加味腦泰方對(duì)血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶和海馬區(qū)NR2A及NR2B表達(dá)的影響

易亞喬 ,肖碧躍 ,劉英飛 ,劉 林 ,陳 懿 ,廖 君 ,葛金文

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)仲景學(xué)說(shuō)教研室,湖南長(zhǎng)沙410208;2.益陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科;3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)重點(diǎn)學(xué)科)

血管性癡呆(Vascular dementia,VD)是迄今為止唯一可防治的癡呆,如早期治療會(huì)具有可逆性。關(guān)于VD的發(fā)病機(jī)制目前尚不十分清楚,多數(shù)學(xué)者認(rèn)為,VD的發(fā)病機(jī)制主要與腦血管病變導(dǎo)致局部或全腦缺血或缺氧后引起腦部與認(rèn)知、記憶等相關(guān)的特定神經(jīng)組織損害有關(guān)[1-3],因而對(duì)于一般VD而言,存在一般性腦缺血缺氧的病理生理改變。短暫性腦缺血或缺血后再灌注最易損傷海馬,導(dǎo)致代謝異常,誘發(fā)神經(jīng)元死亡,引起永久性腦組織損傷[4]。NR2A和NR2B是分布于海馬的N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-Methyl-D-Aspartate Receptor,NMDAR)的主要調(diào)節(jié)亞單位,NR2A基因敲除明顯降低海馬CA1區(qū) NMDA受體電流和 LTP,損害空間學(xué)習(xí)能力,NR2B基因敲除后小鼠記憶能力下降,而移植轉(zhuǎn)染NR2B基因細(xì)胞可使大鼠記憶明顯增高[5-7]。目前已有研究證實(shí)血管性癡呆(VaD)引起大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降,NR2A、NR2B在CA1區(qū)的表達(dá)水平下降,但是關(guān)于加味腦泰方對(duì)血管性癡呆的作用鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立大鼠四血管阻斷法制備血管性癡呆模型,然后服用加味腦泰方,觀察加味腦泰方對(duì)血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶和海馬區(qū)NR2A及NR2B表達(dá)的影響,探討加味腦泰方在治療血管性癡呆中的可能作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

兔抗NR2A抗體(Abcom公司)、兔抗NR2B抗體 (Sigma公司),3,3-Diaminobenzidine(DAB)(Vector公司),生物素化廣譜(Vector公司),MT-200Morris水迷宮(成都泰盟科技有限公司),IgG O-lympus E53顯微鏡(Olympus公司)。

1.2 藥物制備

加味腦泰方煎劑濃縮液的制備：該方由黃芪、益智仁、石菖蒲、田七、葛根、地龍、川芎組成。飲片由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供。購(gòu)回后置入容器內(nèi)加自來(lái)水(量為藥材量5倍)浸泡2 h,煮沸后再以微火煎煮30 min,過(guò)濾取汁得頭煎。藥渣再加3倍水煎煮20 min,過(guò)濾取汁得二煎,兩煎混合,于水浴上濃縮至100%濃度(每毫升藥液相當(dāng)于生藥1 g),置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

36只SD大鼠,健康清潔級(jí),3月齡,體重342.7±25.8 g(湖南省長(zhǎng)沙市東創(chuàng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部,室溫保持22℃,相對(duì)濕度55%,飼養(yǎng)于12-12 h光暗環(huán)境,給予標(biāo)準(zhǔn)飲食和自由飲水。所有SD大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組、模型組以及加味腦泰方組,每組12只。模型制備過(guò)程盡量減少大鼠的痛苦和應(yīng)激。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立 假手術(shù)組(Sham group)：模型動(dòng)物只做皮膚切口和組織分離處理,不進(jìn)行椎動(dòng)脈燒灼和頸總動(dòng)脈夾閉,術(shù)后大鼠保溫。模型組(Vehicle group)：模型的建立如Schmidt-Kastner等[8]人所描述：將大鼠行背側(cè)頸正中切口,逐層鈍性分離暴露雙側(cè)第一頸椎橫突翼小孔,用直徑0.5 mm的電凝針燒灼雙側(cè)翼小孔內(nèi)的椎動(dòng)脈,造成永久性閉塞。24 h后再將大鼠麻醉,行腹側(cè)頸正中切口,鈍性分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈,用微動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈5 min,共3次,每次間隔1 h。模型制備成功后不給任何干預(yù)。加味腦泰方組(SNTF group)：造模成功后開(kāi)始每天給藥5 g/kg,每日1次,連續(xù)灌胃給藥30天。

