黃芪多糖對環(huán)丙沙星體內(nèi)抗菌后效應(yīng)的影響

何敏，武志強，史玉榮，李翔，龔錫平，陳思敏，曾南

·藥理毒理·

黃芪多糖對環(huán)丙沙星體內(nèi)抗菌后效應(yīng)的影響

何敏，武志強，史玉榮，李翔，龔錫平，陳思敏，曾南

目的：觀察黃芪多糖預(yù)處理免疫抑制模型小鼠，對環(huán)丙沙星體內(nèi)抗菌后效應(yīng)（PAE）的影響作用。方法：采用二倍稀釋法和菌落計數(shù)法，測定環(huán)丙沙星體外抗金黃色葡萄球菌標準株ATCC25923的MIC、MBC值。黃芪多糖250 mg．kg-1連續(xù)灌胃小鼠1周，灌胃第3天和第6天小鼠分別腹腔注射150 mg．kg-1、100 mg．kg-1環(huán)磷酰胺制備免疫抑制模型；采用體外PAE誘導的方法制備含2MIC環(huán)丙沙星的菌液感染免疫抑制模型小鼠，觀察黃芪多糖對環(huán)丙沙星體內(nèi)PAE的影響，同時進行各組小鼠全血白細胞計數(shù)及胸腺與脾臟指數(shù)的測定。結(jié)果：環(huán)丙沙星體外對金黃色葡萄球菌標準株ATCC25923的MIC、MBC分別為0.06～0.12 5 μg．mL-1、0.25～1μg．mL-1。模型組小鼠胸腺、脾臟指數(shù)及白細胞計數(shù)均較空白組顯著降低（P＜0.01），表明免疫抑制模型成功。黃芪多糖與模型組比較，在感染后期對模型小鼠的胸腺、脾臟指數(shù)與白細胞計數(shù)有一定的改善作用；環(huán)丙沙星+黃芪多糖組與環(huán)丙沙星組比較，亦對上述指標有一定改善作用。黃芪多糖預(yù)處理對環(huán)丙沙星的體內(nèi)PAE無明顯延長效應(yīng)。 結(jié)論：黃芪多糖對免疫抑制感染模型小鼠的非特異性免疫功能有一定提高作用，但對環(huán)丙沙星在模型動物體內(nèi)的PAE無明顯影響。

]黃芪多糖；環(huán)丙沙星；體內(nèi)抗菌后效應(yīng)

抗菌后效應(yīng)（Post antibiotic effects， PAE）是指藥物與細菌短暫接觸后，當藥物清除或低于最小抑菌濃度時細菌生長仍受到持續(xù)抑制的效應(yīng)[1]。臨床資料表明，某些具有抗菌作用的中藥與抗菌藥物聯(lián)合使用可增強其抗菌作用[2]。依據(jù)目前對PAE機制認識的抗生素后促白細胞效應(yīng)[3]，以及多數(shù)中藥多糖成分具有提高機體免疫功能，升高白細胞數(shù)目的研究基礎(chǔ)，本實驗采用黃芪多糖預(yù)防給藥，以金黃色葡萄球菌感染免疫抑制小鼠為模型，觀察黃芪多糖對環(huán)丙沙星體內(nèi)PAE的影響，擬從促白細胞效應(yīng)角度為中藥輔助抗菌藥物抗感染治療提供一定實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 KM小鼠，SPF級，體重18～22g，雌雄各半，四川省醫(yī)學科學院實驗動物研究所提供，合格證號：scxk（川）2008-24。

1.1.2 藥物與試劑 環(huán)丙沙星，地奧集團成都藥業(yè)股份有限公司，批號120101。 環(huán)磷酰胺，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號12042125。黃芪多糖（純度95%），陜西森弗生物技術(shù)有限公司，批號HQDT121203。M-H(A)培養(yǎng)基、M-H(B)培養(yǎng)基均由OXOID提供。

1.1.3 菌株 金黃色葡萄球菌標準株ATCC25923，四川省抗菌素工業(yè)研究所惠贈。原始菌種于甘油中保存于－20℃冰箱。試驗用菌制備：采用接種環(huán)取原始菌一環(huán)，涂布于M-H(A)平板復(fù)活后，選取長勢良好的單一菌團接種于M-H(A)斜面，35℃隔夜孵育后，密封，4℃冷藏保存?zhèn)溆茫粚嶒炃耙惶烊⌒泵婢磕ㄓ贛-H(A)平板，35℃孵育過夜復(fù)活，即可使用。

