泥鰍凍干粉抗CCl4小鼠肝纖維化作用

張倩，商萌萌，凌去非，劉春宇，*

（1.蘇州大學(xué)藥學(xué)院，江蘇蘇州215123；2.蘇州大學(xué)水產(chǎn)研究所，江蘇蘇州215123）

泥鰍凍干粉抗CCl4小鼠肝纖維化作用

張倩1，商萌萌1，凌去非2，劉春宇1，*

（1.蘇州大學(xué)藥學(xué)院，江蘇蘇州215123；2.蘇州大學(xué)水產(chǎn)研究所，江蘇蘇州215123）

采用CCl4小鼠肝纖維化模型，給予不同劑量泥鰍凍干粉，檢測(cè)小鼠血清中ALT、AST活性及肝組織中羥脯氨酸（Hyp）含量，并觀察肝組織病理變化，探討泥鰍凍干粉抗CCl4小鼠肝纖維化作用。結(jié)果表明，與模型組相比，泥鰍粉凍干粉明顯降低CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠血清ALT、AST活性，顯著降低肝組織Hyp含量（P＜0.05）。病理學(xué)觀察結(jié)果，泥鰍粉凍干粉給藥組小鼠膠原纖維沉積明顯減輕，假小葉結(jié)構(gòu)明顯減少。泥鰍凍干粉能預(yù)防小鼠肝纖維化的形成，具有抗肝纖維化作用。

泥鰍凍干粉；肝纖維化；CCl4

泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus Cantor）屬鰍科，藥食兩用，肉或全體入藥，性味甘、平，收載于《中藥大辭典》[1]，具有補(bǔ)脾益氣、保肝除黃等功效，對(duì)治療肝炎、小兒盜汗、痔瘡、皮膚瘙癢、跌打損傷、手指疔、陽(yáng)痿、乳癰等癥有一定療效。目前已從泥鰍中提取多種營(yíng)養(yǎng)成分，蛋白、多糖、氨基酸等[2]，并有提高免疫力、抗炎、抗氧化[3-5]等多種功效。我們先前的實(shí)驗(yàn)證明泥鰍凍干粉具有顯著的保肝作用，本文報(bào)道泥鰍凍干粉抗CCl4小鼠慢性肝纖維化的作用。

1材料與方法

1.1 泥鰍凍干粉制備

泥鰍去頭，去內(nèi)臟后，凍干粉碎，過30目篩制備，即得泥鰍凍干粉（Misgurnusanguillicaudatus lyophilized powder，MLP），臨用前用生理鹽水配成混懸液。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

ICR小鼠，雄性，清潔級(jí)，體重18 g～22 g，由蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心供應(yīng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證（SCXK（蘇）2007-0007），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證（SYXK（蘇）2007-0035）。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及器材

CCl4（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20100107），用花生油配成20%油溶液；聯(lián)苯雙酯片（江蘇鵬鷂藥業(yè)有限公司，批號(hào)：1010071）磨粉，用生理鹽水配成混懸液；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）試劑盒、羥脯氨酸（Hyp）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。紫外可見分光光度儀UV-2401PC：日本島津；高速冷凍離心機(jī)：Cwntrifuge5417R eppendorf。

1.4 模型制備及處理

60只ICR小鼠隨機(jī)分為6組，每組10只。分別為空白組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、泥鰍凍干粉低劑量組、中劑量組和高劑量組。空白組和模型組每天口服生理鹽水0.2mL/10g，其余各組每天口服相應(yīng)的藥物0.2mL/10 g，陽(yáng)性對(duì)照組給予聯(lián)苯雙酯，除空白組外每3天腹腔注射20%四氯化碳0.1mL/10 g，空白組腹腔注射等體積的花生油。連續(xù)造模1個(gè)月，眼眶取血，不加抗凝劑，放置30min，8 000 r/min離心4min，制備血清。取肝臟加冷生理鹽水制成10%肝勻漿，-20℃保存；取肝左葉小塊置10%甲醛液固定做病理切片。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)及方法