1.4.2 行為學(xué)檢測(cè) 3個(gè)組別在造模成功30天后進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)學(xué)習(xí)記憶。采用MT-200Morris水迷宮視頻跟蹤系統(tǒng)。水迷宮為圓形不銹鋼水池,水池直徑為120 cm,高60 cm。池壁上標(biāo)有四個(gè)不同符號(hào),將水池等分為4個(gè)象限,表示4個(gè)入水點(diǎn)。目標(biāo)象限的中央放置高為50 cm,直徑10 cm的圓形隱藏平臺(tái),平臺(tái)低于水面1 cm,水溫保持在(22±0.5)℃。預(yù)先在水池中注入清水,加入碳素墨水使池水變?yōu)椴煌该鞯暮谏噪[藏平臺(tái)并便于攝像。迷宮上方安置帶有顯示系統(tǒng)的攝像機(jī),計(jì)算機(jī)自動(dòng)跟蹤計(jì)時(shí)并同步記錄大鼠的游泳軌跡,Morris水迷宮數(shù)據(jù)采集和分析軟件記錄相關(guān)數(shù)據(jù)及圖象結(jié)果。整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間水池、光源等外部條件保持不變。

定位航行試驗(yàn)(place navigation)：檢測(cè)大鼠對(duì)水迷宮學(xué)習(xí)記憶的獲取能力。大鼠先適應(yīng)訓(xùn)練1天,剔除明顯異常者。大鼠連續(xù)接受5天訓(xùn)練,每天將大鼠面向池壁分別從4個(gè)入水點(diǎn)放入水中,每次實(shí)驗(yàn)以120 s為限,記錄動(dòng)物尋找并爬上平臺(tái)所需時(shí)間即逃避潛伏期(escape latency,EL),以爬上平臺(tái)所需時(shí)間作為學(xué)習(xí)和記憶成績(jī)。如在120 s內(nèi)未找到平臺(tái),計(jì)算機(jī)停止跟蹤,將未找到平臺(tái)的動(dòng)物由操作者將其引上平臺(tái)停留30 s。每天訓(xùn)練完成后,迅速將動(dòng)物用布擦干,置于加熱器旁。計(jì)算每天各組大鼠4次逃避潛伏期的平均值。

空間探索試驗(yàn)(spatial probe)：測(cè)量大鼠學(xué)會(huì)尋找平臺(tái)后,對(duì)平臺(tái)空間位置的記憶保持能力。在定位航行試驗(yàn)后(即水迷宮的第6天)撤去平臺(tái),然后任選一個(gè)固定象限作為入水點(diǎn)將大鼠面向池壁放入水中,記錄其120 s內(nèi)的游泳軌跡及穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)。

1.4.3 腦組織標(biāo)本的制備 服用加味腦泰方30天后,灌注取材3組SD大鼠。過(guò)量10%水合氯醛腹腔注射麻醉,待麻醉成功后,使用0.9%生理鹽水快速灌注,然后改用4%多聚甲醛溶液快速灌注,快速灌注一段時(shí)間后,然后慢灌。取出腦組織后固定過(guò)夜、沉糖(過(guò)30%糖2遍)和包埋。采用鄰切法,切片厚度為30 μm。

1.4.4 免疫組織化學(xué)染色 NR2A、NR2B免疫組織化學(xué)染色的實(shí)驗(yàn)步驟主要如下：當(dāng)天切好組織后,0.01 mol/L PBS+0.1%tritonX-100緩沖液(pH=7.3)漂洗3次,每次10 min;3%H2O2處理30 min,然后漂洗3次,方法如上;5%馬血清孵育2 h,然后加入一抗(NR2A、NR2B的抗體濃度依次為1:200、1:500),4℃冰箱過(guò)夜;第二天拿出組織復(fù)溫(26±0.5)℃,漂洗3次,加入二抗(1:400)室溫孵育2 h;ABC復(fù)合物：A液(卵白素)與B液(生物素)提前半小時(shí)配好,濃度比為1:400,室溫孵育2 h;DAB顯色：顯微鏡下控制組織顯色時(shí)間;梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹(shù)脂封片。

1.5 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果分析

3組腦片在同等曝光值和像素下使用Olympus E53顯微鏡拍照,應(yīng)用Image pro plus 6.0圖像分析軟件檢測(cè)3組相同部位等面積下細(xì)胞光密度值。以上所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,通過(guò)單因素方差分析(One-way ANOVA)統(tǒng)計(jì)不同組間差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Prism GraphPad5.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和處理。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn),P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 定位航行試驗(yàn)和空間探索試驗(yàn)

在定位航行試驗(yàn)中,以訓(xùn)練的最后一天計(jì)算成績(jī)(第5天)。假手術(shù)組、模型組、加味腦泰方組的逃避潛伏期(EL)分別為18.7±5.4、64.4±10.1、27.4±6.5 s,假手術(shù)組、加味腦泰方組與模型組比較,差異均有顯著性(t=11.28,t=9.13,表1)。水迷宮試驗(yàn)第6天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn),假手術(shù)組、模型組、加味腦泰方組的穿越平臺(tái)次數(shù)分別為9.1±1.30、5.6±0.80、8.1±0.98次,假手術(shù)組、加味腦泰方組與模型組比較,差異均有顯著性(t=6.43,t=4.63,表 1)。

