金烏骨通膠囊HPLC指紋圖譜研究

1.黔南州食品藥品檢驗(yàn)所，貴州 都勻 558000；2.貴州省食品藥品檢驗(yàn)所，貴州 貴陽 550000

Abstract:ObjectiveTo establish the HPLC fingerprint of Jingwugutong Capsules and accumulate data for evaluation of its quality.MethodsThe chromatographic fingerprints were determined with RP-HPLC on Agilent Eclipse plus C18(4.6mm×250mm，5μm)and with the gradient solvent system consisting of acetonitrile(A)and 1% AcOH solution(B),0～15min,9～10%A,flow rate 1.0ml/min; 15～65min, 10～40%A, flow rate 1.0ml/min;65～115min,40～70%A,flow rate 1.5ml/min;115～125min,70%A,flow rate 1.5ml/min;the detection wavelength was set at:0～60min 254nm，60～85min 380nm，85～125min 254nm,and the column temperature was maintained at 30℃.ResultsBased on the peaks of icariin as reference peak, measured value of twenty nine batches revealed that there were thirteen common peaks and high similarity between samples of fingerprints.ConclusionIt is easy to handle for this method and has good separation effect, reproducibility, stability, precision, and can be applied to the quality control and the authenticity identification of Jingwugutong Capsules.

Keywords:Jingwugutong Capsules；HPLC；Fingerprint

金烏骨通膠囊是貴州省盛世龍方制藥股份有限公司生產(chǎn)的制劑，由金毛狗脊、木瓜、烏梢蛇、葛根、淫羊藿、姜黃、補(bǔ)骨脂等多味藥組成，具有滋補(bǔ)肝腎，祛風(fēng)除濕，活血通絡(luò)的功效。用于肝腎不足，風(fēng)寒濕痹，骨質(zhì)疏松，骨質(zhì)增生引起的腰腿酸痛、肢體麻木等癥[1]。

本實(shí)驗(yàn)采用反相高效液相色譜法，測定了29批樣品，建立金烏骨通膠囊的指紋圖譜檢測方法，利用高效液相指紋圖譜技術(shù)對(duì)藥品生產(chǎn)環(huán)節(jié)質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)控和市場上真?zhèn)纹返蔫b別。此方法分離效果、精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性等指標(biāo)均表現(xiàn)良好。

1 儀器與材料

1.1 儀器 安捷倫1260高效液相色譜儀，自動(dòng)進(jìn)樣器，DAD檢測器。

1.2 材料與試藥 乙腈(色譜純)，水(娃哈哈純凈水)，其余試劑為分析純；淫羊藿苷對(duì)照品(批號(hào)：110737-200415，中國藥品生物制品檢定所)；金烏骨通膠囊(盛世龍方制藥有限公司提供、市場抽樣)。

2 方法與結(jié)果[2]

2.1 色譜條件 色譜柱為安捷倫Eclipse plus C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相為乙腈(A)-1%冰醋酸水溶液(B)，梯度洗脫程序?yàn)椋?～15min，9～10%A，流速1.0ml/min；15～65min，10～40%A，流速1.0ml/min；65～115min，40～70%A，流速1.5mlL/min；115～125min，70%A，流速1.5ml/min；檢測波長為0～60min為254nm，60～85min為380nm，85～125min為254nm；洗脫總時(shí)間為125min；柱溫30℃；進(jìn)樣量20μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取淫羊藿苷對(duì)照品適量，加50%甲醇制成0.5mg/ml的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 避光操作。本品20粒，取內(nèi)容物，研細(xì)，混勻，精密稱取約0.5g，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50ml，密塞，稱定重量，置水浴回流30min，密塞放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用0.45μm的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取供試品溶液(批號(hào)130506)20μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖(見圖1)，樣品共出峰24個(gè)，達(dá)到分離度要求的色譜峰個(gè)數(shù)為16個(gè)，對(duì)比保留時(shí)間確定供試品色譜中tR=49.2min峰為淫羊藿苷色譜峰，淫羊藿苷峰與相鄰峰分離度達(dá)到要求，保留時(shí)間適中，選作參照峰(S)，確定13個(gè)共有峰，共有峰個(gè)數(shù)占總峰個(gè)數(shù)的比例為54%；3小時(shí)空針全光譜色譜圖和3小時(shí)樣品供試液全光譜色譜圖表明色譜系統(tǒng)無其他干擾峰，組分在120min內(nèi)出峰完全。

