魚腥草藥材揮發(fā)油提取工藝優(yōu)化及其成分分析

何剛，卿光明，李敏，王興貴，趙春艷，周海玉

·品種品質(zhì)·

魚腥草藥材揮發(fā)油提取工藝優(yōu)化及其成分分析

何剛1，卿光明2，李敏1，王興貴2，趙春艷1，周海玉1

目的：優(yōu)選水蒸氣蒸餾法提取魚腥草干品藥材揮發(fā)油提取工藝，分析魚腥草干品藥材揮發(fā)油的組成。方法：采用正交實驗法設(shè)計魚腥草揮發(fā)油提取工藝，以魚腥草揮發(fā)油中4-萜品醇、α-松油醇、乙酸龍腦酯、甲基正壬酮4種成分為評價指標(biāo)，采用加權(quán)評分方法對提取方法進(jìn)行分析，篩選水蒸氣蒸餾法提取魚腥草干品藥材的揮發(fā)油的提取條件。并選用GC/MS法分析揮發(fā)油成分。結(jié)果：最佳提取工藝：剪碎成1 cm小段；料液比為1:15；浸泡30 min；提取5 h。并鑒定了魚腥草干品藥材揮發(fā)油中53種揮發(fā)性成分。結(jié)論：該提取工藝簡便、合理，能準(zhǔn)確反映藥材的質(zhì)量。

]魚腥草；正交試驗；GC/MS；成分分析

魚腥草為三白草科蕺菜屬植物蕺菜Houttuynia cordata Thunb.的干燥地上部分，具有清熱解毒、消腫排膿、利尿通淋的功效[1]。現(xiàn)代藥理實驗研究表明魚腥草揮發(fā)油具有抗菌、抗炎、抗病毒等作用[2]。其揮發(fā)油中主要含萜類化合物[3]，魚腥草干品藥材的揮發(fā)油多采用水蒸氣蒸餾法提取[4～7]，且多以甲基正壬酮的含量作為其提取方法的評價指標(biāo)。本實驗對水蒸氣蒸餾法提取魚腥草干品藥材揮發(fā)油的提取工藝進(jìn)行了系統(tǒng)考察，并選用4-萜品醇、α-松油醇、乙酸龍腦脂、甲基正壬酮4種成分為指標(biāo)，對各項指標(biāo)采用加權(quán)評分方法進(jìn)行分析，優(yōu)選出魚腥草干品藥材最佳提取條件，為其食品藥品領(lǐng)域的開發(fā)與應(yīng)用提供依據(jù)。

1 實驗材料與儀器

1.1 實驗材料

實驗材料為2012年6月采集于四川美大康中藥材種植有限責(zé)任公司魚腥草基地，為三白草科蕺菜屬植物蕺菜(Houttuynia cordata thumb.)的干燥地上部分(所有樣品經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室李敏教授鑒定)。

1.2 儀器與試藥

儀器 Agilent7890A/5975C,GC/MSD

試藥 甲基正壬酮對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:118034-200502)；乙酸龍腦酯對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號:110759-200604）；α-松油醇對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:111859-201001)；4-萜品醇對照品（江蘇金壇市威德龍化學(xué)有限公司，純度98.0 %）；正十一碳烯(東京化成工業(yè)株式會社，純度大于98 %)；正己烷為色譜純；無水硫酸鈉等其他試劑為分析純。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 揮發(fā)油提取條件考察

本試驗對影響提取效果的粉碎程度、料液比、浸泡時間及提取時間4個因素進(jìn)行了考察，每個因素選擇3個水平，按照L9(34)正交表實驗，以4-萜品醇、α-松油醇、乙酸龍腦酯、甲基正壬酮4種成分的含量為評價指標(biāo)，并對試驗結(jié)果的指標(biāo)采用加權(quán)評分方法進(jìn)行分析，篩選魚腥草干品藥材最優(yōu)提取工藝，考察因素詳情見下表1：

表1 考察因素表

2.2 含量測定

2.2.1 氣相色譜質(zhì)譜系統(tǒng)適用性條件 氣相色譜條件：毛細(xì)管柱為HP-5(30 m×0.25 mm×250 μm)彈性石英毛細(xì)管柱。程序升溫條件：初始溫為70 °C，保持5 min，升溫速度為5 ℃/min到140 ℃，保持5 min，然后以升溫速度10℃/min到最終溫度250℃，保持10分鐘。進(jìn)樣口溫度為230 ℃，載氣為高純He，流速為1.0 mL/min；分流比為10:1；進(jìn)樣量為1 μl。

