ELISA法檢測動物血液、尿液及臟器中藥物殘留量

丁 丹方友平王有祥楊勇敏徐丹華

1.湖北省十堰市動物產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心，湖北十堰 442000；2.湖北省十堰市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，湖北十堰 442000

ELISA法檢測動物血液、尿液及臟器中藥物殘留量

丁 丹1方友平2王有祥2楊勇敏2徐丹華1

1.湖北省十堰市動物產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心，湖北十堰 442000；2.湖北省十堰市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，湖北十堰 442000

為了探尋較為方便、有效的藥物殘留測定方法，十堰市動物衛(wèi)生監(jiān)督所和十堰市動物產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心進(jìn)行了利用動物血液來檢測克倫特羅含量的技術(shù)嘗試，分別采集動物血液、臟器和尿液進(jìn)行克倫特羅含量檢測，發(fā)現(xiàn)不同部位樣品的克倫特羅含量有差異性、相關(guān)性和規(guī)律性。

ELISA法；血液；尿液；肝臟；藥物殘留

酶聯(lián)免疫法（ELISA）基本原理是：把受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)，結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受體物質(zhì)的量有一定的比例，加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化水解或發(fā)生氧化還原反應(yīng)而成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。ELISA法具有靈敏性高等特點，廣泛應(yīng)用于動物體內(nèi)藥物殘留測定。然而，人們往往將動物尿液和臟器作為樣品進(jìn)行檢測，但臟器只能屠宰后才可進(jìn)行檢測，尿液采集也因條件限制費工費時。能否利用動物血液來檢測克倫特羅（俗稱“瘦肉精”）含量，十堰市動物衛(wèi)生監(jiān)督所和十堰市動物產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心對此進(jìn)行了技術(shù)嘗試。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器及試劑

Sunrise酶標(biāo)儀（濾光片波長為450 nm/630 nm）、離心機(jī)（3 000～4 000 r/min）、微量移液器（10～300 μL，單道、多道）。酶聯(lián)免疫試劑盒Ⅲ、Ⅳ型（由北京維德維康生物技術(shù)公司生產(chǎn)）：克倫特羅酶標(biāo)板、標(biāo)準(zhǔn)品工作液（濃度分別為0.0、0.1、0.3、0.9、 2.7、8.1 μg/L）、高濃度（100 μg/L）標(biāo)準(zhǔn)品、克倫特羅酶標(biāo)記物濃縮液及稀釋液、洗滌液、底物A液及B液、終止液、組織提取液等。

1.2 試驗動物

隨機(jī)挑選8頭健康的育肥豬，平均體重60 kg左右，按常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲水，飼喂配合日糧（不含抗菌藥物），于飼料中添加5 mg/kg鹽酸克倫特羅，連續(xù)飼喂20 d。

1.3 樣品測定

分別于飼喂期第0（6 h）、1、2、3、5、7、10、14、20天采集豬的尿液和血液檢測克倫特羅含量，再于停藥期第0（6 h）、1、2、4、8、10、14、20天采集對應(yīng)豬的尿液和血液進(jìn)行檢測。停藥當(dāng)天，采集血液和尿液后，隨機(jī)選擇4頭豬屠宰，采其肝臟，對應(yīng)編號，測定克倫特羅的含量；停藥第20天，屠宰剩余4頭豬，測定肝臟中克倫特羅的含量。

1）樣品的制備。尿樣和血樣：將飼喂期及停藥期第0（6 h）、1、2天采集的尿液離心、取上清液稀釋100倍待用，血液稀釋10倍待用；再將停藥期第4、8、10、14、20天采集的尿液離心、稀釋10倍待用，血液不稀釋。肝臟樣品：取2 g均質(zhì)后的樣品，加入6 mL稀釋好的組織提取液，充分渦動2 min，4 200 r/min以上離心10 min，取上清液待檢。

