鹽酸恩諾沙星對(duì)蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）的致毒效應(yīng)研究＊

肖 輝，蘇振霞，邊 倩

（1.江蘇省海洋資源開(kāi)發(fā)研究院，江蘇連云港 222005；2.淮海工學(xué)院海洋學(xué)院，江蘇連云港 222005）

0 引言

氟喹諾酮類藥物（Fluoroquinolones，F(xiàn)Qs）于20世紀(jì)90年代被應(yīng)用于水產(chǎn)業(yè)。由于該類藥物具有抗菌譜廣、口服給藥生物利用度高、不易產(chǎn)生耐藥性、殘留低、排泄快、毒副作用小，尤其是對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌抗菌作用強(qiáng)等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于水生動(dòng)物細(xì)菌性疾病的治療［1］。恩諾沙星（Enrofloxacin，EF）是動(dòng)物專用的氟喹諾酮類藥物之一，具有抗菌譜廣、殺菌活性強(qiáng)、體內(nèi)分布廣泛、毒副作用小、與其他抗菌藥無(wú)交叉耐藥性和敏感微生物的MIC較低等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于各種動(dòng)物感染性疾病的預(yù)防和治療，為最常用的抗菌藥物之一［2］。

恩諾沙星進(jìn)入動(dòng)物體后，除在動(dòng)物產(chǎn)品中殘留外，其原形及代謝產(chǎn)物還會(huì)隨排泄物進(jìn)入環(huán)境［3］，從而對(duì)生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生影響。通常污染物對(duì)水體生物環(huán)境的影響大多以魚(yú)類、藻類和水蚤等生物作為受試材料。小球藻屬于綠藻門(mén)，是淡水單細(xì)胞藻類中的主要天然餌料品種。在水生生態(tài)毒理研究中，單細(xì)胞綠藻往往因其周期短，易于分離、培養(yǎng)和可以直接觀察細(xì)胞水平上的中毒癥狀等優(yōu)點(diǎn)，而被用作較為理想的生態(tài)毒理研究材料［4］。關(guān)于環(huán)境污染物對(duì)藻類影響的研究已有一些報(bào)道，這些物質(zhì)包括1，2，4－三氯苯、甲胺磷、氯氰菊酯、家用洗滌劑、烷基酚、DBP、有機(jī)錫、重金屬離子等，研究?jī)?nèi)容涉及到藻類的生長(zhǎng)、藻類的光合作用色素及污染物的半效應(yīng)濃度等［5］。

我國(guó)對(duì)漁藥引起的生態(tài)環(huán)境問(wèn)題的重視程度不足，對(duì)漁用藥物的使用缺乏系統(tǒng)而深入的藥理學(xué)和毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)，因此養(yǎng)殖生產(chǎn)中普遍存在濫用藥物現(xiàn)象。目前，關(guān)于各種漁用藥物對(duì)水生生物的生態(tài)效應(yīng)以及對(duì)水生生態(tài)環(huán)境的潛在影響尚未有明確清晰的認(rèn)識(shí)和評(píng)價(jià)［6］。關(guān)于恩諾沙星的研究主要集中在其對(duì)病原菌的藥效學(xué)及藥物動(dòng)力學(xué)的研究方面［7］，因此，本文以蛋白核小球藻作為試驗(yàn)生物，探討了恩諾沙星對(duì)其的急性毒性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試藻種 蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫(kù)，編號(hào)為FACHB9。

1.1.2 供試藥品 鹽酸恩諾沙星，純度99%，浙江朗博藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。SE培養(yǎng)液采用中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所配方。

1.2 研究方法

1.2.1 藻種的馴化 在無(wú)菌條件下，蛋白核小球藻在SE培養(yǎng)液中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，并進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：溫度25℃，光暗比12h∶12h，光照強(qiáng)度為2 000lx，靜止培養(yǎng)，每天定時(shí)人工搖動(dòng)3次。鏡檢細(xì)胞正常，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)。1.2.2 預(yù)備試驗(yàn) 取10mL離心管，加入一定量的鹽酸恩諾沙星的系列質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)液和一定量的藻液，找出使蛋白核小球藻死亡的最低質(zhì)量濃度和不產(chǎn)生死亡的最高質(zhì)量濃度，以確定毒性試驗(yàn)需要的質(zhì)量濃度系列。

1.2.3 毒性試驗(yàn) 從預(yù)試驗(yàn)得到的質(zhì)量濃度間取5個(gè)濃度梯度，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組。在200mL錐形瓶中加入藻液、鹽酸恩諾沙星系列標(biāo)準(zhǔn)液，在進(jìn)行蛋白核小球藻的毒性試驗(yàn)時(shí)，毒性試驗(yàn)的藥物質(zhì)量濃度依次為0，15.625，31.25，50，62.5，125μg／mL。每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)3個(gè)平行樣，混勻后25℃恒溫培養(yǎng)，12h光暗循環(huán)，光照強(qiáng)度2 000lx，每天定時(shí)振蕩3次。蛋白核小球藻細(xì)胞初始細(xì)胞濃度為2.5×106個(gè)／mL。采用建立650nm吸光度與細(xì)胞濃度的關(guān)系式的方法來(lái)確定細(xì)胞濃度。在0，24，48，72，96h時(shí)于各瓶中取一定量藻液測(cè)定光密度，比較其與空白對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)之間的差別。根據(jù)抑制率（Y）—濃度對(duì)數(shù)（X）法計(jì)算24，48，72，96h時(shí)的相對(duì)抑制率的計(jì)算公式為

