適用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的大白菜小孢子總RNA提取方法篩選

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（1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，北京 100193）

適用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的大白菜小孢子總RNA提取方法篩選

林 燕1，2李 菲1張淑江1張 慧1章時(shí)藩1孫日飛1*張振賢2

（1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，北京 100193）

為了找到適用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序要求的大白菜小孢子總RNA提取方法，以出胚率較高的吉紅82為試材，以熱激誘導(dǎo)處理后的小孢子為研究對(duì)象，比較分析了TRIzol法、改良CTAB法及超純?cè)噭┖蟹?種方法的RNA提取效果。結(jié)果表明：TRIzol法（磨樣）和改良CTAB法提取的RNA濃度較高，但完整性較差；超純RNA提取試劑盒法提取的RNA質(zhì)量最高，且完整性好，能夠滿足轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的要求。

大白菜；小孢子；RNA提取；轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

自Nitsch和Norreel（1973）首先成功應(yīng)用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)獲得煙草小孢子胚和再生植株之后，植物游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)開(kāi)始成為培育純合雙單倍體（double haploid，DH）的重要技術(shù)手段。目前已在甘藍(lán)型油菜（Zaki & Dickinson，1995；Zhao et al.，1996）、大白菜（栗根義 等，1993；姜立榮等，1996）、小麥（Reynold，1993；Kunz et al.，2000）、玉米（Pescitelli et al.，1990；Massonneau et al.，2005）等作物上進(jìn)行了許多游離小孢子胚胎發(fā)生機(jī)制的研究，并利用生物技術(shù)手段鑒定出一些經(jīng)熱激誘導(dǎo)后在小孢子胚胎發(fā)生中特異表達(dá)的基因和蛋白質(zhì)。但至今為止只有從甘藍(lán)型油菜中提取出來(lái)的BBM基因被公認(rèn)為具有胚胎發(fā)生能力（Pechan et al.，1991；Boutilier et al.，2002）。一些在胚胎發(fā)生過(guò)程中特異表達(dá)的基因是否起作用，其作用機(jī)理又是什么仍有待驗(yàn)證。在小孢子胚胎發(fā)生這一特殊的發(fā)育過(guò)程中還存在著許多目前研究中沒(méi)有關(guān)注到或沒(méi)有被挖掘到的重要作用基因和信號(hào)調(diào)控途徑，進(jìn)一步加大游離小孢子胚胎發(fā)生機(jī)理的研究力度，盡快找到胚胎發(fā)生過(guò)程中的重要功能基因并弄清其調(diào)控表達(dá)途徑勢(shì)在必行。

前人利用mRNA差異顯示技術(shù)（mRNA differential display reverse transcription PCR，DDRTPCR）（Liang & Pardee，1992）、抑制消減雜交技術(shù)（suppression substractive hybridization，SSH）（Diatchenko et al.，1996）、基因表達(dá)系列分析技術(shù)（serial analysis of gene expression，SAGE）（Velculescu et al.，1995）和基因芯片技術(shù)（gene chip）等對(duì)小孢子胚胎發(fā)生過(guò)程中的基因差異表達(dá)情況進(jìn)行了研究，也取得了一定的進(jìn)展。高通量測(cè)序平臺(tái)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（RNA-seq）能夠在單核苷酸水平對(duì)任意物種的整體轉(zhuǎn)錄活動(dòng)進(jìn)行檢測(cè)，具有定量更準(zhǔn)確、可重復(fù)性更高、檢測(cè)范圍更廣、分析更可靠等優(yōu)點(diǎn)；同時(shí)，該技術(shù)還能發(fā)現(xiàn)未知轉(zhuǎn)錄本和稀有轉(zhuǎn)錄本，精確地識(shí)別可變剪切位點(diǎn)以及cSNP，提供最全面的轉(zhuǎn)錄組信息（Alagna et al.，2009；McCarthy et al.，2012；Dobin et al.，2013）。目前，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)已被越來(lái)越多的應(yīng)用到基因轉(zhuǎn)錄水平的研究中，成為基因差異表達(dá)研究最為高效、準(zhǔn)確的手段之一，并大有替代之前應(yīng)用范圍較廣的mRNA差異顯示技術(shù)、抑制消減雜交技術(shù)、基因表達(dá)系列分析技術(shù)和基因芯片技術(shù)等的趨勢(shì)。因此，應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)開(kāi)展小孢子胚胎發(fā)生的相關(guān)研究是了解胚胎發(fā)生相關(guān)基因的表達(dá)模式、弄清胚胎發(fā)生機(jī)制的有效手段。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)RNA質(zhì)量要求較高：植物樣本RNA濃度≥400 ng·μL-1，總量＞20 μg，OD260/OD280為1.8～2.2，OD260/OD230＞1.8，28 S/ 18 S≥1.5，RIN≥6.5。小孢子在早期發(fā)育的細(xì)胞形態(tài)階段進(jìn)行RNA提取相對(duì)于普通植物組織來(lái)說(shuō)有一定的難度，并且在實(shí)際研究過(guò)程中一次能夠收集到的樣品量也不多。而轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)較目前常用的抑制消減雜交、基因芯片等差異基因研究手段，以及定量表達(dá)等表達(dá)模式研究手段（Maraschin et al.，2005；Tsuwamoto et al.，2007；Sánchez-Díaz et al.，2013；?ur et al.，2014）來(lái)說(shuō)對(duì)RNA的質(zhì)量要求更高。因此找到適用于少量小孢子樣品的高質(zhì)量RNA提取方法是轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及相關(guān)分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)。本試驗(yàn)以出胚率較高的大白菜吉紅82為試材，以熱激誘導(dǎo)處理后的小孢子為研究對(duì)象，比較分析了TRIzol法、改良CTAB法和超純RNA提取試劑盒法3種方法提取的RNA的質(zhì)量，以期找到能夠滿足轉(zhuǎn)錄組測(cè)序要求的RNA提取方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以易出胚的大白菜吉紅82（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所白菜育種課題組提供）為試材，2012年12月上旬育苗，2013年1月中旬定植于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所日光溫室，3月中旬至5月中旬取花蕾進(jìn)行小孢子培養(yǎng)。

