基于MgPa模擬表位的MAP的制備、純化與鑒定

(南華大學(xué)病原生物學(xué)研究所,湖南衡陽421001)

生殖支原體(Mycoplasma genitalium,Mg)是基因組最小的能自我復(fù)制的原核細(xì)胞型微生物,在男性主要引起急慢性非淋菌性尿道炎[1];在女性則引起慢性盆腔感染性疾病,并可導(dǎo)致不育[2];新生兒則經(jīng)母親生殖道分娩時(shí)感染引起結(jié)膜炎和肺炎[3]。Mg細(xì)胞膜上的黏附素蛋白(Mycoplasma genitaliumprotein of adhesion,MgPa)對(duì)Mg尖形結(jié)構(gòu)的形成和Mg黏附到宿主細(xì)胞至關(guān)重要[4]。已有研究表明MgPa的C端(第1 248～1 364 aa)具有較強(qiáng)的免疫原性[5]。因此,Mg-Pa是一種重要的診斷和疫苗候選抗原。

課題組在前期的研究中制備并純化了MgPa的多克隆抗體,以此抗體為靶分子,利用噬菌體展示肽庫技術(shù)成功篩選到MgPa的3個(gè)模擬表位[6-8]。本研究擬以多聚賴氨酸為核心基質(zhì),制備含有MgPa 3個(gè)模擬表位的多抗原肽(multiple antigenic peptide,MAP),并用反向高效液相色譜(reverse phase high performance liquid chromatography,HPLC)分析MAP的純度,用質(zhì)譜分析法測(cè)定其分子量以對(duì)MAP進(jìn)行鑒定,以便為進(jìn)一步研究基于 MgPa模擬表位的MAP用于Mg的臨床診斷與預(yù)防提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 八分枝MAP的制備

分別合成含有參考文獻(xiàn)[8]中P2、P30和P42所對(duì)應(yīng)的多肽序列的八分枝MAP,為了使多肽序列與MgPa模擬表位的序列(P-S-A-A/V-X-R-F/W-E/S-L-S-P)中的第7位和第10位氨基酸一致,故將P2多肽序列中第7位的A改為R,第10位的K改為L(zhǎng)。具體合成的序列如下所示：WP：(WPSAAERFSLSP)8-K4K2KG;AS：(AKITRTLSLPFS)8-K4K2KG 和KH：(KSLSRHDHIHHH)8-K4K2KG。

多肽的合成選用對(duì)稱八分枝MAP樹脂,采用標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc方法[9]合成。選用Fmoc-Lys(Fmoc)-OH為核心基質(zhì),2個(gè)Fmoc去掉以后暴露出2個(gè)氨基,分別都往下延伸。采取在一個(gè)Gly上接一個(gè)Lys,然后利用Lys的兩個(gè)氨基再接2個(gè)Lys,再接4個(gè)Lys,然后在這4個(gè)Lys上的8個(gè)氨基上各接一條多肽,使其合成為八分枝MAP。

1.2 八分枝MAP的純化

將合成好的八分枝MAP粗品溶解,經(jīng)0.45 μm的纖維素膜過濾后,經(jīng)Sephadex G-25凝膠滲透色譜法仔細(xì)純化,凍干。最終產(chǎn)物用反相高效液相色譜儀(日本Shimadzu)鑒定其純度,分析柱采用PLRP-S 100A為填料,流動(dòng)相為含有0.1%三氟乙酸的乙氰溶液,流速為1 mL/min,波長(zhǎng)為220 nm。

1.3 八分枝MAP的鑒定

為進(jìn)一步驗(yàn)證合成的八分枝MAP是否確實(shí)與預(yù)期一致,委托上海吉爾生化有限公司對(duì)經(jīng)RPHPLC鑒定純度后的八分枝MAP進(jìn)行質(zhì)譜分析,以確定其相對(duì)分子質(zhì)量。

2 結(jié) 果

2.1 八分枝MAP的合成

利用標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc方法,選用Fmoc-Lys(Fmoc)-OH為基質(zhì),以甘氨酸為肽和樹脂間的連接物,首先合成寡聚賴氨酸基質(zhì),然后在寡聚賴氨酸基質(zhì)上用固相逐步接肽法成功合成了3個(gè)含有模擬表位的八分枝MAP,具體合成的序列及結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 合成八分枝MAP的結(jié)構(gòu) A：含WP12的MAP;B：含AS12的MAP;C：含KH12的MAP