式中，N為試驗(yàn)組的藻密度，N0為對(duì)照組的藻密度［5］。1.2.4 光合色素含量的測(cè)定 培養(yǎng)96h，取10mL藻液，4 000r／min離心10min，去上清，加入5mL體積分?jǐn)?shù)為90%的丙酮，搖勻，在4℃冰箱中避光抽提24h，再4 000r／min離心10min，取上清置于1 cm比色杯中，以90%丙酮為對(duì)照，測(cè)量663，646nm波長(zhǎng)處抽提液的吸光值。

葉綠素含量計(jì)算公式［9］為

式中，Ca為葉綠素a的含量，Cb為葉綠素b的含量，以μg／mL表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白核小球藻細(xì)胞濃度與光密度的線性關(guān)系

通過(guò)計(jì)數(shù)得到的細(xì)胞濃度（y）與在650nm下測(cè)得的光密度（x）之間的回歸方程為y＝112.84x＋1.549 1（r2＝0.996 7）。通過(guò)顯微鏡計(jì)數(shù)的藻細(xì)胞濃度和測(cè)定的吸光度之間表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系（圖1）。此后實(shí)驗(yàn)中測(cè)得的光密度，均通過(guò)此方程換算成藻細(xì)胞濃度來(lái)繪制藻細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

2.2 鹽酸恩諾沙星對(duì)蛋白核小球藻生長(zhǎng)的影響

不同質(zhì)量濃度鹽酸恩諾沙星處理后，蛋白核小球藻的生長(zhǎng)曲線發(fā)生改變，結(jié)果如圖2所示。隨著鹽酸恩諾沙星處理時(shí)間延長(zhǎng)，各質(zhì)量濃度組的藻細(xì)胞生長(zhǎng)速度減慢。低質(zhì)量濃度的鹽酸恩諾沙星對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)影響不大，甚至在較低質(zhì)量濃度較短時(shí)間內(nèi)呈現(xiàn)一定的“興奮效應(yīng)”。24h后，所有添加藥物的實(shí)驗(yàn)組均表現(xiàn)出藥物的抑制效應(yīng)，鹽酸恩諾沙星對(duì)蛋白核小球藻的抑制效應(yīng)表現(xiàn)出良好的劑量—效應(yīng)關(guān)系。在整個(gè)藥物處理過(guò)程中，高質(zhì)量濃度組（≥50μg／mL）的藻生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，增長(zhǎng)速度減緩，至96h時(shí)與對(duì)照相比，僅為對(duì)照組的68%，62%和43%。

圖1 蛋白核小球藻細(xì)胞濃度與光密度的關(guān)系Fig.1 Relationship between cell density of Chlorella pyrenoidosaand OD－650nm

圖2 鹽酸恩諾沙星對(duì)蛋白核小球藻的生長(zhǎng)效應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線Fig.2 Kinetic curve of the growth of Chlorella pyrenoidosaunder the effect of Enrofloxacin hydrochloride

2.3 鹽酸恩諾沙星對(duì)蛋白核小球藻抑制率的影響

同一時(shí)間鹽酸恩諾沙星對(duì)蛋白核小球藻的抑制率，隨著藥物處理質(zhì)量濃度的增大而增大，呈現(xiàn)出良好的劑量—效應(yīng)關(guān)系，如圖3所示。低質(zhì)量濃度組（15.625，31.25，50μg／mL）隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制率增大，96h時(shí)，抑制率分別為15.17%，29.98%，33.64%。高質(zhì)量濃度組（62.5，125μg／mL）在96h時(shí)蛋白核小球藻生長(zhǎng)受抑制程度最大，抑制率分別為40.04%，61.06%。

2.4 鹽酸恩諾沙星對(duì)蛋白核小球藻的急性毒性

根據(jù)圖3的數(shù)據(jù)，采用抑制率（Y）—濃度對(duì)數(shù)（X）法計(jì)算各時(shí)間（24，48，72，96h）的EC50，如表1所示。比較各個(gè)時(shí)段的EC50值，48h和72h時(shí)最不敏感，其EC50值較大，表明在短時(shí)間內(nèi)，蛋白核小球藻自身恢復(fù)較快；隨著暴露天數(shù)的增加，EC50值減小，至96h時(shí)，EC50值最小，表明鹽酸恩諾沙星對(duì)蛋白核小球藻的毒性隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，藻自身的抗性減小，恢復(fù)減慢，此結(jié)果與蛋白核小球藻的生長(zhǎng)趨勢(shì)是一致的。

圖3 鹽酸恩諾沙星對(duì)蛋白核小球藻的生長(zhǎng)抑制率Fig.3 Inhibition rate of Enrofloxacin hydrochloride on the growth of Chlorella pyrenoidosa

