脫細(xì)胞膀胱基質(zhì)補(bǔ)片的生物相容性研究

范雪梅,徐惠成,王朝麗

(1.成都軍區(qū)總醫(yī)院婦產(chǎn)科,成都 610083；2.第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院婦產(chǎn)科,重慶 400038；3.中國人民解放軍324醫(yī)院體檢中心,重慶 400020)

近年來,隨著材料科學(xué)和組織工程學(xué)的進(jìn)步,脫細(xì)胞基質(zhì)成分的組織工程補(bǔ)片大量涌現(xiàn)，并逐漸在盆底修復(fù)重建手術(shù)中采用，替代薄弱受損的盆底筋膜組織[1]。膀胱損傷后能迅速進(jìn)行自我修復(fù)，用膀胱基質(zhì)修復(fù)受損組織是合乎邏輯的選擇[2]。目前，脫細(xì)胞膀胱基質(zhì)(acellular bladder matrix，ABM)已成為泌尿外科研究和應(yīng)用的熱點，但還未見其用于盆底修復(fù)方面的報道。本研究在前期實驗基礎(chǔ)上采用表面活性劑聯(lián)合酶消化法[3-5]，對新鮮健康豬膀胱(屠宰場獲取)進(jìn)行脫細(xì)胞處理，制成 ABM補(bǔ)片，采用體內(nèi)外相結(jié)合的實驗方法對生物相容性進(jìn)行評價，為其在盆底修復(fù)方面的應(yīng)用進(jìn)一步提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康新西蘭大白兔15只,體質(zhì)量2.1～2.5 kg,雌性；由第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供,實驗動物使用合格證:SCXK(渝)2007-0002。

1.2儀器與試劑 苯甲基磺酰氟(北京鼎國生物技術(shù)有限公司),三羥甲基氨基甲烷(BBI)，Triton X-100、DNA酶及RNA酶(上海生工有限公司)，十二烷基硫酸鈉(捷瑞生物工程有限公司)，苯酚(北京化工廠)，聚丙烯網(wǎng)片( 美國強(qiáng)生公司)。凍干機(jī)，掃描電鏡，CO2培養(yǎng)箱，CK2型倒置相差顯微鏡，BIO-RAD 680 XR型酶標(biāo)儀。

1.3方法

1．3．1材料浸提液制備 參照ISO10993-5(2009)[6]，浸提介質(zhì)為RPMI1640培養(yǎng)液，浸提比例為6 cm2/mL，培養(yǎng)液完全浸沒樣品，密封后在37 ℃無菌條件下浸泡24 h制成浸提液。完成后用RPMI1640培養(yǎng)液分別稀釋，制備100.0%、50.0%、25.0%、12.5%的浸提液，放入冰箱4 ℃保存(實驗組)。空白對照組： RPMI1640培養(yǎng)液。陰性對照組：聚苯乙烯(浸提方法同試驗樣品)。陽性對照組：含0.5%苯酚溶液(由RPMI1640培養(yǎng)液配置)。

1．3．2細(xì)胞毒性試驗 凍存 L-929 細(xì)胞復(fù)蘇后經(jīng)過兩次傳代，取對數(shù)生長期的L929細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化2～3 min。倒去消化液，RPMI1640培養(yǎng)液將細(xì)胞稀釋至1×105個/mL。將L929細(xì)胞懸液加至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，100 μL/孔，在37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，棄去培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)液，按實驗分組分別進(jìn)行換液(每組5孔)，再把培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，于1、3、5 d各取出一塊培養(yǎng)板，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、照相，每孔加入MTT染色劑50 μL(1 mg/mL)，置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h。吸盡原液，每孔加入100 μL異丙醇，吹打震蕩，充分混勻，用酶標(biāo)儀以檢測波長570 nm，參考波長630 nm，分別測定各孔OD值。并根據(jù)公式計算細(xì)胞相對增殖率(RGR)=供試品組(陰性、陽性組) OD值/空白對照組OD值×100%。按照評分標(biāo)準(zhǔn)(RGR≥100%為0級，75%～99%為1級，50%～74%為2級，25%～49%為3級，1%～24%為4級，0%為5級),對樣品細(xì)胞毒性程度進(jìn)行評價。

