊＊3000.474 ±0.012＊＊35.689 ±0.223＊＊

圖3 不同濃度MIBG 對HepG2 細(xì)胞周期的影響Fig 3 Effects of different concentration of MIBG on HepG2 cell cycle phases(±s，n=3)

3 討論

單腺苷二磷酸核糖基化有4 種類型，而精氨酸特異性單腺苷二磷酸核糖基化作用是其中最重要的一種［1］。目前，關(guān)于精氨酸特異性單腺苷二磷酸核糖基化功能的生物學(xué)研究主要在結(jié)腸癌以及平滑肌細(xì)胞。精氨酸特異性單腺苷核糖基化作用能夠影響結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移以及參與腫瘤細(xì)胞凋亡過程［4-5］。因此，通過使用精氨酸特異性單腺苷核二磷酸糖基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑MIBG，來探究其是否具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。

催化精氨酸特異性單腺苷二磷酸核糖基化作用的ARTs 目前已發(fā)現(xiàn)多種亞型，不同的亞型在不同種屬和部位分布各不同。在目前已知的5 種ARTs中，只有ART1，2 和5 具有精氨酸特異性單腺苷核糖基化轉(zhuǎn)移酶的催化位點。因為ART2 在人類體內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)，ART5 主要富集于睪丸中［6］。所以，初步推測在人體內(nèi)ART1 是催化精氨酸特異性單腺苷二磷酸核糖基化作用的主要酶。

圖4 蛋白印記實驗檢測各組中ART1，RhoA，c-myc，cyclinA1 蛋白表達(dá)水平Fig 4 The expressions of ART1，RhoA，c-myc，cyclin A1 proteins in HepG2 cells in different groups were respectively detected by Western blot(±s，n=3)

首先，通過細(xì)胞免疫熒光顯示ART1 在HepG2細(xì)胞具有高表達(dá)，該結(jié)果提示HepG2 細(xì)胞中具有精氨酸特異性單腺苷二磷酸核糖基化這一蛋白質(zhì)翻譯后修飾作用。再通過功能實驗MTT 以及流式細(xì)胞周期的分析表明，精氨酸特異性單腺苷二磷酸核糖基化抑制劑MIBG 能夠抑制肝癌HepG2 細(xì)胞增殖，且主要是阻滯在S 期。

RhoA 蛋白是Rho 蛋白中最具代表性的一種，其也屬于Ras 家族蛋白中一員。具有激活和失活兩種狀態(tài)，可通過Rho/RhoA 激酶(Rho kinase，ROCK)通路將胞膜信號傳導(dǎo)至胞核，從而調(diào)節(jié)c-myc 基因的表達(dá)［7-8］。c-myc 可以激活cyclin A 蛋白的表達(dá)［9］。細(xì)胞周期的調(diào)控主要由細(xì)胞周期素cyclins和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent protein kinases，CDKs)這兩類蛋白家族調(diào)控。cyclin A1在細(xì)胞周期S 期調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用［10］。

研究證明小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞ART1 基因沉默后，精氨酸單腺苷二磷酸核糖基化作用減弱，RhoA 的表達(dá)活化水平降低。從而影響到ROCK 細(xì)胞信號通路，引起下游c-myc 的表達(dá)降低，可抑制小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖［11］。

為了探究MIBG 抑制HepG2 細(xì)胞增殖的機制，進(jìn)一步檢測了ART1，RhoA、c-myc、cyclinA1 的表達(dá)。結(jié)果顯示，加入MIBG 后的HepG2 細(xì)胞ART1、RhoA、c-myc 和cyclinA1 表達(dá)水平降低。提示RhoA通路參與調(diào)節(jié)了肝癌HepG2 細(xì)胞增殖過程。通過加入MIBG 后，降低了ART1 表達(dá)水平和RhoA 的活化水平，進(jìn)一步下調(diào)細(xì)胞核內(nèi)c-myc 蛋白的表達(dá)水平，減低了cyclinA1 的表達(dá)。從而使HepG2 細(xì)胞發(fā)生S 期阻滯，增殖受到抑制。

本實驗發(fā)現(xiàn)MIBG 對人肝癌HepG2 細(xì)胞增殖具有抑制作用，為臨床肝癌治療和藥物研究提供了新的靶點。MIBG 對其他腫瘤細(xì)胞增殖影響以及在其他生物學(xué)行為如凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移等的影響以及是如何調(diào)控ART1 表達(dá)下調(diào)的機制還有待進(jìn)一步研究。

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