空心李組織培養(yǎng)條件研究

陳衛(wèi)雪，石開(kāi)明，李闖，周夢(mèng)瑩，楊秋玲，池政松

（湖北民族學(xué)院林學(xué)園藝學(xué)院，湖北恩施 445000）

空心李組織培養(yǎng)條件研究

陳衛(wèi)雪，石開(kāi)明*，李闖，周夢(mèng)瑩，楊秋玲，池政松

（湖北民族學(xué)院林學(xué)園藝學(xué)院，湖北恩施 445000）

[目的]探索空心李實(shí)生苗高效再生系統(tǒng)的培養(yǎng)基類(lèi)型和培養(yǎng)基配方。[方法]以沿河沙子、香蜜空心、紅心道、東門(mén)3號(hào)4個(gè)品種的空心李為試驗(yàn)材料，研究空心李組織培養(yǎng)過(guò)程中的一些關(guān)鍵技術(shù)措施。以4種李成年嫁接樹(shù)梢尖、帶芽莖段為外植體，研究空心李嫁接樹(shù)營(yíng)養(yǎng)器官組織培養(yǎng)的主要調(diào)控因素及控制外植體微生物污染的措施，建立完整、高效、實(shí)用的空心李組織培養(yǎng)快速繁殖體系。[結(jié)果]研究結(jié)果表明，春季生長(zhǎng)的植物體內(nèi)存在大量生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素和赤霉素等生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，因而組織培養(yǎng)時(shí)成活率高、生長(zhǎng)快；不同條件的培養(yǎng)結(jié)果不同，空心李種子發(fā)苗的最佳方案是成熟種子在半固體1/2MS萌發(fā)后，轉(zhuǎn)至固體MS上培養(yǎng)；不同外植體的培養(yǎng)結(jié)果是帶腋芽的莖段繁殖系數(shù)大于莖尖，差異達(dá)到顯著水平；在激素配比中，細(xì)胞分裂素6-BA與生長(zhǎng)素NAA濃度配比適當(dāng)時(shí)有利于叢生芽的誘導(dǎo)和分化。[結(jié)論]最適合空心李幼穗的6-BA濃度為0.5 mg/L，而健壯梢則為1.0 mg/L；NAA濃度以1.0 mg/L為好。

空心李；組織培養(yǎng)；快速繁殖

李子（Prunus salicinaLindl.）為薔薇科李屬植物李果實(shí)。李果實(shí)清爽味甘甜，具有促進(jìn)胃酸和酶活性的增加、治療消化不良的功效，同時(shí)具有防氧化、抗衰老的作用，深受人們喜愛(ài)?？招睦钭鳛槔罟麑?shí)重要特色種類(lèi)之一，其果品色澤鮮艷，營(yíng)養(yǎng)豐富，脆嫩香酥[1]。據(jù)報(bào)道，秭歸空心李果實(shí)的感官性狀和理化性質(zhì)等達(dá)到甚至超過(guò)許多國(guó)內(nèi)外優(yōu)良李品種[2]。

空心李的童期比較長(zhǎng)，加上雌性器官敗育，因?yàn)殚L(zhǎng)期雜交繁殖形成了遺傳基因組成高度雜合，造成病毒危害非常廣泛，目前已知的約有30種病毒易侵染李屬果樹(shù)。常規(guī)的扦插或嫁接方法繁殖速度慢、苗質(zhì)差、易變異，已成為空心李生產(chǎn)發(fā)展的制約因素[3]。由于空心李苗木繁殖較易使病毒、病原體傳播，擴(kuò)大病毒寄主范圍，從而造成植株長(zhǎng)勢(shì)衰弱、產(chǎn)量減少、品質(zhì)變劣的品種退化現(xiàn)象，給空心李生產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重阻礙。利用植物組織培養(yǎng)進(jìn)行空心李立體快速繁殖既可克服傳統(tǒng)方法的缺點(diǎn)，又能獲得具有高度一致而同時(shí)具有優(yōu)良表型的群體。因此，空心李的組織培養(yǎng)在空心李遺傳育種、生理生化、培養(yǎng)無(wú)病毒苗及快速繁殖無(wú)性系等方面的研究都有重要的意義。

關(guān)于李組織培養(yǎng)快速繁殖的報(bào)道遠(yuǎn)少于柑橘和蘋(píng)果。在為數(shù)不多的報(bào)道中，所使用的材料均為李種子萌發(fā)的試管實(shí)生苗。目前，我國(guó)學(xué)者在研究李屬植物組培方面的試材已有歐洲李[4]、秭歸空心李[5]、紫葉李[6]等。利用傳統(tǒng)的方式進(jìn)行繁殖，存在播種發(fā)芽率低、成本高等很多弊端，不能適應(yīng)市場(chǎng)對(duì)良種空心李的大量需求。通過(guò)高效組織培養(yǎng)再生體系的建立，能有效克服上述弊端，為空心李的原體苗木快速繁殖、遺傳育種、基因轉(zhuǎn)化提供一條新的途徑。采用組織培養(yǎng)技術(shù)可進(jìn)行李種質(zhì)資源創(chuàng)新、縮短育種周期和培育無(wú)病毒苗木等。筆者以4個(gè)品種的空心李無(wú)菌種子、莖尖、莖段為試材，研究空心李莖尖和莖段培養(yǎng)、胚培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)等對(duì)芽增殖的影響，旨在為空心李組織培養(yǎng)的進(jìn)一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