1.1.4 儀器與試劑 MEK-6318K全自動血細胞分析儀(日本光電儀器公司)；HZQ-C空氣浴搖床(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)公司)；BPH-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限能公司)；電子天平(Sartorius公司)；麥氏比濁儀(法國 bio Merieuxsa)。

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

2.1.1 環(huán)丙沙星體外抗菌活性測定 采用二倍稀釋法和菌落計數(shù)法，測定環(huán)丙沙星對濁度為1×106CFU．mL-1的金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC25923的最小抑菌濃度（MIC）、最小殺菌濃度（MBC），求得MBC/MIC值，試驗重復(fù)3次。

2.1.2 體外PAE的誘導及藥物的去除 PAE的誘導采用體外藥物接觸法[4]，用已滅菌的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基將受試藥物環(huán)丙沙星配成濃度為20 MIC的藥液。取藥液0.5 mL加入含4.0 mL營養(yǎng)肉湯的試管中，每管再加入0.5 mL濁度為1×108個/mL菌液，使混合液藥物最終濃度為2 MIC，標為試驗管（T），同時設(shè)對照管（C），由4.5 mL營養(yǎng)肉湯與0.5mL菌液混合。各管渦旋混勻后，37℃恒溫培養(yǎng)1 h。采用800倍稀釋除藥法，即藥物誘導1 h后，取T、C管中的菌液0.1 mL，分別加入含1.9 mL37℃預(yù)溫的營養(yǎng)肉湯試管中，充分混勻后再吸取0.1 mL菌液，分別加入另外含3.9 mL37℃預(yù)溫的營養(yǎng)肉湯的試管中，備用。

2.1.3 動物分組、給藥及造模 健康KM小鼠，雌雄各半，按體重分層、性別隨機分為空白組，感染模型組，環(huán)丙沙星（感染菌液含環(huán)丙沙星0.12 μg．mL-1）組，黃芪多糖（ig.250 mg．kg-1）組，黃芪多糖（ig.250 mg．kg-1）+環(huán)丙沙星（感染菌液含環(huán)丙沙星0.12 μg．mL-1）組。動物感染菌液前黃芪多糖組、黃芪多糖+環(huán)丙沙星組分別灌胃給予黃芪多糖，連續(xù)7天[5]，其余各組給予等體積蒸餾水。除空白組小鼠外，其余各組小鼠在灌胃第3天和第6天分別腹腔注射環(huán)磷酰胺150 mg．kg-1、100 mg．kg-1造成免疫抑制。

2.1.4 體內(nèi)PAE的測定與計算[4]除空白組小鼠，其余各組小鼠股部肌肉注射實驗“1.5.2”中經(jīng)PAE誘導和藥物去除后的菌液0.1 mL進行感染，其中環(huán)丙沙星、環(huán)丙沙星+黃芪多糖組注射T管菌液，模型組、黃芪多糖組注射C管菌液，此時計為動物感染后的零時，各組感染小鼠分別于動物感染后0、2、4、6、8、10 h處死5只，無菌剖取其股部針眼周圍肌肉0.1 g，0℃無菌生理鹽水制成10%的勻漿液，取稀釋的勻漿液10μl（通過預(yù)試，確定感染0 h，2、4、6h，8、10 h樣品的稀釋倍數(shù)分別為0、10、100倍）接種平板進行菌落計數(shù)[6]，得出CFU．mL-1值。按公式PAE=T-C 計算。其中T為實驗組（環(huán)丙沙星組、黃芪多糖組、環(huán)丙沙星+黃芪多糖組）細菌的CFU．mL-1高于感染后零時10倍所需要的時間；C為模型組細菌的CFU．mL-1高于感染后零時10倍所需要的時間。同時，各組小鼠處死前眼眶取血，進行白細胞計數(shù)；亦剖取小鼠胸腺與脾臟，計算胸腺、脾臟指數(shù)?？瞻捉M小鼠不感染菌液，僅同法操作取血進行白細胞計數(shù)、剖取胸腺與脾臟。試驗重復(fù)1次。

