厚樸汁炙遠(yuǎn)志炮制品對(duì)胃間質(zhì)細(xì)胞活力影響的探討

唐丹霞，王建，鄭新光，黃大智

·藥理毒理·

厚樸汁炙遠(yuǎn)志炮制品對(duì)胃間質(zhì)細(xì)胞活力影響的探討

唐丹霞，王建，鄭新光，黃大智

目的：探索研究不同劑量厚樸汁炙遠(yuǎn)志炮制品對(duì)胃間質(zhì)細(xì)胞活力的影響。方法：將實(shí)驗(yàn)分成空白組、遠(yuǎn)志組、厚樸組、厚樸汁炙遠(yuǎn)志高、中、低劑量組、遠(yuǎn)志配厚樸1:2組七個(gè)不同劑量組對(duì)培養(yǎng)的胃間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，24 h后采用四唑鹽比色實(shí)驗(yàn)（MTT法），考察厚樸炮制遠(yuǎn)志的水煎液及其含藥血清對(duì)胃間質(zhì)細(xì)胞活力的影響。結(jié)果：厚樸汁炙遠(yuǎn)志炮制品水煎液對(duì)胃間質(zhì)細(xì)胞活力的影響結(jié)果顯示，與單味生遠(yuǎn)志20 g．kg-1組比較，空白組、單味厚樸10 g．kg-1組、炮制高劑量30 g．kg-1組、遠(yuǎn)志配厚樸1:2（30 g．kg-1）組的胃間質(zhì)細(xì)胞OD值均顯著增高（F=2.750，P=0.024）；厚樸汁炙遠(yuǎn)志炮制品含藥血清對(duì)胃間質(zhì)細(xì)胞活力的影響結(jié)果顯示，炮制高劑量30 g．kg-1組、遠(yuǎn)志配厚樸1:2（30 g．kg-1）組的含藥血清的胃間質(zhì)細(xì)胞OD值均顯著高于空白組（F=10.22，P=0.000）；且單味厚樸10 g．kg-1組、炮制高劑量30 g．kg-1組、遠(yuǎn)志配厚樸1:2組（30 g．kg-1）的OD值均顯著高于單味遠(yuǎn)志組（F=10.22，P＜0.05）。結(jié)論：遠(yuǎn)志有抑制胃動(dòng)力起搏細(xì)胞活性趨勢(shì)，單味厚樸組、厚樸汁炙遠(yuǎn)志炮制品組、遠(yuǎn)志配厚樸1:2組均能極顯著促進(jìn)胃間質(zhì)細(xì)胞活力，從而促進(jìn)胃動(dòng)力，故推測(cè)厚樸能通過(guò)促進(jìn)胃間質(zhì)細(xì)胞的活力，在配伍和炮制過(guò)程中降低遠(yuǎn)志對(duì)胃間質(zhì)細(xì)胞造成的傷害，而達(dá)到緩解胃腸動(dòng)力障礙的目的。

]遠(yuǎn)志；厚樸；炮制品；胃間質(zhì)細(xì)胞；MTT

炮制是中藥應(yīng)用中不可缺少的一門技術(shù)，其主要目的是減毒、增效、矯味、糾性、保質(zhì)量、純凈藥材、易于貯存。通過(guò)藥汁制備藥物是以中醫(yī)藥基本理論為原則，治法為依據(jù)，針對(duì)病情需要，結(jié)合藥物特性進(jìn)行組合炮制。研究發(fā)現(xiàn)，遠(yuǎn)志為臨床常用藥，具有安神益智、祛痰止咳、消腫止痛[1]的功效，長(zhǎng)期應(yīng)用能顯著抑制胃腸動(dòng)力[2]，厚樸汁炮制遠(yuǎn)志是較為罕有的炮制方式[3]。其理論基礎(chǔ)是厚樸與遠(yuǎn)志配伍能有效降低遠(yuǎn)志的胃腸毒副作用，同時(shí)也保留了遠(yuǎn)志的功效。由配伍的基礎(chǔ)研究，延生到炮制的應(yīng)用研究，既可以增加炙遠(yuǎn)志的應(yīng)用范圍，亦能突出遠(yuǎn)志的臨床應(yīng)用，便于廣大的醫(yī)療工作者和患者接受。