按試劑盒說明測(cè)血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）活性（賴氏法）。測(cè)肝組織中羥脯氨酸（Hyp）含量（堿水解法）。病理組織采用常規(guī)石蠟切片，HE染色，Masson三色染色，光鏡下觀察。根據(jù)2000年西安全國(guó)肝病會(huì)議通過的纖維化SSS半定量計(jì)分系統(tǒng)，以此評(píng)判肝纖維程度。纖維化半定量計(jì)分系統(tǒng)。

表1 SSS纖維化半定量計(jì)分系統(tǒng)Tab le1 Sem i-quantitative score system of fibrosis

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 泥鰍凍干粉對(duì)肝纖維化小鼠血清指標(biāo)的影響

如表2所示，與空白組相比，模型組小鼠血清中ALT、AST活性均顯著提高（P＜0.01），說明模型組小鼠肝明顯損傷，造模成功。與模型組相比，聯(lián)苯雙酯陽(yáng)性對(duì)照組ALT、AST活性顯著降低（P＜0.01），說明聯(lián)苯雙酯能明顯減輕小鼠肝損傷程度。泥鰍粉低、中、高3個(gè)劑量組與模型組相比，酶活性均有明顯下降，尤其高劑量組效果最明顯（P＜0.01）。結(jié)果提示，泥鰍凍干粉有保肝作用。

表2 泥鰍凍干粉對(duì)肝纖維化小鼠血清ALT和AST的影響（±S，n=10）Table2 EffectsofM LP on serum ALT and AST activity in CCl4-induced fibroticmouse（±s，n=10）

表2 泥鰍凍干粉對(duì)肝纖維化小鼠血清ALT和AST的影響（±S，n=10）Table2 EffectsofM LP on serum ALT and AST activity in CCl4-induced fibroticmouse（±s，n=10）

注：*P＜0.05，**P＜0.01，與模型組相比；“—”表示不給藥。

分組劑量/（mg/kg）ALT（U/L）AST（U/L）空白組—48.980±6.308 40.011±12.346模型組—100.736±17.739 122.904±12.218聯(lián)苯雙酯組150 62.186±6.079**55.574±24.468** MLP低劑量組50 71.586±14.315 111.699±5.571* MLP中劑量組100 70.269±9.683*66.544±7.186* MLP高劑量組200 60.120±16.966*62.331±8.041**

2.2 泥鰍凍干粉對(duì)肝纖維化小鼠Hyp的影響

羥脯氨酸（Hyp）是肝纖維化的特征物質(zhì)。如表3所示。

表3 泥鰍凍干粉對(duì)肝纖維化小鼠羥脯氨酸含量的影響（±s，n=10）Table3 EffectsofM LP on contentof Hyp in CCl4-induced fibroticmouse（±s，n=10）

表3 泥鰍凍干粉對(duì)肝纖維化小鼠羥脯氨酸含量的影響（±s，n=10）Table3 EffectsofM LP on contentof Hyp in CCl4-induced fibroticmouse（±s，n=10）

注：*P＜0.05，**P＜0.01，與模型組相比；“—”表示不給藥。

分組劑量/（mg/kg）羥脯氨酸含量/（μg/g濕重）空白組—67.021±13.782模型組—135.781±30.011聯(lián)苯雙酯組150 95.507±32.235* MLP低劑量組50 120.867±47.849 MLP中劑量組100 106.919±26.201* MLP高劑量組200 93.715±19.111**

與空白組相比，模型組的羥脯氨酸含量明顯升高（P＜0.01），與模型組相比，泥鰍凍干粉給藥組羥脯氨酸含量明顯下降（P＜0.05），尤其高劑量組效果好（P＜0.01）。結(jié)果提示，泥鰍凍干粉具有一定的抗CCl4小鼠肝纖維化作用。

