髓核細(xì)胞鑒定的研究進(jìn)展

陽(yáng)普山，王德利，劉子雙一，吳劍宏，阮狄克

目前髓核細(xì)胞尚無(wú)特異性細(xì)胞標(biāo)記[1]，通常認(rèn)為來(lái)源于髓核并表達(dá)Ⅱ型膠原、SOX-9 和聚集糖胺聚糖的細(xì)胞即髓核細(xì)胞。僅以Ⅱ型膠原、SOX-9 和聚集糖胺聚糖來(lái)在定義髓核細(xì)胞顯然是不足的，因?yàn)樯鲜黾?xì)胞標(biāo)記無(wú)法鑒別髓核細(xì)胞與軟骨細(xì)胞。干細(xì)胞治療椎間盤退行性疾病是目前的研究熱點(diǎn)之一[2]，精確鑒定髓核細(xì)胞在干細(xì)胞治療椎間盤退變的背景下具有重要意義[3]。缺乏對(duì)髓核細(xì)胞相關(guān)特征的認(rèn)識(shí)，阻礙了干細(xì)胞治療為代表的髓核再生策略的相關(guān)研究。本文將對(duì)髓核細(xì)胞鑒定相關(guān)研究加以綜述，以加深對(duì)髓核細(xì)胞特異性的認(rèn)識(shí),為椎間盤退變的相關(guān)干細(xì)胞治療的研究提供更好的髓核細(xì)胞鑒定方法。

1 髓核細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定

細(xì)胞形態(tài)學(xué)方面：在普通2D培養(yǎng)條件下[4]，原代髓核細(xì)胞需6～7 d貼壁, 初貼壁時(shí)呈短梭形、多角形, 胞質(zhì)向外伸突, 然后突起逐漸伸長(zhǎng), 經(jīng)8～12 d可達(dá)亞融合狀態(tài)，后呈漩渦狀的細(xì)胞團(tuán), 胞質(zhì)豐富, 具有折光性。而纖維環(huán)細(xì)胞體外普通培養(yǎng)條件下與髓核細(xì)胞形態(tài)學(xué)較為相似，亦為梭形[5]。而軟骨細(xì)胞在普通培養(yǎng)條件下為橢圓形細(xì)胞[6]。有研究表明髓核細(xì)胞形態(tài)學(xué)可隨著培養(yǎng)條件的變化而發(fā)生改變，如髓核細(xì)胞在3D培養(yǎng)條件下細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生巨大變化，其由梭形細(xì)胞變?yōu)榍蛐渭?xì)胞[7]。因此，僅憑細(xì)胞形態(tài)學(xué)對(duì)髓核細(xì)胞進(jìn)行鑒別是不可靠的，需結(jié)合其他方法才能提高鑒定的可靠性。

2 髓核細(xì)胞外基質(zhì)的鑒定

挪威學(xué)者Buckwalter等[8]通過(guò)單分子電子顯微鏡技術(shù)對(duì)狒狒的關(guān)節(jié)軟骨、髓核細(xì)胞的蛋白聚糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)二者細(xì)胞外基質(zhì)蛋白聚糖結(jié)構(gòu)明顯不同:關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)的蛋白聚糖分子由透明質(zhì)酸軸絲復(fù)合多聚體、非聚合單體形成，而髓核組織內(nèi)蛋白聚糖則是以非聚合多糖蛋白單體、蛋白多糖簇構(gòu)成，其內(nèi)缺乏明顯的透明質(zhì)酸軸絲。而加拿大學(xué)者M(jìn)wale等[9]通過(guò)定量檢測(cè)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白聚糖與膠原纖維含量，發(fā)現(xiàn)髓核與軟骨細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)蛋白聚糖和膠原的比值明顯不同:髓核細(xì)胞其比值為 25∶1，軟骨終板內(nèi)該值僅為2∶1。因此髓核細(xì)胞蛋白聚糖分子結(jié)構(gòu)、蛋白聚糖和膠原的比值與軟骨細(xì)胞的差異可作為髓核細(xì)胞與軟骨細(xì)胞的鑒別點(diǎn)之一。