2）溶液的配制。用酶標(biāo)記物稀釋液按1∶10配制酶標(biāo)記物工作液，待用；用去離子水按1∶20配制洗滌工作液，取上清液進(jìn)行檢測。

3）檢測步驟。每孔分別加入標(biāo)準(zhǔn)品、待測樣品（標(biāo)準(zhǔn)品和樣品做兩孔平行試驗）各20 μL；然后加入已稀釋的克倫特羅酶標(biāo)記物50 μL，蓋好蓋板膜，輕輕振蕩酶標(biāo)板，充分混合后，室溫（25℃）下避光反應(yīng)30 min；洗板后，每孔加入100 μL底物（A、B溶液按體積比1∶1混合），室溫下避光反應(yīng)10～15 min，每孔加入50 μL終止液，于酶標(biāo)儀450 nm波長（參考波長630 nm）處測定結(jié)果。

1.4 添加回收試驗

添加濃度為2 μg/L的克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)工作液，8個平行，方法同樣品檢測方法。

1.5 數(shù)據(jù)分析

各標(biāo)準(zhǔn)品或樣品的平均吸光度值，除以零標(biāo)（濃度為0 μg/L標(biāo)準(zhǔn)品）的吸光度值，乘以100%，即可得到各標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)吸光度的百分比。以吸光度的百分比為縱坐標(biāo)、標(biāo)準(zhǔn)品濃度的自然對數(shù)為橫坐標(biāo)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。將待檢樣品的吸光度的百分比代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出樣品對應(yīng)的濃度，再乘以樣品的稀釋倍數(shù)，即為樣品實際殘留量。

用RIDAWIN數(shù)據(jù)分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得出試料中克倫特羅的含量。

2 結(jié)果與分析

1）飼喂克倫特羅6 h后，豬尿液和血液中即出現(xiàn)高含量的克倫特羅，8頭豬尿液中的克倫特羅殘留量達(dá)到242.0～916.0 μg/L，血液中的殘留量達(dá)到6.2～13.8 μg/L，詳見表1。

喂藥期間，豬尿液和血液中的克倫特羅殘留量總體呈上升趨勢，并呈一定的正相關(guān)性，y＝86.17x－326.06，r＝0.968 4，在飼喂第10天達(dá)到高峰，詳見表2。

2）停藥后0～2 d，豬尿液和血液中克倫特羅殘留量迅速下降，分別由停藥當(dāng)天的502.50、14.40 μg/L下降到停藥2 d后的73.30、5.43 μg/L，隨后下降緩慢；停藥后第14天克倫特羅殘留量仍高于中國農(nóng)業(yè)部規(guī)定的豬尿中最高檢測殘留量1 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)，詳見表3。

在整個休藥期間，尿液中克倫特羅含量和血液中克倫特羅含量也呈正相關(guān)性，y＝38.869x＋146.73，r＝0.958 7。停藥當(dāng)天肝組織中克倫特羅含量高達(dá)1 823.30 μg/L，說明克倫特羅容易在肝組織中累積；停藥第20天屠宰，肝組織中克倫特羅平均殘留量為6.83 μg/L，仍然超標(biāo)，易引發(fā)中毒事件。

3）每次檢測均設(shè)置添加回收試驗，回收率范圍在78.9%～94.2%。被檢樣品送省內(nèi)大專院校運用GC-MS法進(jìn)行驗證，與實驗室檢測結(jié)果相符。

表1 飼喂6 h后血液和尿液中克倫特羅殘留量 μg/L

表2 飼喂期血液和尿液中克倫特羅平均殘留量 μg/L

表3 休藥期各組織克倫特羅殘留含量 μg/L

3 討 論

通過試驗表明，隨著飼喂時間的延長，克倫特羅在豬體內(nèi)的含量逐步上升并在豬體內(nèi)累積，存在相對穩(wěn)定的趨勢。在停藥后第20天檢測血液，仍能檢測到克倫特羅殘留量，而人們往往忽視了血液中克倫特羅殘留的監(jiān)控。本試驗表明，運用ELISA技術(shù)檢測血液中克倫特羅含量，從而監(jiān)控生豬是否違禁添加克倫特羅是可行的。對于獸醫(yī)部門來說，血液是最容易獲得、也是覆蓋面最全的樣品，因此可通過檢測血液中克倫特羅含量，達(dá)到動物活動篩選的目的，從而從源頭上控制動物產(chǎn)品安全。