2.2 八分枝MAP的RP-HPLC純化

合成好的八分枝MAP粗品經(jīng)過濾后,用RPHPLC分析并進(jìn)行純化,結(jié)果表明：WP12的主峰出現(xiàn)在保留時(shí)間為13.662 min處,其峰的面積占整個(gè)面積的91.850 1%,即其相對(duì)濃度約為91.850 1%(圖2A)。AS12的主峰出現(xiàn)在保留時(shí)間為15.072 min處,其峰的面積占整個(gè)面積的93.348 1%,說明其相對(duì)濃度約為93.348 1%(圖2B)。而KH12的主峰出現(xiàn)在保留時(shí)間為7.163 min處,其峰的面積占整個(gè)面積的94.526 5%,其相對(duì)濃度約為94.526 5%(圖2C),以上這些結(jié)果說明所合成的MAP得到了較好的純化,其純度都達(dá)到90%以上。

2.3 八分枝MAP的質(zhì)譜分析

用質(zhì)譜分析儀對(duì)經(jīng)RP-HPLC分析純化后的八分枝MAP進(jìn)行鑒定,結(jié)果顯示：WP12的Mr約為11 880(圖3A),AS12的 Mr約為10 532(圖3B),KH12的Mr約為12 848(圖3C),與理論預(yù)算值相符合。

3 討 論

為了有效的預(yù)防Mg的感染,必須研制出能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的疫苗。研究表明誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的表位多為構(gòu)象表位,因此,不能通過抗原分子所具有的原始氨基酸序列進(jìn)行預(yù)測(cè)。而鑒定構(gòu)象表位的模擬表位是解決這一難題的方法之一。Geysen把模擬表位定義為：一個(gè)能與抗體分子的抗原結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合,未必與誘導(dǎo)該抗體的表位相同,但可模擬該表位基本特征的分子[10]。一個(gè)表位和其相應(yīng)的模擬表位有相同的抗原性,其中可能的原因有如下兩點(diǎn)：①兩者結(jié)合于抗體同一互補(bǔ)位中不同抗原結(jié)合位點(diǎn);②兩者具有相同的原子。課題組在前期研究中利用噬菌體展示肽庫技術(shù)篩選到MgPa的3個(gè)模擬表位,含有這些模擬表位的噬菌體能和MgPa的多克隆抗體特異性結(jié)合。

圖2 用RP-HPLC分析3個(gè)MAP的純度 A：RP-HPLC分析WP12的純度;B：RP-HPLC分析 AS12的純度;C：RP-HPLC分析KH12的純度

圖3 質(zhì)譜分析法鑒定制備的3種MAP A：含WP12序列的MAP;B：含AS12序列的MAP;C：含KH12序列的MAP

一般來說,免疫細(xì)胞識(shí)別、遞呈抗原時(shí)僅需要十幾個(gè)氨基酸,與抗體結(jié)合則僅需要幾個(gè)關(guān)鍵的氨基酸[11]。因此,表位肽疫苗利用含較短氨基酸序列的免疫優(yōu)勢(shì)抗原表位,即可有效地被免疫系統(tǒng)識(shí)別和被APC遞呈,具有針對(duì)性強(qiáng)、能去除抑制性表位和避免因病原體發(fā)生抗原變異而引起的免疫逃逸等優(yōu)點(diǎn)。但在實(shí)際應(yīng)用中,由于表位肽疫苗在結(jié)構(gòu)方面存在一定缺陷,并不能有效的誘導(dǎo)體內(nèi)的免疫反應(yīng),必須對(duì)其構(gòu)型進(jìn)行改建以增添分子修飾才能提高其免疫原性及其在體內(nèi)的穩(wěn)定性。Tam等[12]采用具有α和ε兩個(gè)氨基、分子量小、且免疫原性弱的賴氨酸為核心基質(zhì),將4條或8條抗原表位相同或不同的單體肽偶聯(lián)在一起,形成樹枝狀結(jié)構(gòu),稱之為MAP。與線性多肽相比,MAP具有以下優(yōu)點(diǎn)：①能提供更多的抗原表位,因而能與抗體多價(jià)結(jié)合;②能很好的模擬天然表位的構(gòu)象,誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更多的保護(hù)性抗體,且能減少氨基酸變異的影響;③能更好地提供抗原表位與抗體結(jié)合的空間,增強(qiáng)肽的表位結(jié)合能力,提高了APC對(duì)抗原肽的識(shí)別、處理和提呈效率;④相對(duì)分子質(zhì)量較大,由于抗原表位的重新搭配和組合能提高其免疫原性,因此,無需分子修飾或偶聯(lián)載體蛋白。因此,MAP已用于HIV[13]、流感病毒[14]等病原體的新型診斷抗原和疫苗研究,顯示出其獨(dú)特的優(yōu)越性。吳玉章等[15]在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),合成的含有Pre-S2序列的MAP肽誘發(fā)的免疫反應(yīng)明顯高于對(duì)照的線性肽,說明MAP肽的結(jié)構(gòu)能明顯提高抗原肽的免疫原性,從而間接說明分枝肽結(jié)構(gòu)可能部分恢復(fù)其大分子特征。