3 髓核細(xì)胞鑒定的相關(guān)細(xì)胞內(nèi)因子

椎間盤的髓核細(xì)胞內(nèi)處于一種低氧，高滲透壓，低營(yíng)養(yǎng)的苛刻生存狀態(tài)，為適應(yīng)這樣苛刻的生存環(huán)境，髓核細(xì)胞內(nèi)存在一些特殊的細(xì)胞因子，這些特殊的細(xì)胞內(nèi)因子可能作為髓核細(xì)胞的鑒定點(diǎn)。Rajpurohit[10]通過(guò)Western-blot及免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)：小鼠髓核細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1， HIF-1α), 葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白glucose transporter 1，GLUT-1)，間質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)在髓核細(xì)胞內(nèi)較其周圍的纖維環(huán)及軟骨細(xì)胞有明顯差異表達(dá)，提示以上細(xì)胞內(nèi)因子可以作為髓核細(xì)胞鑒定的相關(guān)分子。Risbud等[11]通過(guò)免疫熒光顯微技術(shù)及Western-blot技術(shù)發(fā)現(xiàn)不同氧分壓條件下(21%，2%)鼠、羊及人類髓核細(xì)胞恒態(tài)高表達(dá)HIF-1α。而軟骨細(xì)胞內(nèi)HIF-1α因子在正常氧分壓條件(21%)下無(wú)明顯表達(dá)，但在低氧分壓條件(2%)下可誘導(dǎo)該分子表達(dá)的明顯上調(diào)。因此該作者同樣認(rèn)為HIF-1α用作髓核細(xì)胞的相關(guān)鑒定。Fujita等[12]則通過(guò)基因芯片及PCR技術(shù)對(duì)比髓核，關(guān)節(jié)軟骨，肌腱等組織的基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-A(vascular endothelial growth factor A，VEGF-A )在小鼠在髓核細(xì)胞明顯高表達(dá)，這種差異表達(dá)在人類髓核細(xì)胞同樣得到驗(yàn)證。該研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)該因子可能參與髓核細(xì)胞在低氧條件下抵抗衰老，維持細(xì)胞活性有關(guān)，該因子的表達(dá)隨退變的發(fā)生逐漸下降。因此以上研究認(rèn)為： HIF-1α，GLUT-1，MMP-2及VEGF-A 有望用于髓核細(xì)胞鑒定。

4 髓核細(xì)胞表面蛋白分子標(biāo)記的鑒定

Chen等[13]通過(guò)免疫組織化學(xué)染色及細(xì)胞流式技術(shù)發(fā)現(xiàn)未成熟的鼠、豬、人髓核細(xì)胞表面層連蛋白γ1及其受體(integrinα3，6，β4的亞單位)，CD239，CD151的表達(dá)量較纖維環(huán)明顯增高。提示以上分子可能作為髓核細(xì)胞表面特異性標(biāo)記之一。Fujita等[14]則通過(guò)基因芯片技術(shù)比較小鼠髓核組織與其他無(wú)血管組織的基因表達(dá)譜，從中篩查出5個(gè)高表達(dá)髓核細(xì)胞的膜相關(guān)基因即CD24 ，鈉鉀氯共同轉(zhuǎn)運(yùn)體,腦葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,神經(jīng)肽Y5受體,磷酯酰肌醇聚糖3(glypican-3,GPC3)。并通過(guò)細(xì)胞流式技術(shù)證實(shí)CD24分子特異性高表達(dá)于髓核細(xì)胞，因此Fujita提出CD24可以作為髓核細(xì)胞表面標(biāo)記蛋白用于鼠髓核細(xì)胞的鑒定。該研究團(tuán)隊(duì)后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體1(membrane-bound of vascular endothelial growth factor receptor-1，mbVegfr-1)在髓核細(xì)胞膜上存在明顯高表達(dá)[12]，提示該受體可能作為髓核細(xì)胞鑒定的表面蛋白分子。Sakai等[15]對(duì)比格犬椎間盤進(jìn)行了基因表達(dá)譜分析，并通過(guò)免疫組織化學(xué)發(fā)現(xiàn)橋粒糖蛋白2(desmoglein2，DSC2)，CD56在髓核細(xì)胞表面有特異性高表達(dá)，因此提出DSC2，CD56可以作為細(xì)胞表面分子用于髓核細(xì)胞鑒定。學(xué)者Power等[16]則首次應(yīng)用基因芯片技術(shù)對(duì)比分析了人類髓核細(xì)胞與關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的基因表達(dá)差異，并對(duì)其RNA表達(dá)差異最大的碳酸酐酶12(carbonic anhydrase-12，CA-12)基因進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)CA12蛋白在髓核細(xì)胞較纖維環(huán)及關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞有明顯特異性表達(dá)，提出CA12蛋白可以用作髓核細(xì)胞鑒定的表面蛋白分子。綜上研究結(jié)果，層連蛋白γ1及其受體(integrinα3，6，β4的亞單位)，CD239，CD151，CD24，mbVegfr-1, DSC2，CD56及CA-12可以作為髓核細(xì)胞鑒定的相關(guān)表面蛋白分子。