TRIzol購(gòu)自Invitrogen公司，超純RNA提取試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司（CWbio. Co.，Ltd.，Cat#CW0588）；氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 游離小孢子培養(yǎng) 取健壯、無(wú)病害花蕾，鏡檢后挑選小孢子處于單核靠邊期（培養(yǎng)的最佳時(shí)期）的花蕾，先用70%酒精消毒30 s，再用7%飽和次氯酸鈉溶液表面消毒15 min，無(wú)菌水沖洗3次后放于研缽中，加少量B5-13洗滌培養(yǎng)基，用研錘輕輕擠壓使小孢子游離于溶液中，用孔徑為300目的尼龍網(wǎng)紗過(guò)濾，收集濾液，1 200 r·min-1離心3次，每次4 min，離心后棄上清液，將收集到的小孢子懸浮于過(guò)濾滅菌的NLN-13基本培養(yǎng)基，調(diào)整孢子濃度為1×105個(gè)·mL-1，分裝于60 mm×15 mm培養(yǎng)皿，每皿2～3 mL，用石蠟?zāi)し饪冢?3 ℃熱激誘導(dǎo)24 h。

1.2.2 RNA提取 收集33 ℃熱激誘導(dǎo)處理24 h后的小孢子，1 200 r·min-1離心3次，每次4 min，離心后棄上清液，留下的沉淀立即進(jìn)行RNA提取或在液氮中凍透后存于-70 ℃冰箱備用。試驗(yàn)中使用的量筒、試劑瓶等玻璃制品以及研缽、藥勺、移液槍頭、離心管等均用0.1% DEPC處理；雙蒸水經(jīng)0.1% DEPC處理過(guò)夜后再高壓滅菌（121 ℃，30 min），其他化學(xué)試劑均用DEPC處理水配置；電泳槽及電泳托、梳子等凝膠電泳用品用3%雙氧水浸泡數(shù)小時(shí)后用再蒸餾水沖洗。

采用3種方法進(jìn)行RNA提取。A，TRIzol法，勻漿化處理又分為2種：A1，收集小孢子細(xì)胞5×106～10×106個(gè)，直接加入1 mL TRIzol試劑，反復(fù)吸打幾次混勻；A2，收集等量（小孢子細(xì)胞5×106～10×106個(gè)）樣品，置于預(yù)冷的研缽中，加入液氮迅速研磨（先用研錘將冷凍住的樣品小心地用力碾壓幾次，待樣品呈小顆粒狀時(shí)再由慢及快進(jìn)行研磨），待液氮揮發(fā)后立即將充分研磨的粉末狀樣品移入1.5 mL的EP管中，加入1 mL TRIzol試劑，在旋渦振蕩器上充分混勻。其余步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作，提取的RNA立即進(jìn)行檢測(cè)或在液氮中凍透后存于-70 ℃冰箱備用。B，改良CTAB法，參照黃雪梅等（2009）的方法稍加改動(dòng)。C，超純RNA提取試劑盒法，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)的提取步驟進(jìn)行操作。