本研究用Fmoc法合成了前期研究中篩選并經(jīng)鑒定的MgPa的3個(gè)模擬表位的MAP,RP-HPLC分析的結(jié)果表明,合成的3種MAP的純度均達(dá)到了90%以上,然后用質(zhì)譜分析對(duì)其進(jìn)行了鑒定,3種MAP的分子量與預(yù)期分子量相符,說明成功的合成了含有3個(gè)模擬表位的MAP。下一步將把這些經(jīng)鑒定的MAP分別免疫小鼠,檢測(cè)其誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生特異性體液免疫與細(xì)胞免疫應(yīng)答的水平,以便研究基于模擬表位的MAP在臨床診斷和疫苗研究中的應(yīng)用價(jià)值。

[1]Manhas A,Sethi S,Sharma M,et al.Association of genital mycoplasmas includingMycoplasma genitaliumin HIV infected men with nongonococcal urethritis attending STD&HIV clinics[J].Indian J Med Res,2009,129(3)：305-310.

[2]Bjartling C,Osser S,Persson K.Mycoplasma genitaliumin cervicitis and pelvic inflammatory disease among women at a gynecologic outpatient service[J].Am J Obstet Gynecol,2012,206(6)：476.e1-476.e8.

[3]Patel KK,Salva PS,Webley WC.Colonization of paediatric lower respiratory tract with genital Mycoplasma species[J].Respirology,2011,16(7)：1081-1087.

[4]Burgos R,Pich OQ,Ferrer-Navarro M,et al.Mycoplasma genitaliumP140 and P110 cytadhesins are reciprocally stabilized and required for cell adhesion and terminal-organelle development[J].J Bacteriol,2006,188(24)：8627-8637.

[5]Svenstrup HF,Jensen JS,Gevaert K,et al.Identification and characterization of immunogenic proteins ofMycoplasma genitalium[J].Clin Vaccine Immunol,2006,13(8)：913-922.

[6]曾焱華,吳移謀,游曉星,等.生殖支原體粘附素蛋白MgPa的表達(dá)及其多克隆抗體的制備與純化[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志,2010,26(11)：1011-1015.

[7]曾焱華,游曉星,何軍,等.應(yīng)用噬菌體展示肽庫篩選生殖支原體黏附蛋白的模擬表位[J].中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2012,32(1)：84-90.

[8]Zeng YH,Liu LZ,He J,et al.Screening and identification of the mimic epitope of the adhesion protein ofMycoplasma genitalium[J].Can J Microbiol,2012,58(7)：898-908.

[9]Loffet A.Synthesis of a pentapeptide by the Merrifield method[J].Experientia,1967,23(5)：406-407.

[10]Geysen HM,Barteling SJ,Meloen RH.Small peptides induce antibodies with a sequence and structural requirement for binding antigen comparable to antibodies raised against the native protein[J].Proc Natl Acad Sci USA,1985,82(1)：178-182.

[11]Boris T,Shmuel C,Meir W.The epitopes for natural polyreactive antibodies are rich in proline[J].lmmunolo,1997,94：6335-6339.

[12]Tam JP,Zavala F.Multiple antigen peptide：a novel approach to increase detection sensitivity of synthetic peptides in solid-phase immunoassays[J].J Immunol Methods,1989,124(1)：53-61.

[13]Hashimoto C,Nomura W,Ohya A,et al.Evaluation of a synthetic C34 trimer of HIV-1 gp41 as AIDS vaccines[J].Bioorg Med Chem,2012,20(10)：3287-3291.

[14]Vergara-Alert J,Argilaguet JM,Busquets N,et al.Conserved synthetic peptides from the hemagglutinin of influenza viruses induce broad humoral and T-cell responses in a pig model[J].PLoS One,2012,7(7)：e40524.

[15]吳玉章,劉茂昌,賈正才,等.HBV新型免疫原的設(shè)計(jì)、合成及免疫原性研究[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2000,22(10)：919-923.