表1 三組逃避潛伏期和穿越平臺(tái)次數(shù)的比較

2.2 CAl區(qū)NMDA受體NR2A、NR2B在3個(gè)組別的表達(dá)

NR2A+細(xì)胞在假手術(shù)組、模型組、加味腦泰方組分別為26.9±4.7、14.8±3.3、22.4±2.6個(gè);假手術(shù)組、加味腦泰方組分別與模型組比較,差異均有顯著性(t=6.16,t=3.88,P＜0.01)。NR2B+細(xì)胞在假手術(shù)組、模型組、加味腦泰方組分別為23.9±6.2、12.6±2.9、18.9±3.0 個(gè);假手術(shù)組、加味腦泰方組分別與模型組比較,差異均有顯著性(t=4.89,t=2.72,P＜0.01)。NR2A+細(xì)胞單位面積的平均光密度值假手術(shù)組、模型組、加味腦泰方組分別為0.45±0.06、0.30±0.03、0.41±0.04 mm2;假手術(shù)組、加味腦泰方組分別與模型組比較,差異均有顯著性(t=4.78,t=6.69,P＜0.01)。NR2B+細(xì)胞單位面積的平均光密度值假手術(shù)組、模型組、加味腦泰方組分別為 0.43±0.04、0.24±0.03、0.34±0.04 mm2;假手術(shù)組、加味腦泰方組與模型組比較,差異均有顯著性(t=9.15,t=4.81,P＜0.01),見(jiàn)表2。

3 討 論

血管性癡呆(VaD)好發(fā)于老年人中風(fēng)之后,是老年人常見(jiàn)的癡呆[9]。血管性癡呆相當(dāng)于祖國(guó)醫(yī)學(xué)“呆疾”、“文癡”、“善忘”等病癥,其病位在腦,屬本虛標(biāo)實(shí)之癥,以正氣虧虛為本,瘀痰濁毒為標(biāo),氣虛是其病理基礎(chǔ),病因以痰瘀多見(jiàn),氣血虧虛,痰瘀阻絡(luò)為其常見(jiàn)病機(jī)。加味腦泰方是在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下,以《醫(yī)林改錯(cuò)》中的“補(bǔ)陽(yáng)還五湯”為基礎(chǔ)方,結(jié)合臨床用藥經(jīng)驗(yàn)加減而成,由黃芪、益智仁、石菖蒲、田七、葛根、地龍、川芎組成。方中黃芪其力專、性走,周行全身,大補(bǔ)脾胃元?dú)?令氣旺則血活,血活則瘀除,益智仁有溫脾溫腎益智之功,兩藥為君以治其本;豁痰開(kāi)竅之石菖蒲,活血祛瘀之田七為臣藥;行氣活血的川芎,通經(jīng)活絡(luò)的地龍,升陽(yáng)、解肌的葛根為佐藥,諸味配合,共奏理氣活血、豁痰開(kāi)竅、益智醒神之效。前期研究應(yīng)用益氣活血、祛痰通絡(luò)的腦泰方治療中風(fēng)有良好的臨床效果[10]。本研究前期的實(shí)驗(yàn)也表明腦泰方能促進(jìn)大鼠缺血腦組織血管新生[11]。

表2 三組NR2A+,NR2B+以及它們平均光密度值的比較

海馬參與大腦的學(xué)習(xí)和記憶活動(dòng),是腦邊緣系統(tǒng)的一個(gè)重要組成部分,NR2A和NR2B是NMDA主要調(diào)節(jié)亞單位,NR2和NR1聚合形成功能性復(fù)合物形成功能性受體,表現(xiàn)出活性。NMDA受體構(gòu)成的變化引起NMDA受體活性改變從而導(dǎo)致學(xué)習(xí)與記憶改變。本研究發(fā)現(xiàn),與假手術(shù)組相比,NMDA受體調(diào)節(jié)亞型(NR2A和NR2B)在血管性癡呆大鼠海馬各區(qū)的表達(dá)水平都呈下降的趨勢(shì),學(xué)習(xí)記憶能力也下降(P＜0.0001)。這可能是加味腦泰方通過(guò)調(diào)控NR2A,NR2B在海馬的表達(dá)而提高血管性癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶,與Olivares D[12]、趙暉[13]以及李君等[14]人報(bào)道的結(jié)果相一致。關(guān)于加味腦泰方干預(yù)后VaD大鼠海馬組織NR2A,NR2B及mRNA表達(dá)情況以及長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)的變化將在以后的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步研究和闡述。

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