鑒于此，本次實(shí)驗(yàn)以胃Cajal間質(zhì)細(xì)胞（ICC）為切入點(diǎn)，研究厚樸汁炙遠(yuǎn)志對(duì)ICC細(xì)胞活力的影響，為從細(xì)胞水平闡釋厚樸汁炙遠(yuǎn)志緩解胃腸動(dòng)力障礙的科學(xué)內(nèi)涵，也為臨床合理用藥提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)與方法

1.1 試驗(yàn)藥物

遠(yuǎn)志、厚樸均購(gòu)于西南藥都中藥材市場(chǎng)，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)盧先明教授鑒定為遠(yuǎn)志Polygala tenuifolia Willd.的干燥根，厚樸Magnolia officinalis Rehd.et Wils.的樹皮、干皮，均屬《中華人民共和國(guó)藥典》收載品種。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小鼠，出生后9～14天，SD 種大鼠，180～220 g，雌雄不拘，由成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK(川)2004-11。

1.3 試劑

類標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清（蘭州民海公司，批號(hào)：20120905）；完全DMEM培養(yǎng)基（Gibco產(chǎn)品，批號(hào)：904862）；二型膠原酶（Biosharp公司，批號(hào)：0458）；DMSO（Sigma公司，批號(hào)：0231）；MTT（Sigma公司，批號(hào)：0793）；SCF(PEPROTECH 公司，批號(hào)110978H1014)；羊抗兔FITC 標(biāo)記熒光抗體( Vector，批號(hào)：91387) ；封閉用羊血清( 北京中杉金橋，批號(hào)L2104)；c-kit 抗體( 武漢博士德) 。

1.4 實(shí)驗(yàn)器材

酶標(biāo)定量測(cè)定儀（Thermo Multiskan AsCant公司）；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（日本SANYO公司）；超凈工作臺(tái)（蘇州安泰公司）；倒置顯微鏡（日本OLYMPUS）；微量移液器(芬蘭)；MILL-Q純水儀(美國(guó)Millipore公司) 。

1.5 含藥血清的制備

取健康SD大鼠35只，體重180～ 220 g，雌雄兼用，按性別體重隨機(jī)將大鼠分為空白組，厚樸10 g．kg-1組，遠(yuǎn)志20 g．kg-1組，厚樸汁炙遠(yuǎn)志炮制品含藥血清高劑量30 g．kg-1（1：2）組，炮制品中劑量15 g．kg-1（1：2）組，炮制品低劑量7.5 g．kg-1（1：2）組，遠(yuǎn)志配厚樸1:2組30 g．kg-1。每組5只，每只小鼠按10 mL．kg-1灌胃給予相應(yīng)藥液，空白組給予同體積生理鹽水,連續(xù)給藥3 d，分2次給藥（早、晚）。最后1 d一次性給藥60 min后，股總動(dòng)脈取血。靜置4℃冰箱，60 min后離心3000 r/min×10 min，收集各組的上清血清， 經(jīng)0.45 μm 的濾器過(guò)濾除菌，滅活56℃ 30 min。將含藥血清用培養(yǎng)基稀釋成15%體積，置- 20℃冰箱備用。

1.6 方法

1.6.1 胃間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng) 取出生12 d的健康昆明種小鼠，禁食18 h，頸部脫臼致死，固定鼠的頭及四肢，碘伏、酒精消毒，立即剖開腹腔，自賁門和幽門處分離組織，取出胃( 包括胃底、胃體和幽門)置于4 ℃PBS液( 200 U．mL-1抗菌素) 小心去除系膜，沿小彎緣剪開胃， 洗凈內(nèi)容物， 銳性去除黏膜和黏膜下層。將分離出的肌肉組織置于含1 mL二型膠原酶的小燒瓶中剪碎至約1～2 mm3小塊，轉(zhuǎn)移至含9 mL二型膠原酶( 1.3 mg．mL-1) 培養(yǎng)皿中37℃消化25～30 min。于消化結(jié)束后的組織液中加入等體積PBS液，離心1500 r /min×3 min。棄去上清，DMEM重懸細(xì)胞與等體積小鼠淋巴分離液上離心2000 r/min×6 min，取液面交界細(xì)胞層，加入含5 ng．mL-1的15%胎牛血清的培養(yǎng)基，吹打，混勻，再接種到96孔板中。37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，24 h后換液棄去未貼壁細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)，以后每2～3 d換液一次。