1．3．3溶血試驗 參照ISO10993-4(2009)設(shè)計實驗。采集新西蘭兔血2 mL與1 mL肝素混合，并加1.5 mL生理鹽水稀釋備用。設(shè)實驗組(ABM生理鹽水100%浸提液)；陰性對照組(生理鹽水)；陽性對照組(蒸餾水)各5 mL,每組5支試管。每支試管加入稀釋的抗凝兔血0.1 mL，37 ℃孵育60 min。離心10 min(3 000 r/min)，觀察上層液體顏色及紅細(xì)胞沉積情況。酶標(biāo)儀492 nm處測OD值，計算溶血率，溶血率=[待測OD值 (Dt)-陰性對照組OD值(Dnc)]/[陽性對照OD組(Dpc)-Dnc]×100%。

1．3．4陰道埋植試驗 新西蘭大白兔10只,雌性，未孕未產(chǎn)。分為實驗組和對照組，每組5只。采用3%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)腹腔注射麻醉,陰道消毒,剪開陰道直腸交界處皮膚，分離陰道后壁黏膜與直腸間隙，達(dá)頂點處，長約2.0～2.5 cm[7]。ABM裁剪成10 mm×20 mm大小植入實驗組家兔陰道后壁黏膜下方，將目前臨床上最常用于盆底修復(fù)的人工合成材料聚丙烯網(wǎng)片[8]剪成同樣大小植入另一組家兔陰道作對照。術(shù)后每天觀察手術(shù)切口及動物反應(yīng)變化，于12周處死動物后采集樣本(植入材料及表面附著組織),甲醛固定，石蠟包埋,伊紅-蘇木素染色制成病理切片，在光鏡下觀察炎癥反應(yīng)、新生血管形成和成纖維細(xì)胞增殖情況。

2 結(jié) 果

2．1細(xì)胞毒性試驗 倒置相差顯微鏡觀察培養(yǎng)1 d后(圖1)，實驗組細(xì)胞貼壁生長，形態(tài)良好，為長梭形或不規(guī)則三角形與陰性對照組相似；陽性對照組細(xì)胞無明顯生長，變圓、皺縮。隨時間延長可見實驗組和陰性對照組細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，兩組相比未見明顯差異，而陽性對照組隨著時間的延長，細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞死亡。染色后，實驗組 MTT 結(jié)晶物密度與陰性對照組相似，呈現(xiàn)為透明的藍(lán)紫色，陽性組染色后變色不明顯。從表1可見，培養(yǎng)同樣的時間實驗組各濃度的 OD 值之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；隨培養(yǎng)時間延長，各濃度組OD值都逐漸增高，不同濃度的實驗組與陰性對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；各實驗組均與陽性對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。陽性對照組細(xì)胞毒性級別為4～5級，實驗材料組細(xì)胞毒性級別與陰性對照組同為 0～1級，可以認(rèn)為ABM無細(xì)胞毒性。

2.2溶血試驗 生理鹽水組和實驗組靜置后個管內(nèi)均可見血細(xì)胞沉積，而蒸餾水組各管顏色均一，呈淡紅色，無明顯血細(xì)胞沉積。見表2。陰性對照組與實驗組OD值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)， 與陽性對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。實驗組溶血率為1.5%，低于5%，因此判定ABM符合生物材料的溶血試驗要求。

a：陰性對照組；b：陽性對照組；c：實驗組100%浸提液；d：實驗組12.5%浸提液。

圖1 倒置相差顯微鏡觀察培養(yǎng)1 d各組L929細(xì)胞的形態(tài)變化(×100)

表2 各組吸光度值和溶血率測定(n=5)

2.3陰道埋植試驗

2.3.1大體觀察 ABM植入陰道后，傷口無紅腫、滲液等炎性反應(yīng)，植入部位未見紅腫、侵蝕和纖維包塊形成，術(shù)后12周未見ABM補(bǔ)片殘存；聚丙烯組均出現(xiàn)網(wǎng)片皺縮，有2例(40%)出現(xiàn)材料穿透陰道即侵蝕反應(yīng)。