5 髓核細(xì)胞內(nèi)蛋白分子的鑒定

Lee等[17]同樣以小鼠為研究對(duì)象進(jìn)行了類似Fujita的研究。該研究發(fā)現(xiàn)GPC3、角蛋白19(Keratin-19 ，K-19)在髓核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)較纖維環(huán)及關(guān)節(jié)軟骨表達(dá)明顯增高。因此認(rèn)為GPC3及K-19可作為髓核細(xì)胞內(nèi)蛋白分子可用于髓核細(xì)胞鑒定。Rutges等[18]則對(duì)先前發(fā)現(xiàn)的一系列髓核細(xì)胞潛在細(xì)胞標(biāo)記在人類髓核細(xì)胞是否表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)僅有K-19在人類年輕的髓核細(xì)胞內(nèi)存在蛋白水平的高表達(dá)，但 K-19的表達(dá)量隨年齡增長(zhǎng)明顯下降，其在54歲以后在人類即無(wú)明顯表達(dá)，因此該分子無(wú)法作為老年髓核細(xì)胞的鑒定蛋白分子。

6 髓核細(xì)胞“基因標(biāo)記”的鑒定

自基因芯片出現(xiàn)以來(lái), 基因芯片這種同時(shí)具有信息量大、操作簡(jiǎn)單、速度快捷等優(yōu)點(diǎn)的技術(shù)就迅速引起人們的注意。一些學(xué)者期望通過(guò)基因芯片技術(shù)篩選出相關(guān)髓核細(xì)胞高表達(dá)基因。

Fujita等[14]通過(guò)比較小鼠髓核組織與其他無(wú)血管組織的基因表達(dá)譜，篩查出五個(gè)高表達(dá)髓核細(xì)胞的膜相關(guān)基因：CD24 ，鈉鉀氯共同轉(zhuǎn)運(yùn)體,腦葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,神經(jīng)肽Y5受體, GPC3。Lee等[17]于2007年進(jìn)行了類似Fujita的研究，發(fā)現(xiàn)小鼠髓核細(xì)胞內(nèi)膜聯(lián)蛋白A3(annexin A3，ANXA3),GPC3, K19，多態(tài)性蛋(pleiotrophin，PTN) 等基因在轉(zhuǎn)錄水平明顯高表達(dá)。另外，該研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)軟骨低聚物蛋白(cartilage oligomeric matrix protein, CPMP)和基質(zhì)糖蛋白前體蛋白(matrix gla protein, MGP)基因在髓核細(xì)胞較軟骨細(xì)胞明顯低表達(dá)，提示以上2個(gè)基因可能作為髓核鑒定的陰性基因。