2.3 泥鰍凍干粉對(duì)小鼠肝組織病理學(xué)影響

圖1肝組織HE染色和圖2Masson染色結(jié)果可以看出：空白對(duì)照組中肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，匯管區(qū)無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，無纖維增生。肝纖維化模型組中正常肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝細(xì)胞呈氣球樣變性、羽毛樣變性，有橋接壞死、界板壞死，匯管區(qū)有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。膠原纖維構(gòu)成纖維間隔，完整的假小葉形成，說明造模成功。泥鰍凍干粉3個(gè)劑量組中肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常，肝細(xì)胞腫大和變性程度都輕于模型組。尤其高劑量組細(xì)胞基本正常，炎癥細(xì)胞少見，膠原纖維少。

圖1 泥鰍凍干粉對(duì)CCl4肝纖維化小鼠病理變化的影響Fig.1 EffectofM LP on pathological changesof liver fibrosis in CCl4-induced fibroticmouse

表4 小鼠SSS肝纖維化半定量計(jì)分（n=10）Table4 EffectsofM LP on hepatic fibrosisscoreof SSS in CCl4-induced fibroticm ouse（n=10）

有效療效判斷標(biāo)準(zhǔn)：肝纖維化SSS評(píng)分較治療前下降≥2分。聯(lián)苯雙酯組和泥鰍粉給藥組與模型組相比，評(píng)分均下降＞2分，說明泥鰍粉給藥組均有治療肝纖維化的療效。

3討論

肝病是目前發(fā)病率很高的疾病之一，肝纖維化是肝病發(fā)展的必經(jīng)階段，是所有慢性肝病的共同病理基礎(chǔ)。肝纖維化是由于多種因子刺激，激活肝星狀細(xì)胞（HSC），致使細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）異常增多或過度沉積。目前認(rèn)為肝纖維化是可逆的，如何防治肝纖維化，成為肝病研究的熱點(diǎn)[6]。

泥鰍性味甘、平，傳統(tǒng)功效有補(bǔ)脾益氣、保肝除黃、清熱解毒、祛濕邪等。近代用于傳染性肝炎和消渴癥。CCl4可誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型，且方法簡(jiǎn)便、病變典型，是最常用的造模方法[7]。本實(shí)驗(yàn)采用20%四氯化碳造模，Masson染色觀察到膠原纖維構(gòu)成纖維間隔，假小葉形成，造模成功。泥鰍凍干粉給藥后，血清中ALT、AST活性明顯下降（P＜0.05），羥脯氨酸的含量也顯著降低，同時(shí)從病理切片可觀察到給藥后肝小葉結(jié)構(gòu)正常，膠原纖維少，提示泥鰍凍干粉能明顯減輕小鼠肝纖維化程度，但其作用機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究。

[1]江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,1992: 1457-1458

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Effect of M isgurnus anguillicaudatus Lyophilized Power on Liver Fibrosis Induced by CCl4in M ice

ZHANGQian1，SHANGMeng-meng1，LINGQu-fei2，LIUChun-yu1，*
（1.Collegeof Pharmaceutical Science，Soochow University，Suzhou 215123，Jiangsu，China；2.Fisheries Institute，Soochow University，Suzhou 215123，Jiangsu，China）

Tostudy theeffectof Misgurnusanguillicaudatus lyophilized poweron liver fibrosis，themodelinmice wasestablished by using CCl4.Given differentdosesof Misgurnusanguillicaudatus lyophilized power，the serum ALT and AST activitiesand tissue Hyp contentwere detected.The pathological changesof liverwere observed. Resultsshowed that the ASTand ALTactivitiesand Hyp levelswere significantly decreased（P＜0.05）in three dosesgroupsof MisgurnusAnguillicaudatus lyophilized power，comparedwith themodelgroup.The pathological improvementswere observed.The fibrogenesis in liver tissuesweremarkedly reduced and the formation of liver pseudoluboliwasalleviated.The Misgurnusanguillicaudatus lyophilized power can prevent the formation of liver fibrosisinduced byCCl4inmice.

Misgurnusanguillicaudatus lyophilized power；liver fibrosis；CCl4

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.011.031

2013-03-06

江蘇省水產(chǎn)三項(xiàng)工程（PJ2011-62）；連云港市贛榆縣泥鰍協(xié)會(huì)項(xiàng)目（P113400310）

張倩（1988—），女（漢），碩士，研究方向：中藥藥理研究。

*通信作者