質(zhì)譜條件：EI為70EV，四極桿溫度為150 ℃，離子源溫度為230 ℃。

2.2.2 溶液的配制 （1）內(nèi)標(biāo)溶液的制備 取正十一碳烯適量，精密稱定，加正己烷制成每1 mL含2.0426 mg的溶液。

（2）對照品溶液的配制 分別取4-萜烯醇、α-松油醇、乙酸龍腦酯和甲基正壬酮適量，精密稱定，加正己烷分別配成1.082 mg/mL、3.6574 mg/ mL、6.064 mg/mL、2.0305 mg/mL的貯備液，分別精密移取上述對照品儲備液3、0.15、1、5 mL置10 mL量瓶中，加正己烷稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品貯備液，放于冰箱低溫保存。

（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密量取混合對照品溶液0.1、0.15、0.375、0.75、1、1.5、2mL置5mL量瓶中，精密加入0.25mL內(nèi)標(biāo)溶液，正己烷定容至刻度，即得系列混合對照品溶液，按“2.1”項下條件測定。以對照品與內(nèi)標(biāo)峰面積比(Y)為縱坐標(biāo)，以各對照品濃度(X:μg/mL)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，回歸方程見表1。結(jié)果表明4-萜烯醇、α-松油醇、乙酸龍腦酯和甲基正壬酮分別在6.492～129.84 μg/ mL，1.097～21.944 μg/mL，12.128～242.56 μg/mL，84.76～169.52 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

（4）供試品溶液的制備 取本品20 g，精密稱定，置500 mL圓底燒瓶中，按正交設(shè)計表條件進(jìn)行水蒸氣蒸餾提取，提取完成后，冷卻至室溫，取正己烷層，加適量無水Na2SO4，振搖，正己烷液移至10 mL量瓶中，并用適量正己烷，洗滌無水硫酸鈉，洗液并入同一量瓶中，精密加入1 mL內(nèi)標(biāo)溶液，加正己烷稀釋至刻度，搖勻，即得。

（5）測定 分別精密吸取各供試品溶液各1 μl，注入氣相色譜儀，按“2.1”項下方法測定，即得。

2.3 實驗結(jié)果與分析

正交試驗結(jié)果及結(jié)果分析：按照4因素3水平，進(jìn)行試驗，結(jié)果見表2。

表2 L9(34)正交設(shè)計試驗結(jié)果

8 3 2 1 3 4.84 0.44 11.03 35.99 87.07 9 3 3 2 1 5.15 0.52 10.21 36.56 90.03Ⅰ 218.38 249.45 254.14 257.92Ⅱ 289.52 254.56 255.42 250.32Ⅲ 260.75 264.64 259.09 260.41 R 23.71 5.06 1.65 3.36

采用加權(quán)評分方法對試驗結(jié)果的每項指標(biāo)進(jìn)行分析，《中國藥典》2010版一部僅以甲基正壬酮作為魚腥草薄層鑒別的定性指標(biāo)，因此，4-萜品醇、α-松油醇、乙酸龍腦酯、甲基正壬酮的權(quán)重系數(shù)分別0.2、0.2、0.2、0.4，分別把各指標(biāo)項最高的指標(biāo)定為20分、20分、20分與40分，綜合評分為100分。在統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)加權(quán)評分：4-萜品醇含量：H1=(Hi÷6.93×100)×0.2；α-松油醇含量：H2=(Hi÷0.61×100)×0.2、乙酸龍腦酯含量：H3=(Hi÷13.24×100)×0.2、甲基正壬酮含量：H4=(Hi÷40.32×100)×0.4，將每項得分加和為綜合總評分：H=H1+H2+H3+H4，對上述試驗進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 方差分析表

方差分析表明，因素A(粉碎程度)對魚腥草干品揮發(fā)油的提取有顯著影響，而因素B、C、D對凍干鮮魚腥草提取物的提取無顯著影響。由極差R得出影響因素大小順序為A＞B＞D＞C，由此得出最佳工藝組合為A2B3C3D3。即工藝條件為：取本品適量，精密稱定20 g，剪成1 cm小段，置500 mL圓底燒瓶中，加300 mL蒸餾水，浸泡30 min，水蒸氣蒸餾提取5 h，提取完成后，冷卻至室溫，取正己烷層，加適量無水Na2SO4，振搖，正己烷液移至10 mL量瓶中，并用適量正己烷，洗滌無水硫酸鈉，洗液并入同一量瓶中，精密加入1mL內(nèi)標(biāo)溶液，加正己烷稀釋至刻度，搖勻，即得。

取魚腥草樣品20g，按照理論最佳工藝進(jìn)行重復(fù)試驗(n=3)，4-萜品醇、a-松油醇、乙酸龍腦酯、甲基正壬酮的質(zhì)量數(shù)分別為 5.82 μg/g、0.65 μg/g、12.36 μg/g、40.12 μg/g，與試驗結(jié)果一致。