2.3.2組織病理學(xué)觀察 術(shù)后12周，ABM膠原變性斷裂，成纖維細(xì)胞增多，周邊圍繞極少的嗜酸性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞，補(bǔ)片已基本降解。聚丙烯在體內(nèi)未發(fā)生降解，網(wǎng)孔周圍有較多成纖維細(xì)胞環(huán)繞，膠原纖維較紊亂，炎癥反應(yīng)呈中、重度，伴有壞死。見圖2。

A:ABM補(bǔ)片大部分降解斷裂呈紅色均質(zhì)(黑色箭頭)，與周圍宿主基質(zhì)融合。B:聚丙烯網(wǎng)片(黑色箭頭)網(wǎng)孔周圍膠原較少，有壞死(紅色箭頭)。

圖2陰道植入ABM和聚丙烯12周后的光鏡下組織學(xué)改變(HE染色×100)

3 討 論

理想的盆底修復(fù)重建替代材料應(yīng)具備無菌、持久耐用、不致癌、價廉、無抗原反應(yīng)并且能抵抗機(jī)體組織重塑[9-10],目前尚沒有可以滿足以上全部要求的替代材料。脫細(xì)胞基質(zhì)材料由于不含細(xì)胞表面受體的特異識別位點，不易引發(fā)受體的免疫排斥反應(yīng)，增加了組織相容性，減少了感染概率，提供了一個有利于正常的細(xì)胞生長,分化,血管生成的環(huán)境，能快速與宿主整合，這是組織工程移植物能長期存在體內(nèi)發(fā)揮作用的關(guān)鍵。脫細(xì)胞移植物按照來源可分為同種異體和異種移植物。由于同種異體的移植材料來源有限,價格較高,且涉及倫理問題,目前已較少作為移植材料。異種移植材料較易獲得，國外已經(jīng)商品化的異種移植物包括牛闊筋膜、牛心包、馬心包、豬小腸黏膜下組織、豬真皮、胎牛皮、豬膀胱、豬心臟瓣膜等[11-12]，在泌尿外科、耳鼻喉頭頸外科、普通外科、整形外科中已有應(yīng)用，但在婦產(chǎn)科僅有脫細(xì)胞豬真皮和豬小腸黏膜下組織作為盆底修復(fù)補(bǔ)片的少量報道。

生物相容性是生物材料研究中始終貫穿的主題,主要采用體外法和體內(nèi)植入試驗對材料生物相容性進(jìn)行評價[13]。通過相關(guān)的物理化學(xué)法對其性能進(jìn)行評價，并在簡化的體外模型表面上研究材料的細(xì)胞相容性即為體外法；將材料植入動物體內(nèi)一段時間取出觀察其炎癥反應(yīng)及組織長入情況，即為體內(nèi)植入試驗，組織學(xué)檢查是其主要檢查方法。本課題組在前期實驗研究中將5種最常用的豬脫細(xì)胞基質(zhì)材料，進(jìn)行體外相關(guān)特性檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ABM具有最長的降解周期、最強(qiáng)的抗菌性能、最高的吸水性、最好的生物力學(xué)性能，初步認(rèn)為適合于盆底特殊環(huán)境[14]。因此，本實驗參照ISO10993制定的相關(guān)方法和標(biāo)準(zhǔn)，對ABM的生物相容性進(jìn)行全面評價。

在細(xì)胞毒性實驗中，各實驗組、空白組和陰性對照組的細(xì)胞隨著培養(yǎng)時間的延長，細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，說明12.5%、25.0%、50.0%和100.0%的ABM浸提液對L929細(xì)胞的增殖無影響。細(xì)胞毒性與被測材料的量尤其是表面積有關(guān)，實驗設(shè)計了不同濃度的浸提液比較，其結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義，進(jìn)一步說明本實驗材料對細(xì)胞沒有毒性，符合生物材料的無毒性要求。

在溶血實驗中,陰性對照組和實驗組靜置后各管內(nèi)均見到有血細(xì)胞的沉積，兩組OD值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。而陽性對照組呈淡紅色，出現(xiàn)明顯溶血，其OD值與陰性對照組和實驗組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。材料浸提液溶血率合格,表明本實驗材料無溶血作用。