小鼠椎間盤內(nèi)終身存在脊索細(xì)胞，這與人類椎間盤內(nèi)細(xì)胞構(gòu)成不同。因此Sakai等[15]以椎間盤內(nèi)細(xì)胞構(gòu)成與人類更為近似的比格犬為試驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行了類似Fujita的研究。該研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)髓核細(xì)胞較纖維環(huán)及關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞高表達(dá)的基因有α-2-巨球蛋白(α-2-Macroglobulin，A2M)、K18、 CD56、DSC2。對(duì)比以小鼠為試驗(yàn)動(dòng)物的研究結(jié)果，早先鼠類髓核發(fā)現(xiàn)的一系列標(biāo)記基因在犬髓核細(xì)胞無(wú)明顯特異性表達(dá)，這強(qiáng)烈提示髓核細(xì)胞基因表達(dá)譜存在明顯的物種間變異。

Minogue等[19]則應(yīng)用基因芯片技術(shù)對(duì)牛的髓核與關(guān)節(jié)軟骨、纖維環(huán)細(xì)胞進(jìn)行了基因表達(dá)譜對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)了一系列髓核相關(guān)標(biāo)記基因，其中突觸相關(guān)蛋白25(synaptosomal associated protein-25, SNAP25), K-8, K-19, N-鈣相關(guān)蛋白(N-cadherin, CDH2), 整合素結(jié)合唾液蛋白(integrin-binding sialoprotein, IBSP), 多功能聚糖(versican, VCAN), 腱調(diào)蛋白(tenomodulin, TNMD), 腦可溶性蛋白-1(brain attached signalling protein 1, BASP1),叉頭蛋白F1(forkhead box F1, FOXF1) 及微管蛋白(fibulin 1, FBLN1)等基因在人類髓核細(xì)胞較纖維環(huán)、軟骨細(xì)胞存在明顯表達(dá)差異。其中IBSP及FBLN1為髓核陰性表達(dá)基因,其余基因?yàn)樗韬岁?yáng)性基因。該研究者同樣發(fā)現(xiàn)牛的髓核細(xì)胞基因表達(dá)譜與先前鼠、犬的表達(dá)譜存在明顯差異，同樣提示髓核基因表達(dá)譜的明顯物種間變異。

為了避免種間差異對(duì)研究結(jié)果的影響，Minogue團(tuán)隊(duì)[20]再次應(yīng)用基因芯片對(duì)人類椎間盤內(nèi)髓核、纖維環(huán)及軟骨細(xì)胞進(jìn)行了基因表達(dá)圖譜分析，以找出人類髓核細(xì)胞相關(guān)基因標(biāo)志。該研究發(fā)現(xiàn)了多個(gè)人類髓核細(xì)胞陽(yáng)性標(biāo)記基因：配對(duì)盒蛋白1(paired box 1， PAX1), FOXF1, β-珠蛋白(hemoglobin beta gene，HBB), CA-12, 卵固蛋白2(ovostatin 2，OVOS2)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)多個(gè)軟骨細(xì)胞高表達(dá)基因(即髓核細(xì)胞陰性基因)：生長(zhǎng)分化因子10(growth differentiation factor 10，GDF10), 細(xì)胞因子類似物1(cytokine-like 1，CYTL1), IBSP, FBLN1。Power等[16]于2011年再次對(duì)人類髓核、軟骨及纖維環(huán)細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)C-凝集素2B(human C-type lectindomain family2 memberB，CLEC2B)，CA-12 ，γ-肌糖(gamma-sarcoglycan ,SGCG)，酪氨酸激酶受體3(tyrosine-protein kinase receptor,TYRO3)4個(gè)基因在髓核中較纖維環(huán)及軟骨細(xì)胞均有明顯表達(dá)差異，因此可以作為鑒定髓核細(xì)胞的標(biāo)記基因。