1.6.2 MTT法 將接種了GICC 的96孔板培養(yǎng)至8d (對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期) ，依據(jù)空白組、遠(yuǎn)志組、厚樸組、厚樸汁炙遠(yuǎn)志高、中、低劑量組、遠(yuǎn)志配厚樸1:2組分組，分別滴加原生藥液。24 h后， 每孔加入MTT 溶液( 5 mg．mL-1) 20 μL，37℃繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)。小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μL DMSO，震蕩10 min，使充分溶解。選擇490 nm波長(zhǎng)，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔光吸收( OD) 值，記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 c-kit免疫熒光鑒定、正常細(xì)胞倒置顯微鏡下形態(tài)如下圖1、2。

圖2 倒置顯微鏡各型ICC（×100）

Cajal形成3～5個(gè)細(xì)胞厚的薄細(xì)胞層，其細(xì)胞突起以縫隙連接互相聯(lián)系成ICC網(wǎng)絡(luò)并與平滑肌細(xì)胞聯(lián)系。培養(yǎng)3 d后，可分辨出胃間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，胞體是三角形，可見大的細(xì)胞核，核周胞質(zhì)少，突起伸展。培養(yǎng)5 d后，胃間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)更加清晰，自胞體發(fā)出的突起向周圍伸長(zhǎng)（圖1）。培養(yǎng)7 d后，相鄰胃間質(zhì)細(xì)胞突起間有連接形成，部分胃間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞突起與鄰近平滑肌細(xì)胞也形成連接（圖2）。培養(yǎng)9 d后，胃間質(zhì)細(xì)胞突起向各方向伸出，在初級(jí)分支上還可見二級(jí)分支，與相鄰胃間質(zhì)細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞形成連接，胃間質(zhì)細(xì)胞突起交織，形成小的、較為分散的網(wǎng)絡(luò)。

2.2 厚樸汁炙遠(yuǎn)志炮制品水煎液對(duì)胃間質(zhì)細(xì)胞活力的影響

結(jié)果顯示，與空白組比較，單味厚樸組、炮制高劑量組的OD值均顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）；與單味遠(yuǎn)志組比較，單味厚樸組、炮制高劑量組、遠(yuǎn)志配厚樸1:2組的OD值也顯著增加（P＜0.05）。與空白組比較，單味遠(yuǎn)志組的OD值略有下降趨勢(shì)，但無(wú)顯著性差異（P＞0.05），實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 厚樸汁炙遠(yuǎn)志炮制品水煎液對(duì)胃間質(zhì)細(xì)胞活力的影響(±s，n=7)

表1 厚樸汁炙遠(yuǎn)志炮制品水煎液對(duì)胃間質(zhì)細(xì)胞活力的影響(±s，n=7)

注：與空白組比較： * P＜0.05；與遠(yuǎn)志組比較：△P＜0.05

組別 劑 量（μg．μL-1） OD（OD490）空白組 同體積DMEM液 0.675±0.055遠(yuǎn)志組 5 0.670±0.130厚樸組 10 0.716±0.176*△厚樸汁炙遠(yuǎn)志藥液高劑量組 15 0.842±0.159*△厚樸汁炙遠(yuǎn)志藥液中劑量組 7.5 0.778±0.104厚樸汁炙遠(yuǎn)志藥液低劑量組 3.75 0.626±0.060遠(yuǎn)志配厚樸1:2組 15 0.814±0.129△