2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取供試品溶液(批號(hào)130506)，分別于0、2.5、5、7.5、10、12.5、15、30小時(shí)進(jìn)樣測定，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積比值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果顯示各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.05%～1.27%，相對(duì)峰面積比值的RSD為0.26%～2.20%，結(jié)果說明供試品溶液在30小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 取供試品溶液(批號(hào)130506)，連續(xù)6次進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積比值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果顯示各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.06%～0.92%，相對(duì)峰面積比值的RSD為0.27%～2.33%，結(jié)果說明本方法精密度良好。

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取供試品(批號(hào)130506)，依法操作，分別制備供試品溶液6份，進(jìn)樣測定，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積比值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果顯示各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.04%～0.79%，相對(duì)峰面積比值的RSD為0.26%～2.57%，結(jié)果說明本方法重現(xiàn)性良好。

2.7 指紋圖譜建立及相似度評(píng)價(jià)

測定連續(xù)4年生產(chǎn)的金烏骨通膠囊，共29批，建立指紋圖譜，以參照峰保留時(shí)間計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果顯示各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均小于0.5%。結(jié)果見表1。

實(shí)驗(yàn)采用國家藥典委員會(huì)《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2012.130723版本)軟件來進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，得到各批樣品的相似度數(shù)據(jù)，結(jié)果見表2。

表1 29批金烏骨通膠囊共有峰相對(duì)保留時(shí)間

表2 29批金烏骨通膠囊指紋圖譜相似度數(shù)據(jù)

3 討論

3.1 提取溶劑的選擇 比較不同濃度甲醇溶液(20、40、50、60、80、100%)共6種提取溶劑對(duì)樣品的提取效率，結(jié)果顯示，甲醇濃度較低時(shí)，脂溶性成份提取不佳，反之則水溶性成份提取不佳，且甲醇濃度較高時(shí)，色譜峰溶劑效應(yīng)明顯，流出時(shí)間較短的色譜峰前伸嚴(yán)重，對(duì)分離度影響較大，經(jīng)比較，確定提取溶劑為50%甲醇，此條件下，色譜峰豐富，峰形及分離效果良好。

3.2 流動(dòng)相的選擇 比較了乙腈-水、乙腈-醋酸溶液、乙腈-磷酸溶液等多種不同組成、不同梯度溶劑系統(tǒng)。結(jié)果顯示，按1.4項(xiàng)下洗脫溶劑系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)得到的圖譜峰形及分離度較好，故確定此梯度系統(tǒng)為流動(dòng)相系統(tǒng)。

3.3 檢測波長的選擇 使用DAD檢測器全波長掃描功能，在210～600nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，得到全光譜色譜圖。根據(jù)3D譜圖，確定檢測波長為：0～60min，254nm；60～85min，380nm；85～125min，254nm。在此條件下，兼顧各峰強(qiáng)度，譜峰最為豐富。

3.4 實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng) 流出時(shí)間在75min附近的姜黃素類化合物具光敏性[3]，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)其相對(duì)峰面積比值隨時(shí)間呈緩慢下降趨勢，因此實(shí)驗(yàn)過程應(yīng)避光操作以控制其降解速率，獲得可靠數(shù)據(jù)。

3.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 連續(xù)4年共29批樣品的指紋圖譜相似度較高，穩(wěn)定性、精密度和重現(xiàn)性好，指紋圖譜具有一定特征性，可為金烏骨通膠囊的內(nèi)在質(zhì)量提供可靠的參考依據(jù)。

[1]WS-10140(ZD-0140)-2002．國家藥品標(biāo)準(zhǔn)(試行)頒布件[S].

[2]何佳，李懿，韋建榮．宮血寧膠囊HPLC指紋圖譜研究[J].中成藥，2011，33(7)：1098-1101.

[3]王雪梅，陳利華，施文婷．姜黃素類化合物的光穩(wěn)定性研究[J].安徽大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2012，36(3)：73-78.