空心李組織培養(yǎng)快速繁殖系統(tǒng)的建立以沿河、香蜜空心、紅心道李、東門(mén)3號(hào)成熟種子為試材。取自成年空心李樹(shù)上嫩枝，梢尖、帶芽莖段為外植體。

1.2 方法

該試驗(yàn)培養(yǎng)條件為白天25℃，夜晚18℃；光照強(qiáng)度1 000～2 000 lx；光周期L/D=16/8；相對(duì)濕度（RH）80%。瓊脂用量為6.0 g/L。蔗糖純度為分析純，激素濃度單位為mg/L，培養(yǎng)基pH 5.8。相關(guān)化學(xué)試劑的配制：75%的酒精、0.1%升汞、蒸餾水、MS培養(yǎng)基、1/2MS培養(yǎng)基。莖尖消毒、莖尖的剝離、莖段消毒等技術(shù)方法參考文獻(xiàn)[7]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同類(lèi)型種子與培養(yǎng)條件對(duì)種子萌發(fā)及后期分化的影響

將成熟與未成熟種子接種于不加激素的1/2MS、MS的固體和半固體啟動(dòng)培養(yǎng)基上，正交設(shè)計(jì)不同培養(yǎng)組合與直觀(guān)分析結(jié)果見(jiàn)表1。固體1/2MS培養(yǎng)基是常用于種子萌發(fā)的培養(yǎng)基。柚子在種子萌發(fā)階段中，種子在半固體培養(yǎng)基上比固體培養(yǎng)基上更容易啟動(dòng)萌發(fā)，這可能與半固體培養(yǎng)基有更好的流動(dòng)性有關(guān)，使種子能與營(yíng)養(yǎng)成分充分地接觸，更容易充分吸收營(yíng)養(yǎng)。MS培養(yǎng)基作為組培常用的培養(yǎng)基，其上萌發(fā)出的無(wú)菌苗比l/2MS培養(yǎng)基上萌發(fā)的無(wú)菌苗更粗壯，這可能與MS含有較高含量的無(wú)機(jī)元素有關(guān)。發(fā)苗的最佳方案是成熟種子在半固體1/2MS上萌發(fā)后，轉(zhuǎn)至固體MS上培養(yǎng)。

2.2 不同激素組合對(duì)誘導(dǎo)不定芽的影響

由表2可以看出，當(dāng)培養(yǎng)基中添加低濃度的6-BA和NAA時(shí)，對(duì)外植體的成活率沒(méi)有顯著影響，但隨著2種激素濃度的增加，外植體的成活率明顯降低，當(dāng)激素濃度達(dá)到最大（6-BA 1.0 mg/L、NAA 1.0 mg/L）時(shí)，只有27%～35%外植體出芽。該研究數(shù)據(jù)表明，在不添加激素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，莖段只有其本身的腋芽原基分化形成的腋芽，均未有新的不定芽生成；在只添加6-BA的情況下，低濃度時(shí)，隨著6-BA濃度的增加，芽數(shù)逐漸增大，6-BA濃度為0.5 mg/L時(shí)，總芽數(shù)最大可達(dá)127個(gè)（40個(gè)莖段外植體），進(jìn)一步增加6-BA的濃度時(shí)，繁殖系數(shù)反而降低；當(dāng)在培養(yǎng)基中同時(shí)添加2種激素時(shí)，以6-BA 0.5 mg/L、NAA 0～0.5 mg/L激素配比的培養(yǎng)基繁殖系數(shù)最高，與其他處理的差異達(dá)到極顯著；當(dāng)只添加NAA時(shí)，40株外植體最多產(chǎn)生72個(gè)芽，增殖率很低。因此，細(xì)胞分裂素6-BA與生長(zhǎng)素NAA濃度配比適當(dāng)時(shí)有利于叢生芽的誘導(dǎo)和分化。

2.3 不同外植體的培養(yǎng)對(duì)不定芽發(fā)生的影響

由表3可知，4種空心李的莖尖和莖段離體培養(yǎng)中，大部分的外植體都能夠形成叢生芽，叢生芽生長(zhǎng)勢(shì)較強(qiáng)；其出芽比例受外植體的影響較大，莖段的出芽比例大于莖尖，一般1個(gè)莖段可以形成4～5個(gè)不定芽，而莖尖段只有2～3個(gè)不定芽，差異達(dá)到顯著水平。