2.4 魚腥草干品藥材提取物的GC-MS分析

按正交試驗優(yōu)選的最佳提取條件提取魚腥草干品藥材揮發(fā)油，在“2.1”項色譜條件下進(jìn)行GC-MS分析，經(jīng)計算機(jī)檢索(質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫NISTl08)及人工解析質(zhì)譜并與標(biāo)準(zhǔn)圖核對，并參考有關(guān)文獻(xiàn)，用峰面積歸一化法定量測出它們的相對含量，結(jié)果見表4。

表4 魚腥草干品藥材揮發(fā)油的化學(xué)成分組成

26 乙酸龍腦脂(Bornyl acetate) C12H20O2196 3.29 27 甲基正壬酮(2-Undecanone) C11H22O 170 1.87 28 十一醛(Undecanal) C11H22O 170 0.56 29 α松油醇乙酸脂(α-Terpinyl, acetate) C12H20O2196 0.21 30 3-羥基苯乙酮(m-Acetylphenol) C8H8O2136 0.10 31 對 - 羥基苯乙酮.p-Hydroxyacetophenone C8H8O2136 0.12 32 1-十一醇(1-Undecanol) C11H24O 172 1.65 33 香葉醇乙酸酯(2,6-Octadien-1-ol, 3,7-dimethyl-,acetate,)C12H20O2196 3.33 34 橙花醇(2,6-Octadien-1-ol, 3,7-dimethyl-,) C12H20O2196 0.30 35 欖香烯(Elemen) C15H24204 0.50 36 十二醛(Dodecanal ) C12H24O 184 5.42 37 2-甲基-4-(2,6,6-三甲基環(huán)己-1-烯基)-2-丁烯-1-醇2-Methyl-4-(2,6,6-trimethylcyclohex-1-enyl)but-2-en-1-ol C14H24O 208 0.39 38 石竹烯(Caryophyllene) C15H24204 3.44 39 β-金合歡烯(1,6,10-Dodecatriene, 7,11-dimethyl-3-methylene-) C15H24204 0.67 40 -1,8 - 二甲基-2 - 異丙烯基-4α-1,2,3,4,4a,5,6,7-八氫萘2-Isopropenyl-4a,8-dimethyl-1,2,3,4,4a,5,6,7-octahydrona phthalene C15H24204 0.12 41 雅欖藍(lán)烯(Eremophilene) C15H24204 0.82 42 α-芹子烯(a-Selinene,) C15H24204 1.50 43 匙葉桉油烯醇(Spathulenol) C15H24O 220 0.10 44 桉油烯醇(Espatulenol) C15H24O 220 1.59 45 石竹烯氧化物(Caryophyllene oxide) C15H24O 220 3.57 46 1,2 - 環(huán)氧葎草烯(Humulene 1,2-epoxide) C15H24O 220 0.25 47 庫貝醇(Cubenol) C15H24O 220 0.14 48 α-杜松醇(α-Cadinol) C15H26O 222 0.15 49 1-甲基-6 -(3 -甲基丁-1,3-二烯基)-7-氧雜二環(huán)[4.1.0]庚烷1-Methyl-6-(3-methylbuta-1,3-dienyl)-7-oxabicyclo[4.1.0] C12H18O 178 0.60 heptane) 50 植酮(2-Pentadecanone, 6,10,14-trimethyl) C18H36O 268 0.60 51 葉綠醇(Phytol) C20H40O 296 1.10 2,2′ -雙甲烷[6-(1,1 - 二甲基乙基)-4 - 甲基苯酚]-苯乙烯(Phenol,2 ,2′-methylenebis[6-(1,1-dimethylethyl)-4-methyl -]52 C23H32O2340 0.93 53鄰苯二甲酸單乙基己基酯 (1,2-Benzenedicarboxylic acid, mono(2-ethylhexyl) ester) C16H22O4278 0.53峰面積總計 95.66

由表4可知，經(jīng)GC-MS分析后共檢出53種揮發(fā)性成分，占總峰面積的95.66%，其中萜類化合物占52.25%。揮發(fā)油中含量高的成分為：β-月桂烯（20.59%）、十二醛（5.42%）、β-水芹烯(4.49%)、α-蒎烯（4.02%）、甲基正壬酮（3.29%）、香葉醇乙酸酯（3.33%）、石竹烯（3.44%）、石竹烯氧化物（3.57%）、β-蒎烯（2.97%）、4-萜品醇（2.44%）等。