ELISA法是檢測克倫特羅較高效的免疫分析法，也是國家標(biāo)準(zhǔn)中動物性食品中克倫特羅的篩選方法。從本次試驗可以看出，用ELISA試劑盒檢測克倫特羅，具有較高的靈敏度和特異性，適用于大批量血液樣品中克倫特羅的定性與定量檢測，能較好地滿足基層實驗室對生豬克倫特羅含量的檢測。

目前我國規(guī)定組織中的最高殘留限量為不得檢出，但ELISA方法為快速篩選方法，存在假陽性情況，因此農(nóng)業(yè)部規(guī)定的陽性判定限為1 μg/L。從本次試驗結(jié)果可知，停藥后第20天尿液和肝組織中克倫特羅含量超標(biāo)，而血液中克倫特羅含量為0.93 μg/L，略低于判定標(biāo)準(zhǔn)。因此，以血液作為檢測對象時，檢測陽性判定限越低越好，可參考?xì)W盟組織的規(guī)定（0.5 μg/L）。

家禽免疫方法多 春季飲水最簡便

春季是疫病的高發(fā)期，適時進(jìn)行免疫是有效控制疫病發(fā)生的重要手段。家禽免疫方法很多，但其最簡便的方法就是飲水免疫法。

飲水免疫以其方便、省事、省力、應(yīng)激小等優(yōu)點，已被大多數(shù)養(yǎng)殖戶接受。但很多養(yǎng)殖戶對飲水免疫的操作規(guī)程和具體實施細(xì)節(jié)還認(rèn)識不透徹，不能夠充分發(fā)揮飲水免疫的作用，從而造成免疫失敗。所以要想使飲水免疫收到最理想的效果，必須注意以下9點。

1）使用高效弱毒疫苗。飲水前必須注意疫苗的質(zhì)量、有效期。不可使用劣質(zhì)、過期疫苗及貯存不當(dāng)?shù)囊呙纭?/p>

2）飲水免疫前，將供水系統(tǒng)、飲水器具徹底清洗干凈，但不能用消毒劑和洗滌劑處理。飲水器具不能用金屬制品，最好用瓷器和塑制器具。

3）飲水免疫用水應(yīng)是蒸餾水、冷開水或清潔的深井水。水中不應(yīng)含有重金屬離子和鹵族元素。自來水應(yīng)煮沸后放置過夜再使用。對大型養(yǎng)雞場，可在自來水中加入去氧劑，每10 L水中加入10%的硫代硫酸鈉3～10 mL，具體用量還要看水中的氯含量而定。

4）疫苗應(yīng)開瓶倒入水中，用潔凈木棍攪拌均勻。如果室外風(fēng)大，應(yīng)在室內(nèi)進(jìn)行稀釋。最好在稀釋液中加入0.2%～0.5%的脫脂奶粉或山梨糖醇，以保護(hù)疫苗效價。

5）飲水免疫前應(yīng)停水3～6 h，停水時間長短應(yīng)視室溫高低和飼料干濕程度靈活掌握。室溫高且喂干粉料時，停水時間短些；室溫低時，停水時間長些。

6）飲水前必須按照雞群數(shù)量多少、雞齡大小確定飲水器的數(shù)量，使90%以上的雞能同時飲到足夠的疫苗水。雞群大、飲水器不足時可分批進(jìn)行，防止疫苗失效。

7）稀釋疫苗的水量要適宜，不可過多或過少，應(yīng)參照疫苗使用說明、免疫雞日齡大小和數(shù)量以及當(dāng)時的室溫來確定。疫苗水應(yīng)1～2 h內(nèi)飲完，但為了讓每只雞都能飲到足夠量的疫苗，飲水時間又不應(yīng)少于1 h?？稍谟靡呙缜? d連續(xù)記錄雞的飲水量，取其平均值以確定飲水量。

8）炎熱季節(jié)，飲水免疫宜在清晨進(jìn)行，應(yīng)避開高溫時間。疫苗稀釋液不得暴露在陽光下。

9）飲水免疫前后2 d（合計5 d，最好是7～10 d）內(nèi)飲水、飼料中不得加入能滅殺疫苗中病毒（或細(xì)菌）的藥物及消毒劑。

來源：農(nóng)村報

2014-01-20

楊勇敏

丁 丹，女，1977年生，碩士，獸醫(yī)師。