2.2 結(jié)果

2.2.1 環(huán)丙沙星體外抗菌活性測定 實驗測得環(huán)丙沙星體外抗金黃色葡萄球菌ATCC25923的MIC為0.06～0.125 μg．mL-1，MBC為0.25～1 μg．mL-1，MBC/MIC值為4，與文獻報道基本一致[7]。

2.2.2 黃芪多糖對模型小鼠胸腺、脾臟指數(shù)的影響 見表1、表2。空白組與模型組比較，可見模型組小鼠胸腺、脾臟指數(shù)顯著低于空白組（p＜0.01），提示環(huán)磷酰胺免疫抑制模型成功。黃芪多糖組與模型組比較，小鼠胸腺指數(shù)有一定的升高，脾臟指數(shù)變化不明顯；黃芪多糖+環(huán)丙沙星組在感染8～10 h內(nèi)，小鼠的胸腺、脾臟指數(shù)相比較于環(huán)丙沙星組有增高趨勢。

表1 黃芪多糖對環(huán)磷酰胺造模小鼠胸腺指數(shù)的影響（±s，n=9）

表1 黃芪多糖對環(huán)磷酰胺造模小鼠胸腺指數(shù)的影響（±s，n=9）

注：與各時間點模型組比較，**p＜0.01

組 別 劑量 胸腺指數(shù)（g/g體重*100%）（mg．kg-1） 0 h 4 h 6 h 8 h 10 h空白組 --- 0.33±0.10**模型組 --- 0.12±0.04 0.075±0.020 0.074±0.036 0.087±0.022 0.082±0.037黃芪多糖 250 0.109±0.47 0.097±0.033 0.087±0.020 0.093±0.027 0.093±0.037環(huán)丙沙星 --- 0.093±0.024 0.10±0.023 0.11±0.050 0.097±0.023 0.098±0.065黃芪多糖+環(huán)丙沙星 250 0.094±0.042 0.091±0.033 0.10±0.043 0.14±0.096 0．14±0．051

表2 黃芪多糖對環(huán)磷酰胺造模小鼠脾臟指數(shù)的影響（±s，n=9）

表2 黃芪多糖對環(huán)磷酰胺造模小鼠脾臟指數(shù)的影響（±s，n=9）

注：與各時間點模型組比較，**p＜0.01

組 別 劑量 脾臟指數(shù)（g/g體重*100%）（mg．kg-1） 0 h 4 h 6 h 8 h 10 h空白組 --- 0.37±0.14**模型組 --- 0.17±0.055 0.13±0.028 0.14±0.068 0.16±0.036 0.17±0.040黃芪多糖 250 0.17±0.426 0.16±0.037 0.13±0.039 0.14±0.044 0.14±0.033環(huán)丙沙星 --- 0.12±0.232 0.14±0.017 0.16±0.022 0.14±0.024 0.15±0.033黃芪多糖+ 250 0.15±0.05 0.16±0.042 0.15±0.037 0.17±0.045 0.17±0.052環(huán)丙沙星

2.2.3 黃芪多糖對模型小鼠白細胞計數(shù)的影響 見表3、表4?？瞻捉M與模型組比較，其白細胞計數(shù)明顯高于模型組（p＜0.01），提示免疫抑制模型成功。黃芪多糖組在感染4～10 h內(nèi)，白細胞計數(shù)較模型組有增高的趨勢；在整個感染過程中，環(huán)丙沙星組與黃芪多糖+環(huán)丙沙星組小鼠白細胞計數(shù)均呈現(xiàn)先升后降的趨勢，且后者在感染10 h時高于前者。試驗進行2次。

表3 黃芪多糖對環(huán)磷酰胺造模小鼠白細胞計數(shù)的影響(±s，n=5，第1次)

表3 黃芪多糖對環(huán)磷酰胺造模小鼠白細胞計數(shù)的影響(±s，n=5，第1次)