以上相關(guān)研究中的細(xì)胞標(biāo)記見表1。

7 展 望

盡管既往對(duì)髓核細(xì)胞鑒定進(jìn)行了大量實(shí)驗(yàn)研究，但是目前通過(guò)單一的方法仍然無(wú)法精確的鑒定髓核細(xì)胞。如細(xì)胞形態(tài)學(xué)方面，髓核細(xì)胞的形態(tài)在2D和3D培養(yǎng)條件下發(fā)生巨大的變化。而特殊的細(xì)胞內(nèi)因子表達(dá)也可能因?yàn)榕囵B(yǎng)條件及髓核細(xì)胞狀態(tài)不同而出現(xiàn)表達(dá)差異，可能降低特殊細(xì)胞因子作為髓核細(xì)胞鑒定分子的可靠性。精確地鑒定髓核細(xì)胞需要使用不同的鑒定方法對(duì)髓核細(xì)胞就行綜合的鑒定?？梢酝ㄟ^(guò)細(xì)胞形態(tài)及傳統(tǒng)的髓核細(xì)胞基因或蛋白(如SOX9,蛋白聚糖，Ⅱ型膠原)對(duì)髓核細(xì)胞進(jìn)行初步的鑒定。但是為精確的鑒定髓核細(xì)胞，還需要應(yīng)用新發(fā)現(xiàn)的特殊的細(xì)胞因子，髓核細(xì)胞特殊的基質(zhì)結(jié)構(gòu)、蛋白聚糖與膠原的構(gòu)成比，髓核細(xì)胞表面標(biāo)記及新發(fā)現(xiàn)的髓核細(xì)胞系列髓核細(xì)胞標(biāo)記基因進(jìn)行綜合的鑒定。只有這樣才能提高髓核細(xì)胞鑒定的精確性。

表1 不同物種中發(fā)現(xiàn)的髓核細(xì)胞標(biāo)記Tab.1 Different cell markers of nucleus pulposus cell founded in recent years

另外，不同物種來(lái)源的髓核細(xì)胞在基因及蛋白水平的特異性表達(dá)存在巨大的物種間差異。如在小鼠、犬髓核中發(fā)現(xiàn)的一系列髓核標(biāo)記基因中，僅有K-19在人類髓核細(xì)胞仍有特異性表達(dá)。因此在進(jìn)行髓核細(xì)胞鑒定時(shí)，必須考慮髓核細(xì)胞表型物種間差異的影響。如對(duì)鼠髓核進(jìn)行鑒定時(shí)，需選擇鼠髓核細(xì)胞特異性的基因和蛋白；而以人髓核為研究對(duì)象時(shí)，則需選取相應(yīng)的人類髓核細(xì)胞特異性基因及蛋白進(jìn)行鑒定。只有這樣才能排除種屬差異而更精確的鑒定髓核細(xì)胞。

總之，準(zhǔn)確鑒定髓核細(xì)胞對(duì)研究椎間盤退變的再生及治療均有重要意義。盡管目前學(xué)者通過(guò)不同技術(shù)發(fā)現(xiàn)了一些髓核標(biāo)記，但要完整的認(rèn)識(shí)髓核細(xì)胞表型還需更多的研究。相信隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展及檢測(cè)手段的不斷提高，會(huì)發(fā)找到更為簡(jiǎn)便的髓核細(xì)胞鑒定方法。

參考文獻(xiàn)

[1] 張燕, 吳劍宏, 王超鋒, 等. 非接觸式共培養(yǎng)體系對(duì)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向類髓核細(xì)胞的誘導(dǎo)分化效應(yīng)[J]. 脊柱外科雜志, 2011, 9(4):249-252.

[2] Sivakamasundari V, Lufkin T. Stemming the Degeneration: IVD Stem Cells and Stem Cell Regenerative Therapy for Degenerative Disc Disease[J]. Adv Stem Cells, 2013, 2013: pii: 724547.

[3] Ludwinski FE, Gnanalingham K, Richardson SM, et al. Understanding the native nucleus pulposus cell phenotype has important implications for intervertebral disc regeneration strategies[J]. Regen Med, 2013, 8(1):75-87.