1.2.3 RNA質(zhì)量檢測(cè) 采用Nanodrop 2000檢測(cè)總RNA濃度及OD值，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA條帶的清晰度和完整性；采用Agilent 2100檢測(cè)28 S/18 S值及RIN值。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA電泳結(jié)果分析

由圖1可以看出，3種方法提取的RNA都能看到28 S和18 S兩條帶，但是用TRIzol法直接進(jìn)行細(xì)胞裂解（A1）提取的RNA條帶不明亮，而且發(fā)生嚴(yán)重的拖尾和彌散現(xiàn)象，說(shuō)明該方法提取的RNA濃度較低，完整性較差；用TRIzol法磨樣（A2）后提取的RNA條帶較清晰，28 S的亮度比18 S高，明顯好于A1，但有輕微的拖尾現(xiàn)象；改良CTAB法（B）提取的RNA條帶清晰，但存在明顯的拖尾現(xiàn)象；超純RNA試劑盒法（C）提取的RNA條帶無(wú)拖尾、彌散現(xiàn)象，28 S和18 S兩條帶明亮且亮度比約為2∶1，說(shuō)明其完整性好。

圖1 不同方法提取的RNA電泳檢測(cè)結(jié)果

2.2 RNA質(zhì)量及濃度分析

從表1可以看出，3種方法提取的RNA的OD260/OD230和OD260/OD280值都符合標(biāo)準(zhǔn)，說(shuō)明純度較好，沒(méi)有污染。用TRIzol法直接進(jìn)行細(xì)胞裂解（A1）提取的RNA濃度較低，RIN值為2.97，說(shuō)明RNA降解嚴(yán)重，完整性差；用TRIzol法磨樣（A2）后提取的RNA濃度較高，28 S/18 S＞1.5，但是RIN值為5.53，略低于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序要求；改良CTAB法（B）提取的RNA濃度和總量均能達(dá)到要求，但28 S/18 S值為1.10，RIN值也偏低；超純RNA提取試劑盒法（C）提取的RNA質(zhì)量最高，總量遠(yuǎn)超過(guò)20 μg，RIN值達(dá)到6.90，能夠滿足文庫(kù)構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的要求。

表1 不同方法提取的RNA質(zhì)量

3 結(jié)論與討論

RNA提取是分子生物學(xué)研究的技術(shù)基礎(chǔ)，不同植物由于其生理特性不同，適宜的RNA提取方法亦不同，即使同種植物的不同組織適宜的提取方法也不盡相同（李宏和王新力，1999；楊占軍 等，2009）。植物游離小孢子為液體培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)，相對(duì)于普通植物組織來(lái)說(shuō)RNA提取有一定難度，而且在實(shí)際研究過(guò)程中每個(gè)處理能夠收集到的樣品量也不多，樣品中殘留的水分還會(huì)對(duì)液氮研磨產(chǎn)生一定影響。本試驗(yàn)中，每個(gè)處理收集小孢子數(shù)為5×106～10×106個(gè)，置于預(yù)冷的研缽中，加入液氮后會(huì)凍住，因此應(yīng)先用研錘將冷凍的樣品小心地用力碾壓幾次，待樣品呈小顆粒狀時(shí)再由慢及快研磨成粉末狀，以防因研磨力度過(guò)大導(dǎo)致樣品濺出而造成浪費(fèi)，影響RNA提取效果。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等分子生物學(xué)研究技術(shù)對(duì)RNA的質(zhì)量和濃度要求較高，因此急需找到一種適合游離小孢子RNA提取的方法以滿足相關(guān)研究工作的要求。TRIzol的主要成分是酚，主要作用是裂解細(xì)胞，可以在破壞細(xì)胞使RNA釋放出來(lái)的同時(shí)保護(hù)RNA的完整性；同時(shí)，TRIzol里加入了可以抑制RNA酶的胍鹽。在核酸物質(zhì)得到釋放的同時(shí)，細(xì)胞中的蛋白也被釋放出來(lái)，而氯仿可以使蛋白變性，降低蛋白的溶解度，同時(shí)還可以去除植物色素和蔗糖。加入氯仿后離心，RNA存在于上層水樣層中，收集上層水樣層后采用異丙醇沉淀來(lái)還原RNA。由于異丙醇主要沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA，對(duì)5 S RNA、tRNA及多糖不產(chǎn)生沉淀，所以RNA電泳的標(biāo)志性3條帶中5 S RNA帶很不清楚。最后加入乙醇的主要作用是洗滌異丙醇，也可以溶解一部分蛋白，而痕量乙醇很容易揮發(fā)掉。本試驗(yàn)中，按普通植物組織提取法先進(jìn)行液氮研磨再勻漿處理，得到的RNA濃度、純度和完整性都比較好，可以用于RT-PCR、southern等相關(guān)研究，但是RNA的完整性還達(dá)不到轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的要求。而TRIzol法中針對(duì)懸浮細(xì)胞裂解提取RNA的方法目前主要應(yīng)用于動(dòng)物細(xì)胞和細(xì)菌，并不適合植物小孢子細(xì)胞，這可能是因?yàn)橹参锛?xì)胞壁影響了裂解效果造成的。