注：與各時間點模型組比較，**p＜0.01；*p＜0.05

組 別 劑量 全血白細胞計數(shù)（×109個/L）（mg．kg-1） 0 h 4 h 6 h 8 h 10 h空白組 --- 8.18±1.78**模型組 --- 1.3±0.5 0.98±0.66 0.90±0.12 0.78±0.18 0.54±0.25黃芪多糖 250 0.48±0.21 1.57±0.60 0.94±0.41 1.04±0.62 0.92±0.11*環(huán)丙沙星 --- 0．54±0．34 1.08±0.50 2.78±1.95 2.44±2.16 0.48±0.20黃芪多糖+環(huán)丙沙星 250 0.66±0.23 1.04±0.56 0.78±0.18 0.88±0.46 0.78±0.18

表4 黃芪多糖對模型小鼠白細胞計數(shù)的影響(±s，n=5，第2次)

表4 黃芪多糖對模型小鼠白細胞計數(shù)的影響(±s，n=5，第2次)

注：與各時間點模型組比較，**p＜0.01；*p＜0.05

組 別 劑量 全血白細胞計數(shù)（×109個/L）（mg．kg-1） 0 h 4 h 6 h 8 h 10 h空白組 --- 2.86±0.59**模型組 --- 1.56±0.91 0．84±0．73 0.76±0.53 0.65±0.31 0.44±0.22黃芪多糖 250 1.40±0.79 1.36±0.33 0.82±0.20 0.72±0.49 0.57±0.28環(huán)丙沙星 --- 0.76±0.25 0.96±0.29 0.90±0.22 0.52±0.29 0.72±0.31黃芪多糖+環(huán)丙沙星 250 1.05±0.76 1.3±0.67 0.60±0.36 0.85±0.33 0.87±0.41*

2.2.4 黃芪多糖對環(huán)丙沙星體內(nèi)PAE的影響 見表5。兩次實驗分別測得環(huán)丙沙星體內(nèi)PAE為2 h、1.24 h，黃芪多糖預(yù)處理對此無影響。環(huán)丙沙星兩次實驗獲得的PAE不一致，主要與體內(nèi)實驗中感染的菌量不一致有關(guān)。

表5 黃芪多糖對環(huán)丙沙星體內(nèi)PAE的影響（h，n=5）

3 討論

中藥黃芪具有補脾升陽，益肺固表，利尿消毒，托毒生肌等功效，主要含皂苷類、多糖類、黃酮類化合物，具有增強機體免疫功能、促進骨髓造血功能、抗?jié)?、抗病原微生物等藥理作用[8,9]。其中有效成分黃芪多糖[10]具有良好的免疫調(diào)節(jié)作用，表現(xiàn)為促進抗體生成，增強巨噬細胞吞噬細菌、病毒等微生物的能力，還能增強小鼠NK細胞活性，增強T、B淋巴細胞功能而提高機體抗菌、抗病毒作用；黃芪多糖亦能抑制內(nèi)毒素（LPS）誘導的巨噬細胞產(chǎn)生TNF-α、IL-1β及NO等炎性介質(zhì)，從而減輕病毒及細菌對機體的炎癥損傷[11]。目前，PAE已成為評價新的抗菌藥物、設(shè)計合理給藥方案的重要參考指標，現(xiàn)代研究也認為臨床上中藥與抗菌類化學藥物聯(lián)合應(yīng)用[2]，可發(fā)揮一定的增效減毒作用。本實驗基于黃芪多糖的研究基礎(chǔ)，從PAE的抗生素后促白細胞效應(yīng)機制出發(fā)，提出具有免疫增強作用的黃芪多糖能延長抗菌藥物PAE的工作假設(shè)，采用體外PAE誘導、體內(nèi)PAE測定方法觀察黃芪多糖預(yù)處理對環(huán)丙沙星抗金黃色葡萄球菌PAE的影響作用，結(jié)果表明黃芪多糖對環(huán)丙沙星體內(nèi)PAE并無明顯影響；但從環(huán)磷酰胺免疫抑制模型動物的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)及全血白細胞計數(shù)等指標結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，該模型的免疫抑制效應(yīng)成功，黃芪多糖對此有一定提高趨勢。