3 討論

3.1 據(jù)文獻(xiàn)報道，魚腥草干品藥材的揮發(fā)油多采用水蒸氣蒸餾法、超臨界CO2萃取、有機(jī)溶劑萃取3種不同方法提取，本試驗前期通過系統(tǒng)的條件考察研究，發(fā)現(xiàn)采用水蒸氣蒸餾法提取優(yōu)于其他兩種方法，鑒于此，本試驗對影響提取效果的粉碎程度、料液比、浸泡時間、提取時間4個關(guān)鍵因素進(jìn)行了系統(tǒng)考察。

3.2 魚腥草揮發(fā)油的提取工藝及質(zhì)量評價研究多以揮發(fā)油中的甲基正壬酮含量為指標(biāo)，而測定單一指標(biāo)，難以反映藥材質(zhì)量。本實驗以魚腥草揮發(fā)油中4-萜品醇、α-松油醇、乙酸龍腦酯、甲基正壬酮4種成分為指標(biāo)，考察水蒸氣蒸餾法提取魚腥草干品的最佳條件，得到最佳工藝，不僅能夠有效保證揮發(fā)油的質(zhì)量，同時也為魚腥草干品藥材質(zhì)量評價方法及標(biāo)準(zhǔn)的提升奠定了研究基礎(chǔ)。

3.3 魚腥草的主要有效成分為揮發(fā)油，其主要含萜類化合物，該實驗共檢出魚腥草干品藥材中53種揮發(fā)性成分，占峰面積總和的95.66%。其中含量較高的主要為β-月桂烯、十二醛、β-水芹烯、α-蒎烯、甲基正壬酮、香葉醇乙酸酯、石竹烯、石竹烯氧化物、β-蒎烯、4-萜品醇等。目前對魚腥草成分的研究較多，但都不盡相同，據(jù)文獻(xiàn)報道[8]不同產(chǎn)地的魚腥草揮發(fā)油成分有所差異，后續(xù)將對不同產(chǎn)地的魚腥草干品藥材揮發(fā)油進(jìn)行分析研究，了解不同產(chǎn)區(qū)魚腥草干品藥材中揮發(fā)油化學(xué)成分的差異，為篩選魚腥草優(yōu)良種質(zhì)提供科學(xué)依據(jù)。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010 年版一部[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:208．

[2] 李爽,于慶海,金佩珂.魚腥草的有效成分、藥理作用及臨床應(yīng)用的研究進(jìn)展[J].沈陽藥料大學(xué)學(xué)報,1997,14(2):144．

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[7] 曾虹燕,蔣麗娟,張英超.魚腥草揮發(fā)油的化學(xué)成分[J].植物資源與環(huán)境學(xué)報,2003,12(3):50.

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（責(zé)任編輯: 胡慧玲）

Optimization of extraction process and component analysis of volatile oil from Yuxingcao

/HE Gang1, QING Guang-ming2,LI Min1, WANG Xing-gui2, ZHAO Chun-yan1, ZHOU Hai-yu1// (1. Pharmacy College, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; The Ministry of Education Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine; State Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources Co-founded by Sichuan Province and MOST, Chengdu 611137, China;2. The Chinese Herbal Medicine Planting Sport Co., LTD in Sichuan, Deyang 618400, Sichuan a)

Objective: To optimize steam distillation extraction of volatile oil extraction technology of Yuxingcao, and analyze the composition of volatile oil of Yuxingcao. Method: The orthogonal experiment was used to design the extraction technology of Yuxingcao. Four ingredients including 4-terpineol, α-terpineol, bornyl acetate and methyl-n-nonylketone in Yuxingcao were used as evaluation indexes. Weighted scoring method was used to analyze extraction method and screen the water vapor distillation condition for extraction of Yuxingcao volatile oil. And volatile oil components were analyzed with gas chromatography-mass spectrometry. Result: The best extraction technology was as following: the herb was cut into segment of 1 cm, and soaked for 30 min, and then extracted for 5h, with the material liquid ratio of 1:15. And 53 volatile components were identifed in the volatile oil. Conclusion: The extraction process is simple and reasonable, which can effectively extract volatile oil and accurately refect the quality of the medicinal material.

Yuxingcao; orthogonal experiment; GC/MS; composition analysis

R 283

A

1674-926X(2014)02-005-04

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點實驗室 中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137; 2.四川美大康中藥材種植有限責(zé)任公司，四川 德陽 618400)

何剛（1988-），男，碩士研究生，研究方向：中藥品種、質(zhì)量及資源研究

Tel:15928070248 Email:qijingl@126.com

李敏，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：中藥品種、質(zhì)量及資源研究

Tel:13980038316 Email: 028limin@163.com

2013-11-18