改良CTAB提取液中高濃度的NaCl以及CTAB和β-巰基乙醇共同作用都可以去除多糖等代謝雜質(zhì)，因此其最突出的作用特點(diǎn)是能夠有效去除多酚、多糖等次生代謝物（胡根海和喻樹(shù)迅，2007；王春暉 等，2013）。小孢子培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一部分次生代謝產(chǎn)物，而且培養(yǎng)基中含有大量糖分，因此改良CTAB法可能對(duì)消除這些成分的影響起到一定的作用。另外，CTAB通對(duì)植物細(xì)胞的裂解去污作用以及與β-巰基乙醇共同對(duì)蛋白的強(qiáng)烈變性作用，可以使核酸徹底被釋放出來(lái)。該方法操作簡(jiǎn)單且費(fèi)用較低，但準(zhǔn)備提取液等試劑比較繁瑣，RNA提取所需要的時(shí)間也比較長(zhǎng)。

本試驗(yàn)中選用的試劑盒具有獨(dú)特的Shredder分離柱，能有效過(guò)濾高粘度的植物裂解物，同時(shí)采用硅膠吸附柱對(duì)RNA進(jìn)行純化，多聚糖等污染物可被有效去除，提取的RNA純度高；利用無(wú)RNase的DNase在柱上進(jìn)行消化去除后無(wú)DNA殘留；Buffer中加入β-巰基乙醇還可以使蛋白強(qiáng)烈變性，避免污染。因此，使用該試劑盒提取的RNA濃度和純度均較高。另外，超純?cè)噭┖蟹ㄍㄟ^(guò)過(guò)柱離心的方法分離細(xì)胞碎片以及去除雜質(zhì)，不需要多次有機(jī)溶劑溶液抽提，簡(jiǎn)單快捷；加上所有Buffer都是小量包裝，這些都在一定程度上降低了污染。此方法也不需要低溫環(huán)境，比較方便。

本試驗(yàn)對(duì)3種RNA提取方法進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)TRIzol法直接裂解細(xì)胞進(jìn)行RNA提取效果比較差，不適用于大白菜小孢子RNA提取。超純RNA提取試劑盒法提取的RNA質(zhì)量高、完整性好，能夠滿足轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的要求。但是本試驗(yàn)所選取的方法有限，而且RNA提取受環(huán)境和操作等因素的影響也比較大，有必要對(duì)更多的RNA提取方法進(jìn)行篩選，在實(shí)際操作中對(duì)環(huán)境和操作因素也應(yīng)格外注意，以期找到更加高效、便捷且費(fèi)用較低的RNA提取方法，為轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等技術(shù)的應(yīng)用奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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Screening of Methods to Extract Total RNA from Micro-spore of Chinese Cabbage Suitable for Transcriptome Sequencing

LIN Yan1，2，LI Fei1，ZHANG Shu-jiang1，ZHANG Hui1，ZHANG Shi-fan1，SUN Ri-fei1*，ZHANG Zhen-xian2

（1Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China；2College of Agronomy and Biotechnology，China Agricultural University，Beijing 100193，China）

In order to find out micro-spore extracting method suitable for transcriptome sequencing，this study took Chinese cabbage‘Jihong 82’as experimental material and micro-spore induced with heat shock as research object．This study compared and analyzed the RNA extraction effects by 3 different methods：TRIzol method，improved CTAB method and ultrapure kit method．The results showed that RNA concentrations extracted by TRIzol method and improved CTAB method were higher，but the RNA integrity was lower．Quality of RNA extracted by ultrapure kit method was the highest，and the RNA inegrity was also good．Therefore，RNA obtained by this method was suitable for satisfying the requirement of transcriptome sequencing．

Chinese cabbage；Micro-spore；RNA extraction；Transcriptome sequencing

林燕，女，博士研究生，專(zhuān)業(yè)方向：大白菜遺傳育種，E-mail：sdau_yan@163.com

*通訊作者（Corresponding author）：孫日飛，男，研究員，博士生導(dǎo)師，專(zhuān)業(yè)方向：大白菜遺傳育種，E-mail：sunrifei@caas.cn

2014-03-21；接受日期：2014-05-16