表1 種子萌發(fā)的直觀(guān)分析結(jié)果及生長(zhǎng)情況

表2 不同激素組合對(duì)幼嫩莖段誘導(dǎo)不定芽的影響

表3 不同外植體對(duì)不定芽發(fā)生的影響

3 結(jié)論與討論

（1）同一品種不同取材部位外植體再生能力不同，沿河沙子和香蜜空心的莖段直接出芽能力均高于莖尖。相關(guān)研究海沃德獼猴桃離體繁殖時(shí)表明，最初來(lái)自根段的莖尖外植體發(fā)生側(cè)枝的數(shù)量和發(fā)生根的數(shù)量、長(zhǎng)度、干重及鮮重都高于來(lái)自莖段的莖外植體和側(cè)芽外植體[8-9]。而該試驗(yàn)對(duì)沿河沙子空心李和香蜜空心李的莖段、莖尖外植體直接出芽能力作了分析，結(jié)果表明，2份品種均以莖段直接出芽能力最高，更有利于快速繁殖和培養(yǎng)，從遠(yuǎn)離基部的表面誘導(dǎo)出芽苗的數(shù)目較多。

（2）在離體繁殖時(shí)，多年生木本植物選擇外植體的取材時(shí)期非常重要。耿文娟等[4]研究發(fā)現(xiàn)，野生歐洲李組織培養(yǎng)條件是5—6月的半年生枝梢為材料效果最好。而該試驗(yàn)中空心李的外植體主要來(lái)自于自剪期前后至半木質(zhì)化的春梢，其次為早秋梢，時(shí)間因物候期稍有差異，試驗(yàn)結(jié)果基本與耿文娟等研究結(jié)果相吻合。這可能一方面與新梢自身的發(fā)育狀況有關(guān)，另一方面也與新梢發(fā)育過(guò)程中隨季節(jié)變化體內(nèi)內(nèi)源激素種類(lèi)、含量的變化有關(guān)。

[1]楊磊.沿河縣沙子空心李栽培技術(shù)[J].農(nóng)技服務(wù)，2012（5）：86-87.

[2]鄧中美，何正權(quán)，陳發(fā)菊，等.秭歸空心李選育[J].中國(guó)林副特產(chǎn)，2007（5）：58.

[3]鄒英寧，李國(guó)懷.李組織培養(yǎng)研究進(jìn)展（綜述）[J].亞熱帶植物科學(xué)，2005（4）：76-80.

[4]耿文娟，吳玉霞，袁海英，等.野生歐洲李組織培養(yǎng)技術(shù)[J].經(jīng)濟(jì)林研究，2009（1）：45-50.

[5]鄧中美，何正權(quán)，陳發(fā)菊，等.秭歸空心李嫁接苗快速繁育技術(shù)研究[J].中國(guó)南方果樹(shù)，2007（2）：71-72.

[6]馬志波，王恭祎.紫葉李組織培養(yǎng)及其移植成活率研究[J].林業(yè)實(shí)用技術(shù)，2008（3）：6-8.

[7]張秀麗.歐李組織培養(yǎng)體系試驗(yàn)研究[D].保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[8]張海平，周建峰，任目瑾.海沃德獼猴桃組織培養(yǎng)快速繁育技術(shù)研究[J].陜西林業(yè)科技，2011（2）：8-11.

[9]吳秀華，張艷玲，周月，等.‘海沃德’獼猴桃葉片高頻直接再生體系的建立[J].植物生理學(xué)報(bào)，2013（8）：759-763.

（責(zé)任編輯 張楊林）

Research on Tissue Culture of Prunus salicina

CHEN Wei-xueet al.(College of Forestry and Horticulture,Hubei Institute for Nationalities,Enshi,Hubei 445000)

[Objective]The aim was to establish a optimal medium type system,optimum medium for efficient regeneration of Prunus salicina seedlings.[Method]Taking mature embryos of Yanhe plum,Xiangmikongxin plum,Honxindao plum and Dongmen3 plum as materials,the key technical measures of tissue culture of Prunus salicina were researched.Moreover,according to four grapefruit trees grafted tip and stems with buds as explants,the main regulatory factors of vegetative organs and tissue culture explants and the measures to control microbial contamination were studied.In following that,a complete practical and efficient grapefruit rapid propagation technology system was established.[Result]The results showed that there were a lot of auxin, cytokinins and gibberellins and other growth regulators,and thus tissue culture high survival rate,fast-growing plants growing in spring.What’s more,it presented different results by different culture conditions.The best solution was culturing on MS after the semi-solid 1/2 MS with mature seeds.Culturing results indicated that the axillary buds propagation coefficient greater than the shoot tips of stems and the differences were significant.It also pointed out that 6-BA and NAA concentration ratio was conducive to the induction and differentiation.[Conclusion]This study showed that the most appropriate 6-BA concentration was 0.5mg/L for tender spike,1.0 mg/L for mature spike,and the NAA concentration was 1.0mg/L as well.

Prunus salicina;Tissue culture;Rapid propagation

S66

A

2095-0896（2014）02-047-03

湖北省教育廳項(xiàng)目（Q20122902）；湖北民族學(xué)院林學(xué)園藝學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目（LXDC1324）。

陳衛(wèi)雪（1994-），女，湖北恩施人，本科生，專(zhuān)業(yè)：園林。*通訊作者，講師，博士，從事林學(xué)園藝植物遺傳育種方面的研究，E-mail：skm331@163.com

2014-01-27