2.3 厚樸汁炙遠(yuǎn)志炮制品含藥血清對(duì)胃間質(zhì)細(xì)胞活力的影響

結(jié)果顯示，與空白組比較，單味遠(yuǎn)志含藥血清能顯著降低OD值（P＜0.05 )；但單味厚樸組、炮制高劑量組、配伍1∶2含藥血清組的OD值均顯著高于空白組（P＜0.05）；與單味遠(yuǎn)志含藥血清比較，單味厚樸組、炮制高劑量組、遠(yuǎn)志配厚樸1:2組的OD值極顯著升高（P＜0.01），實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 厚樸汁炙遠(yuǎn)志炮制品含藥血清對(duì)胃間質(zhì)細(xì)胞活力的影響(±s，n=7 )

表2 厚樸汁炙遠(yuǎn)志炮制品含藥血清對(duì)胃間質(zhì)細(xì)胞活力的影響(±s，n=7 )

注：與空白組比較： * P＜0.05，**P＜0.01；與遠(yuǎn)志組比較：△P＜0.05,△△P＜0.01

組別 給藥劑量（g．kg-1） OD（OD490）空白組 生理鹽水 0.546±0.066△遠(yuǎn)志組 10 0.459±0.037*厚樸組 20 0.553±0.075*△△厚樸汁炙遠(yuǎn)志含藥血清高劑量組 30 0.729±0.054**△△厚樸汁炙遠(yuǎn)志含藥血清中劑量組 15 0.510±0.042厚樸汁炙遠(yuǎn)志含藥血清低劑量組 7.5 0.518±0.071遠(yuǎn)志配厚樸1:2含藥血清組 30（1 2） 0.624±0.070*△△

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)單味遠(yuǎn)志具有抑制胃腸動(dòng)力和粘膜損傷的副作用，為了降低遠(yuǎn)志的不良反應(yīng)，課題組前期從炮制角度展開了較系統(tǒng)研究，結(jié)果表明遠(yuǎn)志的毒性成分即皂苷類部位能在體內(nèi)造成的胃腸動(dòng)力障礙，這種作用可以得到厚樸中的主要成分（如：厚樸酚、和厚樸酚等）的有效緩解[1]，即厚樸汁炙遠(yuǎn)志炮制品具有減毒增效的作用。Cajal間質(zhì)細(xì)胞分布于整個(gè)胃腸道[4]，是胃腸道的起搏細(xì)胞，并在神經(jīng)信號(hào)傳遞中起著重要作用[5～6]，與某些胃動(dòng)力疾病的發(fā)病有關(guān)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，遠(yuǎn)志能顯著，抑制ICC活力，厚樸配遠(yuǎn)志1∶2能顯著增強(qiáng)ICC活力[7]?；谝陨匣A(chǔ)，本次實(shí)驗(yàn)以厚樸汁炙遠(yuǎn)志炮制品為研究重點(diǎn)，建立成熟的體外模型，再次開展關(guān)于炮制品“減副存效”的研究。其結(jié)果顯示，水煎液中遠(yuǎn)志有抑制胃動(dòng)力起搏細(xì)胞活性的趨勢(shì)，而含藥血清中，遠(yuǎn)志組能顯著抑制ICC活性（* P＜0.05）；炮制品高劑量組、配伍組不管是水煎液還是含藥血清均能顯著增強(qiáng)GICC活性。說(shuō)明此炮制方法對(duì)于體外實(shí)驗(yàn)可取。而含藥血清實(shí)驗(yàn)結(jié)果更顯著提示采用含藥血清的方，法觀測(cè)對(duì)生長(zhǎng)狀況良好的ICC影響，既可避免對(duì)細(xì)胞的刺激性又能反映藥物吸收后的作用原理。原生藥液的pH值、滲透壓等會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)帶來(lái)不利影響，導(dǎo)致細(xì)胞損傷，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，而含藥血清則可排除此種影響，這可能與藥物在體內(nèi)代謝之后成分有所變化有關(guān)，具體物質(zhì)代謝基礎(chǔ)及生物學(xué)機(jī)制，還有待今后深入研究。