ABM補(bǔ)片在植入家兔陰道12周后已基本降解；顯示呈極輕、輕度炎癥反應(yīng)，ABM補(bǔ)片與宿主組織融合，纖維細(xì)胞增殖明顯，表現(xiàn)出良好的組織相容性。而聚丙烯網(wǎng)片炎癥反應(yīng)呈中、重度，伴有壞死，出現(xiàn)了臨床上常見的并發(fā)癥即侵蝕。關(guān)于聚丙烯網(wǎng)片和生物材料用于腹部疝修補(bǔ)的研究已大量報道，但植入陰道的研究相對比較缺乏。同樣的材料經(jīng)腹部手術(shù)證明是有用的，而其用于陰道手術(shù)中可能無效[15]。本實驗將材料植入陰道更好地反映其作為盆底補(bǔ)片的生物相容性。

本實驗結(jié)果表明,ABM有良好的生物相容性,為其將來應(yīng)用于盆底重建替代材料方面奠定了一定基礎(chǔ)。在下一步工作中,針對盆底重建替代材料需要在體內(nèi)持久修復(fù)的要求，將ABM進(jìn)行改性處理，以提高抗酶解能力和維持力學(xué)性能的穩(wěn)定，同時延長體內(nèi)植入時間，觀察材料植入體內(nèi)后生物力學(xué)性能的變化，為該材料應(yīng)用于盆底修復(fù)重建提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn):

[1] 周逸丹，朱蘭，郎景和．脫細(xì)胞組織工程補(bǔ)片在盆底修復(fù)手術(shù)中的應(yīng)用[J]．中國微創(chuàng)外科雜志，2011，11(7)：652-654，658．

[2] Hodde J.Naturally occurring scaffolds for soft tissue repair and regeneration[J].Tissue Eng,2002,8(2):295-308.

[3] Badylak S,Meurling S,Chen M,et al.Resorbable bioscaffold for esophageal repair in a dog model[J].J Pediatr Surg,2000,35(7):1097-1103.

[4] Bolland F,Korossis S,Wilshaw SP,et al.Development and characterisation of a full-thickness acellular porcine bladder matrix for tissue engineering[J].Biomaterials,2007,28(6):1061-1070.

[5] Yang B,Zhang Y,Zhou L,et al.Development of a porcine bladder acellular matrix with well-preserved extracellular bioactive factors for tissue engineering[J].Tissue Eng Part C Methods,2010,16(5):1201-1211.

[6] Huffaker RK,Muir TW,Rao A,et al.Histologic response of porcine collagen-coated and uncoated polypropylene grafts in a rabbit vagina model[J].Am J Obstet Gynecol,2008,198(5):582.

[7] Birch C.The use of prosthetics in pelvic reconstructive surgery[J].Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol,2005,19(6):979-991.

[8] Wu MP,Huang KH,Long CY,et al.The distribution of different surgical types for female stress urinary incontinence among patients′ age,surgeons′ specialties and hospital accreditations in Taiwan:a descriptive 10-year nationwide study[J].Int Urogynecol J Pelvic Floor Dysfunct,2008,19(12):1639-1646.

[9] Karlovsky ME,Kushner L,Badlani GH.Synthetic biomaterials for pelvic floor Reconstruction[J].Curr Urol Rep,2005,6(5):376-384.

[10] Badylak SF,Freytes DO,Gilbert TW.Extracellular matrix as a biological scaffold material:Structure and function[J].Acta Biomater,2009,5(1):1-13.

[11] CrapoPM,GilbertTW,BadylakSF.Anoverviewoftissueandwholeorgandecellularization

processes[J].Biomaterials,2011,32(12):3233-3243.

[12] 張真，盧曉風(fēng)，李幼平，等．生物材料有效性和安全性評價的現(xiàn)狀與趨勢[J]．生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2002，19(1)：117-121．

[13] Liu L,Li D,Wang Y,et al.Evaluation of the biocompatibility and mechanical properties of xenogeneic(porcine) extracellular matrix(ECM) scaffold for pelvic reconstruction[J].Int Urogynecol J,2011,22(2):221-227.

[14] Pierce LM,Rao A,Baumann SS,et al.Long-term histologic response to synthetic and biologic graft materials implanted in the vagina and abdomen of a rabbit model[J].Am J Obstet Gynecol,2009,200(5):546.