表1 鹽酸恩諾沙星對(duì)蛋白核小球藻的急性毒性Table 1 Acute toxicity of Enrofloxacin hydrochloride on Chlorella pyrenoidosa

2.5 鹽酸恩諾沙星對(duì)蛋白核小球藻光合色素含量的影響

隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，各暴露組藻液與對(duì)照組相比，顏色明顯變淺，且鹽酸恩諾沙星質(zhì)量濃度越高，藻液顏色越淺。暴露96h后，各實(shí)驗(yàn)組葉綠素a、葉綠素b含量如圖4所示。蛋白核小球藻的葉綠素a、葉綠素b含量均隨鹽酸恩諾沙星質(zhì)量濃度的增加而下降。當(dāng)鹽酸恩諾沙星質(zhì)量濃度為15.625μg／mL時(shí)，與對(duì)照組相比，葉綠素含量顯著減少，表明鹽酸恩諾沙星在低質(zhì)量濃度時(shí)即對(duì)葉綠素有顯著抑制作用。其后隨著鹽酸恩諾沙星質(zhì)量濃度的升高，葉綠素含量逐漸下降，其對(duì)藻細(xì)胞產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的影響。

圖4 不同質(zhì)量濃度的鹽酸恩諾沙星對(duì)蛋白核小球藻光合色素含量的影響Fig.4 Effects of different concentrations of Enrofloxacin hydrochloride on the photosynthetic pigment contents of Chlorella pyrenoidosa

3 討論

目前關(guān)于氟喹諾酮類藥物對(duì)藻類毒性的研究報(bào)道較少。鹿金雁等［10］2007年報(bào)道了諾氟沙星對(duì)水生生物的影響，指出諾氟沙星對(duì)斜生柵藻也有明顯的毒性作用，96h的EC50為50.18mg／L，并且斜生柵藻對(duì)諾氟沙星的敏感性比大型溞強(qiáng)，諾氟沙星屬于低等毒性的化合物。王翔等［6］2006年報(bào)道了鹽酸環(huán)丙沙星（CPFX）對(duì)小球藻的急性毒性，CPFX對(duì)小球藻的96hEC50為20.61mg／L，小球藻對(duì)CPFX比較敏感。秦洪偉等［11］2011年報(bào)道了氧氟沙星對(duì)斜生柵藻的毒性效應(yīng)，氧氟沙星對(duì)斜生柵藻24，48，72和96h的EC50分別為59.71，65.22，72.50和122.08mg／L，隨著暴露時(shí)間延長(zhǎng)，斜生柵藻對(duì)氧氟沙星OFLX逐漸產(chǎn)生一定的耐受能力，使藻細(xì)胞恢復(fù)逐漸加快。

由本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果可以看出，鹽酸恩諾沙星對(duì)蛋白核小球藻的抑制效應(yīng)均體現(xiàn)出劑量效應(yīng)關(guān)系，即隨著暴露濃度的增加其對(duì)蛋白核小球藻生長(zhǎng)抑制程度增大。在藥物處理下，肉眼可觀察到藻液的顏色隨著暴露濃度的增加而逐漸變淡，說(shuō)明鹽酸恩諾殺星抑制藻的生長(zhǎng)，對(duì)藻細(xì)胞產(chǎn)生毒性。隨著暴露時(shí)間的增加，鹽酸恩諾沙星的EC50急劇下降，體現(xiàn)出其對(duì)蛋白核小球藻的毒性不斷增加。

蛋白核小球藻的光合色素與高等植物一樣，由葉綠素a、葉綠素b及類胡蘿卜素組成。光合作用色素是植物進(jìn)行光合作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是間接反映進(jìn)行光合作用生物的生物量指標(biāo)，其含量變化能較好地反映生物各階段生長(zhǎng)發(fā)育正常與否［12］。鹽酸恩諾沙星對(duì)蛋白核小球藻光合色素含量的影響，體現(xiàn)出濃度梯度抑制效應(yīng)，低藥物質(zhì)量濃度時(shí)，光合色素含量降低，而高藥物質(zhì)量濃度處理時(shí)，光合色素含量更低，藻體顏色變淺，表明葉綠體中光合色素成分受到了影響。

本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)鹽酸恩諾沙星對(duì)蛋白核小球藻的急性毒性進(jìn)行了研究，且在室內(nèi)模擬條件下進(jìn)行，無(wú)法反映出完整生態(tài)環(huán)境對(duì)藻生長(zhǎng)的影響，抗生素對(duì)藻的毒性效應(yīng)受多種環(huán)境因子制約并與藻的種類有關(guān)，抗生素對(duì)藻類的脅迫作用是十分復(fù)雜的生理生化過(guò)程。本文僅是鹽酸恩諾沙星對(duì)藻類毒性效應(yīng)的初步研究，對(duì)于抗生素脅迫下更復(fù)雜的生理生化過(guò)程還有待進(jìn)一步探討。本實(shí)驗(yàn)的研究成果可以為恩諾殺星在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的實(shí)際應(yīng)用提供一定的參考。

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