關(guān)于GICC的體外培養(yǎng)方法報(bào)道較多，但實(shí)驗(yàn)過(guò)程中影響因素較多，培養(yǎng)過(guò)程艱難，故對(duì)培養(yǎng)小鼠GICC作出以下經(jīng)驗(yàn)總結(jié)：①消化過(guò)程中，時(shí)間不易掌握，實(shí)驗(yàn)開始前，將消化液置于37℃孵箱中預(yù)熱，使酶的活性達(dá)到最佳。將組織洗凈后應(yīng)置于1 mL消化液中剪碎，使其表面能與酶充分接觸，剪碎之后再將組織轉(zhuǎn)移至含有9 mL消化液的玻璃培養(yǎng)瓶中，夏季消化30 min，冬季可延長(zhǎng)消化至35 min，15 min吹打一次，這是本次實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的創(chuàng)新點(diǎn)。②由于胃體平滑肌發(fā)達(dá)，故雜細(xì)胞較多，離心過(guò)濾之后DMEM重懸細(xì)胞與等體積小鼠淋巴分離液再次離心2000 r/min×6 min，取液面交界細(xì)胞層，加入含5 ng．mL-1的15%胎牛血清的培養(yǎng)基，吹打，混勻，再接種到96孔板中。

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（責(zé)任編輯：陳思敏）

The effect of Yuanzhi decoction processed with Houpo juice on the mice interstitial cells of Cajal/

TANG Dan-xia, WANGJian, ZHENG Xin-guang, HUANG Da-zhi//(Pharmacy College, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; The Ministry of Education Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine; State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources Co-founded by Sichuan Province and MOST, Chengdu 611137, China )

Objective: To explore the effect of Yuanzhi decoction processed with Houpo juice on the miceinterstitial cells of Cajal. Method: The research objectives was divided into seven different groups that named blank group, Yuanzhi group, Houpo group, Yuanzhi decoction processed with Houpo juice high, middle, low groups, Yuanzhi with Houpo 1:2 group. And then the MTT method was used to investigate the effect of Yuanzhi decoction processed with Houpo juice and its drug-containing serum on the mice Interstitial cells of Cajal after 24 hours. Result: The result of Yuanzhi decoction processed with Houpo juice showed that compared with the Yuanzhi 10 g．kg-1group, GICC OD values of the blank group, Houpo juice 30 g．kg-1, high processing 30 g/kg dose group, Yuanzhi with Houpo juice 1:2 (30 g．kg-1) were signifcantly increased （F=2.750，P=0.024）. The infuence of containing medicine serum of Yuanzhi decoction processed with Houpo on GICC showed that OD values of GICC of processing high 30 g．kg-1dose group, Yuanzhi with Houpo juice 1:2 (30 g．kg-1) of drug-containing serum of were signifcantly higher than the blank group (F=10.22，P=0.000). And OD values of Houpo juice 10 g．kg-1, high processing 30 g．kg-1dose group, Yuanzhi with Houpo 1:2 (30 g．kg-1) were signifcantly higher than in Yuanzhi group (F=10.22，P＜0.05). Conclusion: Yuanzhi can restrain the activity of GICC pacemaker cytoactive. Houpo group, Yuanzhi decoction processed with Houpo juice products, Yuanzhi with Houpo 1:2 groups can signifcantly promote the GICC vitality to promote gastric dynamics. So it can be speculated that Houpo reduce the harm from Yuanzhi during the process of compatibility and processing, and achieve the purpose of ease gastrointestinal disorders by promoting gastric interstitial cells of Cajal vitality.

Yuanzhi；Houpo；processed products；gastric interstitial cells of Cajal; MTT

R 285.5

A

1674-926X(2014)02-018-03

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，四川 成都 611137

唐丹霞（1987-），碩士研究生，主要從事中藥理論與應(yīng)用研究 Email:tom_779@163.com

王建，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥理論與應(yīng)用研究 Email:jianwang08@163.com

2013-08-14