[4] 張榮峰, 阮狄克, 張超, 等. 不同代次成人正常髓核細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)比較[J]. 脊柱外科雜志, 2008, 6(3):137-140.

[5] 郭志良，周躍，滕海軍，等. 大鼠椎間盤纖維環(huán)細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定[J]. 中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù), 2009, 13(2):300-304.

[6] 張文濤, 盧世璧, 黃英, 等. 軟骨細(xì)胞形態(tài)對(duì)其縫隙連接的影響[J]. 中國(guó)創(chuàng)傷骨科雜志, 2000, 2(4):50-53.

[7] Yuan M, Leong KW, Chan BP. Three-dimensional culture of rabbit nucleus pulposus cells in collagen microspheres[J]. Spine J, 2011, 11(10):947-960.

[8] Buckwalter JA, Smith KC, Kazarien LE, et al. Articular cartilage and intervertebral disc proteoglycans differ in structure: an electron microscopic study[J]. J Orthop Res, 1989, 7(1):146-151.

[9] Mwale F, Roughley P, Antoniou J. Distinction between the extracellular matrix of the nucleus pulposus and hyaline cartilage: a requisite for tissue engineering of intervertebral disc[J]. Eur Cell Mater, 2004, 8:58-63.

[10] Rajpurohit R, Risbud MV, Ducheyne P, et al. Phenotypic characteristics of the nucleus pulposus: expression of hypoxia inducing factor-1, glucose transporter-1 and MMP-2[J]. Cell Tissue Res, 2002, 308(3):401-407.

[11] Risbud MV, Guttapalli A, Stokes DG, et al. Nucleus pulposus cells express HIF-1 alpha under normoxic culture conditions: a metabolic adaptation to the intervertebral disc microenvironment[J]. J Cell Biochem, 2006, 98(1):152-159.

[12] Fujita N, Imai J, Suzuki T, et al. Vascular endothelial growth factor-A is a survival factor for nucleus pulposus cells in the intervertebral disc[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2008, 372(2):367-372.

[13] Chen J, Jing L, Gilchrist CL, et al. Expression of laminin isoforms, receptors, and binding proteins unique to nucleus pulposus cells of immature intervertebral disc[J]. Connect Tissue Res, 2009, 50(5):294-306.

[14] Fujita N, Miyamoto T, Imai J, et al. CD24 is expressed specifically in the nucleus pulposus of intervertebral discs[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2005, 338(4):1890-1896.

[15] Sakai D, Nakai T, Mochida J, et al. Differential phenotype of intervertebral disc cells: microarray and immunohistochemical analysis of canine nucleus pulposus and anulus fibrosus[J]. Spine (Phila Pa 1976), 2009, 34(14):1448-1456.

[16] Power KA, Grad S, Rutges JP, et al. Identification of cell surface-specific markers to target human nucleus pulposus cells: expression of carbonic anhydrase XII varies with age and degeneration[J]. Arthritis Rheum, 2011, 63(12):3876-3886.

[17] Lee CR, Sakai D, Nakai T, et al. A phenotypic comparison of intervertebral disc and articular cartilage cells in the rat[J]. Eur Spine J, 2007, 16(12):2174-2185.

[18] Rutges J, Creemers LB, Dhert W, et al. Variations in gene and protein expression in human nucleus pulposus in comparison with annulus fibrosus and cartilage cells: potential associations with aging and degeneration[J]. Osteoarthritis Cartilage, 2010, 18(3):416-423.

[19] Minogue BM, Richardson SM, Zeef LA, et al. Transcriptional profiling of bovine intervertebral disc cells: implications for identification of normal and degenerate human intervertebral disc cell phenotypes[J]. Arthritis Res Ther, 2010, 12(1):R22.

[20] Minogue BM, Richardson SM, Zeef LA, et al. Characterization of the human nucleus pulposus cell phenotype and evaluation of novel marker gene expression to define adult stem cell differentiation[J]. Arthritis Rheum, 2010, 62(12):3695-3705.