本次實驗測定PAE選用的是體外PAE誘導（抗菌藥物與細菌體外接觸）的方法。該法操作簡便，符合PAE理論，利于測定清除藥物后細菌恢復(fù)對數(shù)生長的時間，然而該方法易致模型對照組與給藥組的細菌感染力度出現(xiàn)差異，致使測得的PAE存在一定誤差，且不能完全復(fù)制機體感染細菌、服藥至藥物消除這一過程，這可能是兩次實驗環(huán)丙沙星PAE不一致的原因。此外，實驗所用的中性粒細胞減少小鼠免疫抑制模型，環(huán)磷酰胺腹腔注射給予小鼠后，小鼠體內(nèi)白細胞計數(shù)急劇降低，黃芪多糖在短時間內(nèi)對其并無明顯的改善作用，推測是黃芪多糖對環(huán)丙沙星體內(nèi)PAE影響不明顯的原因之一。

基于黃芪多糖的抗菌抗病毒研究基礎(chǔ)，雖然本次實驗未發(fā)現(xiàn)其對環(huán)丙沙星抗金黃色葡萄球菌的體內(nèi)PAE有明顯影響，但僅提示黃芪多糖對此抗菌藥物、對此菌種感染的影響，黃芪多糖與其他類抗菌藥物聯(lián)用是否能影響其體內(nèi)PAE或與環(huán)丙沙星合用對其他感染菌（臨床分離的致病菌）的影響有待進一步研究。此外，在今后的試驗中可嘗試采用藥物與細菌在體內(nèi)接觸的方法，借助感染組織支架模型或兔腦膜炎模型等來測定黃芪多糖對抗菌藥物體內(nèi)PAE的影響。

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（責任編輯：陳思敏）

Effects of Astragalus Polysaccharides on PAE of ciprofoxacin in vivo/

HE Min, WU Zhi-qiang, SHI Yu-rong, LI Xiang, GONGXi-ping, CHEN Si-min, ZENG Nan//(Pharmacy College, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; The Ministry of Education Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine; State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources Co-founded by Sichuan Province and MOST, Chengdu 611137, China)

Objective: To observe the effects of Astragalus polysaccharide on Post antibiotic effect (PAE) of ciprofloxacin in immunosuppression mice that pretreated by Astragalus polysaccharide. Method: The MIC/MBC value of ciprofloxacin on standard strains of Staphylococcus aureus (ATCC25923) in vitro were measured by using two times dilution method and colony counting method. Mice were orally administrated of Astragalus polysaccharide 250 mg．kg-1for one week, and on third and sixth day mice were given cyclophosphamide 150 mg．kg-1or 100 mg．kg-1to induce immune suppression through intraperitoneal injection. By using the method of inducing PAE in vitro, bacteria liquid which containing 2MIC ciprofoxacin was prepared. Then the immunosuppression model mice were infected by above bacteria liquid, and the effects of Astragalus polysaccharides on PAE of ciprofoxacin in vivo were observed. And the blood leukocyte count and the thymus/spleen index were measured in mice. Result: The MIC and MBC of ciprofoxacin on ATCC25923 were 0.06 μg．mL-1～ 0.125 μg．mL-1and 0.25 μg．mL-1～ 1μg．mL-1respectively in vitro. Compared with control group, the spleen and thymus index and white blood cell counting of model group were significantly decreased (P＜0.01), which indicated that the immunosuppression model in mice was successful. In the later stage of infection, compared with the model group, Astragalus polysaccharide could improve the thymus/spleen index and white blood cell counting in mice. Compared the ciprofoxacin group with (ciprofoxacin + astragalus polysaccharides) group, the later group also showed the improving effects on organ index and white blood cell counting. But no signifcant difference on PAE of ciprofoxacin was observed by pretreatment with Astragalus polysaccharide in vivo. Conclusion: Astragalus polysaccharide can increase the function of nonspecifc immunity in immune suppressed mice which infected by Staphylococcus aureus, but can not extend the PAE of ciprofoxacin in vivo in the same mice model.

Astragalus polysaccharide; ciprofoxacin; antibacterial effect in vivo

R 285.5

A

1674-926X(2014)02-021-04

四川省教育廳自然科學重點項目(09ZA027,13ZA028)

成都中醫(yī)藥大學藥學院 中藥材標準化教育部重點實驗室 中藥資源系統(tǒng)研究與 開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137

何敏（1987-），女，碩士研究生在讀，從事中藥藥理及毒理研究

Tel:13699449392 Email:364801391@qq.com

曾南（1969-），女，教授，博導，主要從事中藥藥理及毒理研究 Email:zengnan966@126.com

2013-10-12